專利名稱：利用離體葉片高效繁殖生產(chǎn)非洲菊的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種非洲菊的高效繁殖和生產(chǎn)方法，屬于植物生物技術領域。
背景技術：
非洲菊是世界五大切花之一，也是云南省花卉產(chǎn)業(yè)中的主栽切花。近幾年我國
鮮切花產(chǎn)量和質量發(fā)展較為迅速，僅云南省每年就需要種苗接近iooo萬株，采用現(xiàn)
在組培生產(chǎn)中應用的不定芽增殖技術進行擴繁，其增殖率為2.3—5.0倍。另外目前 國內生產(chǎn)的非洲菊品種均是國外品種，僅靠從國外引種，不僅要支付昂貴的品種費， 而且均存在從花蕾誘導出芽周期長、效率低，不定芽的增殖率低，繁殖速度慢，生產(chǎn) 效率低等諸多問題。我國自有的非洲菊品種很少，到2008年1月份才有7個品種。目 前新品種的種苗非常緊缺。此外，利用無菌葉片再誘導的研究報道較少，徐士清等利 用無菌葉片先誘導愈傷組織，再從愈傷組織誘導產(chǎn)生不定芽，提高了增殖率，但是易 產(chǎn)生變異，不利于新品種種性的保存，陳玉華等用葉柄進行誘導，主要用于轉基因的 再生體系，以誘導愈傷組織為主，利用葉片直接誘導產(chǎn)生不定芽并直接應用于自主知 識產(chǎn)權品種的快速高效繁殖并規(guī)?；a(chǎn)還未見有文獻資料報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術在植物組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)中存在的增殖率低、擴繁周期長、生 產(chǎn)效率低，自主的品種和從國外引進的新品種不能快速推廣應用等現(xiàn)實問題，提供一 種高效快速繁殖和生產(chǎn)非洲菊組培苗的方法。
本發(fā)明提供的是一種結合和利用已有的花蕾誘導不定芽的技術，主要以離體葉 片為材料，通過培養(yǎng)基配方中激素配比的調整，提高葉片誘導率和繼代增殖率，從而 獲得了種苗質量和數(shù)量的綜合值最佳高效繁殖技術。
本發(fā)明通過下列技術方案完成 一種利用離體葉片高效繁殖生產(chǎn)非洲菊的方法， 包括外植體的選擇，無菌外植體體系的建立，不定芽的誘導及繼代增殖培養(yǎng)，其特征 在于還包括下列步驟
離體葉片誘導培養(yǎng)將經(jīng)過誘導及繼代增殖培養(yǎng)所得不定芽上的各個葉片切下
后，分別接種到下列葉片誘導培養(yǎng)基中MS + BA2. 0 4. 0mg/L +NAAO. 1 0. 2mg/L+ 瓊脂6 6.5g /L+糖30g /L， PH值5.8 6.0，并在培養(yǎng)溫度為26-28°C ，光照強度 為2000 2500Lx，光照時間為10-12小時/天的條件下，培養(yǎng)25 30天，得到叢狀 不定芽；
離體葉片上不定芽繼代增殖培養(yǎng)將叢狀不定芽分切成2-3株/叢，接種到下列 繼代增殖培養(yǎng)基中MS + BA0. 4 0. 6mg/L +NAA0. 1 0. 2mg/L +瓊脂6 6. 5g/L +糖 30g /L， PH值5.8 6.0，并在培養(yǎng)溫度為26-28°C ，光照強度為2000 2500Lx，光 照時間為10-12小時/天的條件下，培養(yǎng)20天，得到不定叢芽；
不定叢芽的生根培養(yǎng)將上述叢芽中苗高達到1.5cm以上的苗分切成單株后接 種于下列生根培養(yǎng)基中1/2MS+IBA0. 2 0.4 mg/L，瓊脂6 6. 5g /L+糖30g/L, PH 值5.8，并在培養(yǎng)溫度為26-28°C，光照強度為2000 2500Lx，光照時間為10-12小 時/天的條件下，培養(yǎng)至生根，即得可移栽的生根苗。
所述外植體的選擇為從種植的非洲菊中優(yōu)選生長健壯，性狀表現(xiàn)穩(wěn)定且無病 蟲害的優(yōu)良單株上采摘0. 5-1. 5cm的小花蕾。
所述無菌外植體體系的建立為剝去非洲菊小花蕾的外層萼片并保留少許花梗， 在加適量洗滌劑的溶液中充分洗滌并用清水漂洗后，在0. 15%的升汞溶液中消毒18 20分鐘，將萼片全部剝去后，再在2%的次氯酸鈉溶液中消毒10 12分鐘，用無菌水洗 2 3次后，待用。
所述不定芽的誘導培養(yǎng)為將消毒后的無菌小花蕾接種到下列花芽誘導培養(yǎng)基 中:MS + BA6. 0 10. Omg/L+NAA0. 2 0. 5mg/L+瓊脂6 6. 5g /L+糖30g /L, PH值 5.8 6.0;在培養(yǎng)溫度為26-28°C，光照強度為2000 2500Lx，光照時間為10-12小 時/天的條件下，培養(yǎng)40-80天，誘導分化出不定芽。
所述不定芽的繼代增殖培養(yǎng)為將誘導分化出來的不定芽分切下來，接種在下 列不定芽繼代增殖培養(yǎng)基中MS + BA0.4 0.6mg/L +NAA0. 1 0. 2mg/L +瓊脂6 6. 5g /L+糖30g /L， PH值5. 8 6. 0，并在培養(yǎng)溫度為26-28°C ，光照強度為2000 2500Lx，光照時間為10-12小時/天的條件下，培養(yǎng)18 20天后，得到叢狀不定芽。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有下列優(yōu)點和效果
1、非洲菊新品種的增殖階段，采用葉片誘導技術可以大幅度提高繁殖和生產(chǎn)效 率，縮短種苗生產(chǎn)周期，加速新品種的應用。通過對從葉片誘導到生根培養(yǎng)一個誘導 生產(chǎn)周期的統(tǒng)計，葉片在BA2. 0-4. 0+NAA0. 2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個月時誘導率和增
殖率分別為85. 4-85. 9%和34. 9倍。
2. 與目前生產(chǎn)上使用的芽增殖方法相比，采用無菌葉片誘導方法可以解決非洲 菊引進新品種和自主知識產(chǎn)權新品種組培快繁生產(chǎn)中繁殖速度慢的問題，在短期內顯 著提高組培快繁的增殖效率和生產(chǎn)效率。50天時的繁殖和生根效率分別為8. 4-10. 8 倍和129-100株/塊。
3. 無菌葉片具有不需消毒、材料多、可在組培快繁的任何階段進行的優(yōu)點。
4. 葉片誘導快速繁殖技術對于自育和引進新品種的推廣、脫毒原種快繁、生產(chǎn) 品種的復壯都有實際應用價值。


圖1為不同BA濃度對葉片誘導不定芽發(fā)生率和玻璃化率的影響關系圖； 圖2為葉片誘導芽繼代增殖率圖3為不同處理對非洲菊增殖和生產(chǎn)效率的影響關系圖。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明做進一步描述。 實施例1
1、 外植體的選擇從種植的非洲菊(該非洲菊品種選自獲得中國非洲菊新品種
權，其品種權號為CNA20030516.6的品種)中優(yōu)選生長健壯，性狀表現(xiàn)穩(wěn)定且無病蟲 害的優(yōu)良單株上采摘0. 5-1. 5cm的小花蕾，要求花蕾未露心或萼片未展開；
2、 無菌外植體體系的建立剝去上述非洲菊小花蕾的外層萼片并保留少許花梗， 在加適量洗滌劑的溶液中洗滌并用清水充分漂洗后，在0.15%的升汞溶液中消毒18 分鐘，將萼片全部剝去后，再在2.0%的次氯酸鈉溶液中消毒12分鐘，用無菌水洗2次 后，待用，消毒時要充分搖動瓶子，使消毒材料充分與消毒液接觸；
3、 不定芽的誘導培養(yǎng)將2步驟的消毒無菌小花蕾接種到下列花芽誘導培養(yǎng)基 中MS + BA6. 0mg/L+NAA0.2mg/L+瓊脂6g /L+糖30g /L， m值5.8;在培養(yǎng)溫度 為26。C，光照強度為2000Lx，光照時間為10小時/天的條件下，培養(yǎng)40天，從小花 蕾上直接分化出不定芽，出芽率在20%;
4、 不定芽的繼代增殖培養(yǎng)將上述誘導的不定芽分切下來，有的花蕾產(chǎn)生單個 不定芽，而有的則產(chǎn)生叢狀不定芽，對于叢狀不定芽，切成帶l-3個小芽的小塊，轉 接在下列不定芽繼代增殖培養(yǎng)基中MS + BA0.4mg/L +NAA0. lmg/L +瓊脂6g /L +糖 30g/L， PH值5.8，并在培養(yǎng)溫度為26。C，光照強度為2000Lx，光照時間為10小時
/天的條件下，培養(yǎng)20天后，多數(shù)不定芽長高度達到1. 5cm以上，同時還有部分新產(chǎn)生 的較小不定芽，形成叢狀不定芽；
5、 離體葉片誘導培養(yǎng)將4步驟的叢狀不定芽上的各個葉片帶葉柄基部的切下 后，分別接種到下列葉片誘導培養(yǎng)基中a) MS+BA1. 0+NAA0. 2; b) MS+BA2. 0+NAA0. 2; c) MS+BA4. 0+NAA0.2; d) MS+BA8. 0+NAA0. 2; e)對照MS+BAO. 6+NAA0. 2，以上各配方 中瓊脂6g/L，糖30g/L， PH值5.8，每瓶接種12片，接種時插入深度以0. 5cm左右 為宜，并在培養(yǎng)溫度為26t:，光照強度為2000Lx，光照時間為10小時/天的條件下 進行培養(yǎng)，培養(yǎng)14天后葉片開始產(chǎn)生不定芽，30天時葉片誘導率達85%以上，芽叢 數(shù)大于5個的葉片達到58. 9%以上；
6、 離體葉片上不定芽的繼代增殖培養(yǎng)將上述叢狀不定芽分切成帶2-3個小芽 的塊，接種到下列繼代增殖培養(yǎng)基中MS + BA0.6mg/L +NAA0.2mg/L+瓊脂6. 5g /L 屮糖30g/L， PH值5.8，并在培養(yǎng)溫度為28t:，光照強度為2500Lx，光照時間為12 小時/天的條件下，培養(yǎng)至多數(shù)苗高達到生根標準即1.5cm以上，定芽的增殖率達到 34.9倍；
7、 不定芽的生根培養(yǎng)將苗分切成單株后接種于下列生根培養(yǎng)基中 1/2MS+IBA0. 4 mg/L,瓊脂6. 5g /L +糖30g/L, PH值5. 8，并在培養(yǎng)溫度為28°C ，光 照強度為2500Lx，光照時間為12小時/天的條件下，培養(yǎng)至生根，20天時，生根率 達到100%并可以進行出瓶移栽；
8、 達不到生根標準的小叢芽視具體情況，重復步驟5-7或者重復步驟7或者重 復步驟7-8，以達到大幅度提高擴繁速度，在短期內大量生產(chǎn)新品種種苗的效果，同 時通過在葉片誘導時采用不同的BA濃度也可以達到調整誘導率、增殖率和生產(chǎn)效率 的目的。
實施例2
1、 外植體的選擇從種植的非洲菊(該非洲菊品種選自獲得中國非洲菊新品種 權，其品種權號為CNA20030516.6的品種)中優(yōu)選生長健壯，性狀表現(xiàn)穩(wěn)定且無病蟲 害的優(yōu)良單株上采摘0.5-1.5cm的小花蕾，要求花蕾未露心或萼片未展開；
2、 無菌外植體體系的建立剝去上述非洲菊小花蕾的外層萼片并保留少許花梗， 在加適量洗滌劑的溶液中洗滌并用清水充分漂洗后，在0. 15%的升滎溶液中消毒20 分鐘，將萼片全部剝去后，再在2. 0%的次氯酸鈉溶液中消毒10分鐘，用無菌水洗3次 后，待用，消毒時要充分搖動瓶子，使消毒材料充分與消毒液接觸；
3、 不定芽的誘導培養(yǎng)將2步驟的消毒無菌小花蕾接種到下列花芽誘導培養(yǎng)基
中:MS + BA10. 0mg/L+NAA0. 5mg/L +瓊脂6. 5g /L+糖30g /L, PH值6. 0;在培養(yǎng)溫 度為28'C，光照強度為2500Lx，光照時間為12小時/天的條件下，培養(yǎng)-80天,從小 花蕾上直接分化出不定芽，出芽率在30%以上；
4、 不定芽的繼代增殖培養(yǎng)將上述誘導的不定芽分切下來，有的花蕾產(chǎn)生單個 不定芽，而有的則產(chǎn)生叢狀不定芽，對于叢狀不定芽，切成帶l-3個小芽的小塊，轉 接在下列不定芽繼代增殖培養(yǎng)基中MS + BA0.6mg/L +NAA0. 2mg/L +瓊脂6. 5g /L+ 糖30g /L， ra值6.0，并在培養(yǎng)溫度為28°C，光照強度為2500Lx，光照時間為12 小時/天的條件下，培養(yǎng)20天后，形成叢狀不定芽；
5、 離體葉片誘導培養(yǎng)將4步驟的叢狀不定芽上的各個葉片帶葉柄基部的切下 后，分別接種到下列葉片誘導培養(yǎng)基中MS+BA4. 0+NAA0. 2+瓊脂6g /L+糖30g /L， PH值5.8，每瓶接種12片，接種時插入深度以0.5cm左右為宜，并在培養(yǎng)溫度為26 'C，光照強度為2000Lx，光照時間為10小時/天的條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)14天后葉 片開始產(chǎn)生不定芽，30天時葉片誘導率達85. 9%，芽叢數(shù)大于5個的葉片達到70. 1%;
6、 離體葉片上不定芽的繼代增殖培養(yǎng)將上述叢狀不定芽分切成帶2-3個小芽 的塊，接種到下列繼代增殖培養(yǎng)基中MS + BA0.4mg/L +NAA0. lmg/L +瓊脂6g /L+ 糖30g /L, ra值5.8，并在培養(yǎng)溫度為26°C，光照強度為2000Lx，光照時間為10 小時/天的條件下，培養(yǎng)20天后，不定芽的增殖率達到34.8倍
7、 不定芽的生根培養(yǎng)將苗分切成單株后接種于下列生根培養(yǎng)基中 1/2MS+IBA0. 2 mg/L，瓊脂6g /L+糖30g/L， PH值5. 8，并在培養(yǎng)溫度為26°C ，光照 強度為2000Lx，光照時間為10小時/天的條件下，培養(yǎng)至生根，15天時，生根率達 到100%并可以進行出瓶移栽；
8、 達不到生根標準的小叢芽視具體情況，重復步驟5-7或者重復步驟7或者重 復步驟7-8，以達到大幅度提高擴繁速度，在短期內大量生產(chǎn)新品種種苗的效果，同 時通過在葉片誘導時采用不同的BA濃度也可以達到調整誘導率、增殖率和生產(chǎn)效率 的目的。
試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析對實施例1每一步培養(yǎng)的觀察記錄數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分
析
葉片誘導各種百分率(％)=各種表現(xiàn)葉片數(shù)/試驗葉片數(shù) 第一次繼代增殖率(倍)=第一次繼代芽增殖瓶數(shù)/原始材料瓶數(shù)
生產(chǎn)效率(株/塊)=生根苗數(shù)/原始材料塊數(shù) 繁殖效率(倍)=繁殖瓶數(shù)/原始材料瓶數(shù) 試驗結果如圖1、圖2和圖3。
從圖一看出在BA濃度為1.0-8. 0m g /1時，葉片誘導不定芽的頻率與BA濃
度關系不大，且在較低的BA濃度時就可以誘導葉片產(chǎn)生不定芽。不定芽數(shù)大于5的
葉片數(shù)及玻璃化發(fā)生頻率隨BA濃度的增加而提高。在BA1.0時，不定芽生長正常，
在BA8.0時不定芽密集叢生且矮小不可數(shù)，玻璃化較嚴重。綜合芽數(shù)、長勢、玻璃化
進行評價，在葉片誘導在BA2.0-4.0時效果較好。
從圖二看出，用BA1. 0-8.0中葉片誘導的不定芽再進行繼代的培養(yǎng)，增殖率均
明顯高于對照處理，芽增殖的增殖率只有6.75倍，而其葉片誘導各處理的增殖率分
別為24.57， 34.93， 34. 79和36. 67倍，較對照高17. 82—29. 92倍，可見用葉片誘
導的方法可以顯著提高組培苗的繼代增殖率，是一種高效繁殖非洲菊種苗的方法。隨
BA濃度的增加，葉片誘導的不定芽叢生矮化不可分株。
從圖三可以看出，葉片誘導和芽增殖50天后，利用葉片誘導的每塊原始材料的
增殖率和生產(chǎn)效率均明顯高于對照，說明通過葉片誘導是一種快速高效繁殖和生產(chǎn)非
洲菊種苗的有效方法。不同處理間增殖和生產(chǎn)效率差異明顯，生產(chǎn)效率從高到低依次
為處理(b) (c) (a) (d) (e)，繁殖效率從高到低依次為處理(d) (c) (b) (。 a)
(e)，處理(b)的生產(chǎn)效率最高，較對照高6.5倍，處理(d)的增殖效率最高，較
對照高17.0倍。
綜上所述與目前生產(chǎn)上使用的芽增殖方法相比，采用無菌葉片誘導方法可以 在短期內顯著提高組培快繁的增殖率和生產(chǎn)效率，以BA2. 0時生產(chǎn)效率最高，而BA8. 0 時的增殖效率最高，結合苗的長勢、質量和效率進行綜合評價，在生產(chǎn)上可采用 MS+BA2. 0-4. 0+NAAO. 2進行葉片誘導，在MS+ BAO. 6+NAA0. 2的培養(yǎng)基中進行繼代增殖。
權利要求
1、一種利用離體葉片高效繁殖生產(chǎn)非洲菊的方法，包括外植體的選擇，無菌外植體體系的建立，不定芽的誘導及繼代增殖培養(yǎng)，其特征在于還包括下列步驟離體葉片誘導培養(yǎng)將經(jīng)過誘導及繼代增殖培養(yǎng)所得不定芽上的各個葉片切下后，分別接種到下列葉片誘導培養(yǎng)基中MS+BA2.0～4.0mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+瓊脂6～6.5g/L+糖30g/L，PH值5.8～6.0，并在培養(yǎng)溫度為26-28℃，光照強度為2000～2500Lx，光照時間為10-12小時/天的條件下，培養(yǎng)25～30天，得到叢狀不定芽；離體葉片上不定芽繼代增殖培養(yǎng)將叢狀不定芽分切成2-3株/叢，接種到下列繼代增殖培養(yǎng)基中MS+BA0.4～0.6mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+瓊脂6～6.5g/L+糖30g/L，PH值5.8～6.0，并在培養(yǎng)溫度為26-28℃，光照強度為2000～2500Lx，光照時間為10-12小時/天的條件下，培養(yǎng)18～20天，得到不定叢芽；不定叢芽的生根培養(yǎng)將上述叢芽中苗高達到1.5cm以上苗分切成單株后接種于下列生根培養(yǎng)基中1/2MS+IBA0.2～0.4 mg/L，瓊脂6～6.5g/L+糖30g/L，PH值5.8，并在培養(yǎng)溫度為26-28℃，光照強度為2000～2500Lx，光照時間為10-12小時/天的條件下，培養(yǎng)至生根，即得可移栽的生根苗。
2、 根據(jù)權利要求1所述的利用離體葉片高效繁殖生產(chǎn)非洲菊的方法，其特征在于 所述外植體的選擇為從種植的非洲菊中優(yōu)選生長健壯，性狀表現(xiàn)穩(wěn)定且無病蟲害的 優(yōu)良單株上采摘0. 5-1. 5cm的小花蕾。
3、 根據(jù)權利要求l所述的利用離體葉片高效繁殖生產(chǎn)非洲菊的方法，其特征在于 所述無菌外植體體系的建立為剝去非洲菊小花蕾的外層萼片并保留少許花梗，在加 適量洗滌劑的溶液中洗滌并用清水充分漂洗后，在0. 15%的升汞溶液中消毒18 20 分鐘，將萼片全部剝去后，再在2°/。的次氯酸鈉溶液中消毒10 12分鐘，用無菌水洗2 3次后。
4、 根據(jù)權利要求1所述的利用離體葉片高效繁殖生產(chǎn)非洲菊的方法，其特征在于 所述不定芽的誘導培養(yǎng)為將消毒后的無菌小花蕾接種到下列花芽誘導培養(yǎng)基中MS + BA6. 0 10. Omg/L+NAA0, 2 0. 5mg/L +瓊脂6 6. 5g /L+糖30g /L, PH值5. 8 6.0;在培養(yǎng)溫度為26-28°C，光照強度為2000 2500Lx，光照時間為10-12小時/天 的條件下，培養(yǎng)40-80天，誘導分化出不定芽。
5、根據(jù)權利要求1所述的利用離體葉片高效繁殖生產(chǎn)非洲菊的方法，其特征在于 所述不定芽的繼代增殖培養(yǎng)為將誘導分化出來的不定芽分切下來，接種在下列不定芽繼代增殖培養(yǎng)基中MS + BA0. 4 0. 6mg/L +NAA0. 1 0. 2mg/L +瓊脂6 6. 5g /L +糖30g /L， PH值5. 8 6. 0,并在培養(yǎng)溫度為26_28°C ，光照強度為2000 2500Lx， 光照時間為10-12小時/天的條件下，培養(yǎng)20天后，得到叢狀不定芽。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用離體葉片高效繁殖生產(chǎn)非洲菊的方法，包括外植體的選擇，無菌外植體體系的建立，不定芽的誘導及繼代增殖培養(yǎng)，特別是還包括離體葉片誘導培養(yǎng)，離體葉片上不定芽的繼代增殖培養(yǎng)，不定芽的生根培養(yǎng)。大幅度提高了繁殖和生產(chǎn)效率，縮短種苗生產(chǎn)周期，加速新品種的應用，通過統(tǒng)計，葉片在培養(yǎng)1個月時誘導率和增殖率分別為85.4-85.9％和34.9倍，本發(fā)明解決了現(xiàn)有非洲菊在組培快繁生產(chǎn)中存在的繁殖速度慢、種苗質量差等問題，在短期內顯著提高組培快繁的增殖效率和生產(chǎn)效率，50天的繁殖和生根效率分別為8.4-10.8倍和129-100株/塊，且無菌葉片具有不需消毒、材料多、可在組培快繁的任何階段進行，對于自育和引進新品種的推廣、脫毒原種快繁、生產(chǎn)品種的復壯都有實際應用價值。
文檔編號C12N5/04GK101361456SQ200810058729
公開日2009年2月11日 申請日期2008年7月25日 優(yōu)先權日2008年7月25日
發(fā)明者吳麗芳, 吳學尉, 崔光芬, 張藝萍, 李紳崇, 楊春梅, 王繼華, 蔣亞蓮 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所