多種用于dna操作的轉(zhuǎn)座酶適體的制作方法
【專利說明】多種用于DNA操作的轉(zhuǎn)座酶適體
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年11月7日遞交的美國臨時專利申請No. 61/901,037和2014年6月 18日遞交的美國臨時專利申請No. 62/013，833的優(yōu)先權(quán)。所述申請的內(nèi)容通過引用整體并 入本文中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及轉(zhuǎn)座酶適體及其用途，包括在制備DNA分子、體外擴增、對核酸測序和 篩選DNA文庫中感興趣的序列W及將核酸遞送到活細胞中的用途。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 轉(zhuǎn)座酶是結(jié)合到轉(zhuǎn)座子的末端并通過剪貼(cut and paste)機制或復(fù)制型轉(zhuǎn)座機 制催化轉(zhuǎn)座子移動到基因組的另一部分的一類酶。運些酶已被用在制備用于下一代測序 (NGS)、誘變、核酸遞送(基因療法）的樣品和產(chǎn)生用于再生醫(yī)學(xué)的多能細胞中。在運些應(yīng)用 中，轉(zhuǎn)座酶不是作為分離蛋白起作用，而是作為與特定DNA序列形成復(fù)合體的核蛋白起作 用。運類序列通常被稱為轉(zhuǎn)座酶識別序列、轉(zhuǎn)座子末端、反向重復(fù)右側(cè)（IRR)、反向重復(fù)左側(cè) (IRL)或適體(adapter)。
[0006] 當(dāng)用于NGS文庫制備時，轉(zhuǎn)座酶-適體復(fù)合體被用于使基因組DNA片段化，運是實現(xiàn) 高通量測序的關(guān)鍵步驟。相較于其它片段化技術(shù)，例如聲處理和DNA酶處理，基于轉(zhuǎn)座酶的 片段化允許節(jié)省許多倍的時間、勞動和設(shè)備經(jīng)費，考慮到樣品制備構(gòu)成全部測序成本的約 50%。然而，通過目前可用的轉(zhuǎn)座酶-適體復(fù)合體的DNA片段化不太隨機。換言之，它偏向于 在某些區(qū)域產(chǎn)生較多讀出而在其它區(qū)域產(chǎn)生較少讀出，運通常導(dǎo)致高1-3%的重復(fù)率和更 多的測序工作來實現(xiàn)相同的整體覆蓋度。另外，常規(guī)基于轉(zhuǎn)座酶的NGS樣品制備方法需要去 除適體，運是耗時的且不適合處理含有很少量DNA的樣品。
[0007] 因此，對具有合適活性和用于提高隨機性和降低重復(fù)率的不同性質(zhì)的不同轉(zhuǎn)座酶 適體的需求未被滿足。對在含有很少量DNA的樣品的轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)中更有效和/或適合直接處 理的方法的需求未被滿足。
[000引發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明通過提供多種轉(zhuǎn)座酶適體而解決了上述未被滿足的需求。
[0010] 在一個方面，本發(fā)明提供了分離的合成核酸適體，其包括含有第一序列的第一鏈 和含有第二序列的第二鏈。第一序列和第二序列彼此完全互補或者基本互補，且適體被轉(zhuǎn) 座酶識別。
[0011] 分離的合成核酸適體包括相較于轉(zhuǎn)座酶的天然識別序列具有一個或多個修飾的 轉(zhuǎn)座酶識別序列。例如，第一序列是轉(zhuǎn)座酶的親本、天然或已知識別序列的修飾版本，或者 第二序列是親本適體序列的互補物的修飾版本，或者二者均是運樣的修飾版本。
[0012] 相較于轉(zhuǎn)座酶的天然識別序列，分離的合成核酸適體可具有一個或多個W下修 飾：（a) -個或多個在第一序列(在第一鏈上）的5'末端(第1位置）、或者在第二序列(在第二 鏈上）的3'末端、或者在二者上的修飾；（b)-個或多個在第一鏈或第一序列中的修飾核巧 酸，其中所述修飾核巧酸阻礙所述第一鏈的引物延伸;和(C) 一個或多個在第二鏈或第二序 列中的硫代憐酸醋鍵。
[0013] 在一個實施方式中，分離的合成核酸適體具有一個或多個相較于轉(zhuǎn)座酶的天然或 已知識別序列（親本適體序列或親本識別序列）在第一序列的5'末端(第1位置）、或者相較 于天然識別序列的互補物在第二序列的3'末端、或者在兩個所述末端的修飾。例如，相較于 親本識別序列，第一序列可在其5 '末端具有不同的核巧酸，至少一個額外的核巧酸或者缺 少一個核巧酸。類似地，相較于所述互補物，第二序列也可在其3 '末端具有至少一個不同的 核巧酸，額外核巧酸或者缺少一個核巧酸。圖3B、4B和5C中顯示了運些適體的實例。
[0014] 在另一個實施方式中，上文提到的部分(b)中的一個或多個修飾核巧酸選自由脫 氧尿巧、無堿基位點、2'OMe修飾的核糖核酸(RNA)和反向胸巧組成的組。反向胸巧優(yōu)選地在 第一鏈的3'末端。在一些實例中，一個或多個修飾核巧酸的前面(即，在修飾核巧酸的5'）是 硫代憐酸醋鍵或間隔子。第二鏈可W不含運樣的一個或多個修飾核巧酸。
[0015] 在另一個實施方式中，至少一個硫代憐酸醋鍵在第二鏈或第二序列的3'最后一個 核巧酸和3'倒數(shù)第二個核巧酸之間。第二鏈或第二序列可含有約1-18(例如，2-15、3-14或 4-10,例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18)個硫代憐酸醋鍵。第一鏈 或第一序列可W不含硫代憐酸醋鍵。
[0016] 在上文提到的適體中，第一鏈和第二鏈可形成雙鏈體。雙鏈體的長度可W為15-3化P。在運種情況下，雙鏈體可W在第一鏈或第二鏈的3'或5'末端(例如，在第二鏈的3'末 端或者第一鏈的5'末端)具有平末端或交錯末端。在適體中，第一或第二序列中的一個或多 個修飾可導(dǎo)致雙鏈體中一個或多個未配對的核巧酸，例如未配對的堿基或懸掛(例如，在第 一或第二鏈的一個或多個末端）。
[0017] 優(yōu)選地，第一或第二序列(或鏈)的長度為17-80、18-60或19-50個核巧酸，例如17、 18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60或80個核巧酸。在一些更優(yōu)選的實施方式中，第一 或第二序列的長度為19-21個核巧酸，即長度為19或20或21個核巧酸。
[0018] 在一些優(yōu)選的實施方式中，親本、天然或已知識別序列在第1位置具有C。運類親本 識別序列的實例包括圖1中所示的那些。在一個實施方式中，本發(fā)明的適體在第二序列（即， 圖3-5中所示的底鏈)的第1位置上具有G到A的替換(例如，W下的實施例2中所述和圖5中所 示的適體6、8、13、17和27)。在另一個實施方式中，適體既在第二序列的第1位置上具有G到A 的替換，又在相對鏈上（即，第一序列中的第1位置)具有錯配堿基(例如，在該位置上具有錯 配的C的適體8和27)。在另一個實施方式中，適體在第二序列的第1位置上具有天然的G，但 在相對鏈上具有錯配堿基(例如，在該位置上分別具有錯配的T和G的適體7和12)。所有運些 適體相較于親本適體賦予提高的活性。
[0019] 在另一實施方式中，適體可在第一序列的第1位置C的5'具有額外的堿基或者在適 體序列的第1位置G的3'具有額外的堿基(例如，適體5、9和10)。運些適體的重復(fù)率低于或者 比得上親本適體的重復(fù)率。
[0020] 在一些實施方式中，第一或第二鏈可包含至少一個修飾核巧酸，所述核巧酸選自 由2-氨基嚷嶺、2,6-二氨基嚷嶺、5-漠加、脫氧尿巧、反向dT、反向雙脫氧-T、雙脫氧-C、5-甲 基dC、脫氧肌巧、通用堿基包括5-硝基嗎I噪、2'-0-甲基RNA堿基、異-dC、異-dG、核糖核巧酸、 嗎口林代、蛋白核巧酸類似物、乙醇酸核巧酸類似物(glycoic nucleotide analogue)、鎖核 巧酸類似物、蘇糖核巧酸類似物、鏈終止核巧酸類似物、硫尿巧、假尿巧、二氨尿巧、辮巧和 丫巧組成的組。在另一些實施方式中，第一或第二鏈中至少一個核巧酸可W被憐酸化或者 為核糖核巧酸，或者具有修飾糖、非天然的鍵、無堿基位點、雙脫氧堿基、5-甲基堿基或間隔 子。在一些實施方式中，第二鏈還可包含在第二序列的5'的標(biāo)簽序列。類似地，第一鏈還可 包含在第一序列的3'例如如圖1中所示超過第19位的標(biāo)簽序列。第一和第二序列的標(biāo)簽可 W基于它們的用途不彼此互補，如下文所述。對于適體，轉(zhuǎn)座酶可W是"切割和粘貼"轉(zhuǎn)座 酶，例如Vibrio化rveyi轉(zhuǎn)座酶或超活性化5轉(zhuǎn)座酶。
[0021] 本發(fā)明還提供了分離的合成核酸適體的集合，其具有上文提到的（i)第一分離的 合成核酸適體和（ii)第二分離的合成核酸適體，其中第一適體和/或第二適體相較于它們 各自的親本識別序列或其互補物具有至少一個不同的修飾。例如，兩個適體中至少一個是 上文所述的分離的合成核酸適體。兩個適體可被相同的轉(zhuǎn)座酶或者被兩種不同的轉(zhuǎn)座酶識 別。
[0022] 集合的實例包括W下適體的任意組合：圖5C中所示的適體4-10、12-23和27-28,圖 13中所示的適體3U2、8U2、3U4、8U4、3 i 0*肌和8 i 0*肌，適體E8 (圖18)和圖19中所示的那些適 體。
[0023] 第一序列和第二序列可W分別包括W下序列、基本上由W下序列組成或者由W下 序列組成：56910^3:73和74、56910^3:75和76、56910^3:28和36、56910^3:28 和22、SEQ ID NOs:2和36、SEQ ID NOs:2和74、SEQ ID NOs:2和76、SEQ ID NOs:26和22、SEQ 10^3:26和36、56910^3:26和39、56910^3:26和41、56910^3:24和22、56910 NOs:24和36、SEQ ID NOs:24和39、SEQ ID NOs:24和41、SEQ ID NOs:28和39、SEQ ID NOs: 28和41、SEQ ID NOs: 2和39、SEQ ID NOs: 2和41、SEQ ID NOs: 75和36或者沈Q ID NOs: 73和 36。另一些實例包括圖11中所示的適體1和5-10的集合，適體5-10的集合，適體6、8、13、17和 27的集合，適體8和27的集合，適體7和12的集合，W及適體5和9的集合。額外的實例包括適 體5-10、12、13、17和27的任意組合。另一些實例包括圖13中所示的適體對2-4,和圖19中所 示的那些的任意組合。
[0024] 還提供了試劑盒，所述試劑盒具有上文提到的第一適體和第一轉(zhuǎn)座酶，所述第一 適體具有被轉(zhuǎn)座酶識別的序列。試劑盒還可包括至少一種選自緩沖劑、聚合酶、內(nèi)切核酸酶 和限制酶的組分，和由祀DNA制造 DNA文庫的說明。在一些實施方式中，適體的第二鏈還包含 在第二序列的5'的標(biāo)簽序列且試劑盒還包括與標(biāo)簽序列互補的引物。在另一些實施方式 中，試劑盒還可包括不同于第一適體但可被第一轉(zhuǎn)座酶或不同的轉(zhuǎn)座酶識別的第二適體。
[0025] 在另一方面，本發(fā)明提供了使祀DNA分子片段化的體外方法。該方法包括W下步 驟:得到轉(zhuǎn)座酶;得到可被所述轉(zhuǎn)座酶識別的上述分離的合成核酸適體;混合適體、轉(zhuǎn)座酶 和祀DNA分子;在用于進行轉(zhuǎn)座反應(yīng)的條件下解育適體、轉(zhuǎn)座酶和祀DNA，其中適體和轉(zhuǎn)座酶 與祀DNA分子相聯(lián)合并通過轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的切割來切割祀DNA分子從而提供經(jīng)切割的DNA產(chǎn) 物。
[0026] 在另一些方面，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體，其包括具有至少一種轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座 酶組分和本發(fā)明的適體。為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體，可W將一種或多種轉(zhuǎn)座酶與一種或多種 本發(fā)明的適體一起解育，所述適體含有轉(zhuǎn)座酶的識別序列，W及允許足夠的時間使適體與 轉(zhuǎn)座酶結(jié)合，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體。運種轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體可與固體基質(zhì)結(jié)合。在運種情況 下，可W使用含有特異性結(jié)合對的連接子組分。所述特異性結(jié)合對的一個成員可W與適體 結(jié)合且另一個成員與固體基質(zhì)結(jié)合。在運樣的與固體基質(zhì)結(jié)合的轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體中，每個復(fù) 合體中至少一個適體與特異性結(jié)合對的成員結(jié)合。
[0027] 在另一方面，本發(fā)明提供了使祀DNA分子片段化的體外方法。該方法包括:使祀DNA 分子與上文提到的轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體接觸W形成反應(yīng)混合物，和在用于進行轉(zhuǎn)座反應(yīng)的條件下 解育反應(yīng)混合物。祀DNA分子可W獲自由少數(shù)個細胞(例如，1-10個細胞、1-3個細胞或單個 細胞)或染色體組成的樣品。
[0028] 本發(fā)明還提供制備用于祀DNA分子的測序或微陣列分析的試驗樣品的方法。該方 法包括:使祀DNA分子與復(fù)合體接觸W形成反應(yīng)混合物，所述復(fù)合體具有上述分離的合成核 酸適體和與適體結(jié)合的轉(zhuǎn)座酶;在用于進行轉(zhuǎn)座反應(yīng)的條件下解育反應(yīng)混合物W產(chǎn)生經(jīng)切 割的DNA產(chǎn)物；和擴增經(jīng)切割的DNA產(chǎn)物。如本文所公開的，由于所述適體的優(yōu)越性，無需在 擴增步驟之前去除適體。換言之，擴增步驟在沒有在之前去除適體的情況下進行。
[0029] 還提供了用于微陣列的DNA樣品制備的方法。該方法包括:使樣品DNA分子與復(fù)合 體接觸W形成反應(yīng)混合物，所述復(fù)合體具有本文所公開的分離的合成核酸適體和與適體結(jié) 合的轉(zhuǎn)座酶;在用于進行轉(zhuǎn)座反應(yīng)的條件下解育反應(yīng)混合物W產(chǎn)生樣品DNA分子的DNA片 段。所述適體具有寡核巧酸標(biāo)簽且DNA片段的兩端都用寡核巧酸標(biāo)簽加上標(biāo)簽。該方法還可 包括:使用與寡核巧酸標(biāo)簽互補的引物擴增DNA片段。標(biāo)簽可被用作與標(biāo)簽互補的引物的著 陸（landing)位點?？蒞在使用包含至少一種用巧光團標(biāo)記的dNTP的dNTP混合物的聚合酶 反應(yīng)中延伸一種或多種引物。
[0030] 說明書和W下附圖中陳述了本發(fā)明的一個或多個實施方式的細節(jié)。本發(fā)明的其它 特征、目標(biāo)和優(yōu)點從說明書、附圖和權(quán)利要求中顯而易見。 附圖簡介
[0031] 圖1是轉(zhuǎn)座酶的天然TOL和IRR，W及經(jīng)修飾的適體(僅顯示一條鏈)的列表，其中適 體中的第一個位置(C)是保守的且不同顏色闡釋了不同適體的相似和不同。每個序列之后 的括號內(nèi)的數(shù)字指的是序列的SEQ ID NO。
[0032] 圖2是運樣的圖，其顯示了具有D呢基序的化5轉(zhuǎn)座酶的催化位點和適體。保守的C (如圖1中所示，在第1位置)和相對適體鏈上保守的G帶下劃線。
[0033] 圖3A和B是運樣的列表，其圖示了（A)V化bar轉(zhuǎn)座酶的親本適體雙鏈體，其包括第 一和第二適體序列和(B)多個經(jīng)修飾的適體，其中頂鏈和底鏈分別對應(yīng)于上文提到的第一 序列和第二序列。每個序列之后的括號內(nèi)的數(shù)字指的是序列的SEQ ID NO。
[0034] 圖4A和B是運樣的列表，其圖示了 (A)"超活性"Tn5轉(zhuǎn)座酶的親本適體和(B)多個經(jīng) 修飾的適體，其中頂鏈和底鏈分別對應(yīng)于上文提到的第一序列和第二序列。每個序列之后 的括號內(nèi)的數(shù)字指的是序列的SEQ ID NO。
[0035] 圖5A-C是運樣的圖，其展示了基于核巧酸的替換和添加的Vi化ar轉(zhuǎn)座酶的適體的 實例：（A)親本適體，（B)基于在第1位置的改變/添加的適體編號，和(C)衍生適體的實例。每 個序列之后的括號內(nèi)的數(shù)字指的是序列的SEQ ID NO。
[0036] 圖6A-C是運樣的圖，其顯示了 ：在高DNA輸入下，用于的NGS的樣品制備中多種適體 的活性的評估。在2%的瓊脂糖凝膠中分離使用帶有不同適體的Vi化ar轉(zhuǎn)座酶產(chǎn)生的NGS樣 品并用漠化乙錠染色。
[0037]圖7是運樣的圖，其顯示了 ：在高DNA輸入下，適體8相較于其它衍生適體和親本適 體1的更高活性的確認。在2%的瓊脂糖凝膠中分離使用帶有不同適體的V化bar轉(zhuǎn)座酶產(chǎn)生 的NGS樣品并用漠化乙錠染色。
[003引圖8A-D是運樣的一組圖，其顯示了：在中等(A和B)和低(C和D)DNA輸入下，用于NGS 的樣品制備中多種適體的活性的評估。在2%的瓊脂糖凝膠中分離使用帶有不同適體的 Vi化ar轉(zhuǎn)座酶產(chǎn)生的NGS樣品并用漠化乙錠染色。
[0039] 圖9是運樣的圖，其顯示了：在不同的轉(zhuǎn)座酶濃度（A-5ug/ml，B-1.7ug/ml，C-0.56ug/ml)下，適體8相較于親本適體I賦予轉(zhuǎn)座酶更高的活性的確認。0-沒有轉(zhuǎn)座酶的陰 性對照。在2%的瓊脂糖凝膠中分離使用帶有不同適體的Vi化ar轉(zhuǎn)座酶產(chǎn)生的NGS樣品并用 漠化乙錠染色。
[0040] 圖10是運樣的圖，其顯示了 ：在低DNA輸入下，適體8相較于親本適體IW及如果不 添加DNA的無背景(NC)賦予轉(zhuǎn)座酶更高的活性的確認。在2%的瓊脂糖凝膠中分離使用帶有 不同適體的Vi化ar轉(zhuǎn)座酶產(chǎn)生的NGS樣品并用漠化乙錠染色。
[0041] 圖11是運樣的圖，其顯示了 ：不同適體及其混合物賦予Vi化ar轉(zhuǎn)座酶的重復(fù)率。
[0042] 圖12是運樣的圖，其顯示了：不同適體賦予Vibhar轉(zhuǎn)座酶的AT漏失（AT dropouts)。
[0043] 圖13A-B闡釋了一些現(xiàn)有技術(shù)的寡核巧酸和一些本發(fā)明的示例性經(jīng)修飾的寡核巧 酸，包括 AgPl、A評 2、3i 化、81化、310、810、3肥、8肥、31]4、81]4、310*肌和810*?。ㄉ颟?0齡分 別為79-90): (A)轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)的典型產(chǎn)物的實例，所述轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)包括DNA插入物，即用 3i化/3i0和8ilb/8i0適體加上標(biāo)簽的DNA片段，W及用于在PCR中擴增DNA片段的AgPl和 AgP2引物。顯示了 DNA插入物兩端的缺口；缺口處的箭頭表示缺口的DNA聚合酶修復(fù)的方向。 (B)現(xiàn)有技術(shù)的適體和經(jīng)修飾的適體。箭頭的實線部分表示雜交的寡核巧酸;虛線部分表示 延伸部分，即通過DNA聚合酶復(fù)制。粗體X代表受阻或阻斷的DNA聚合酶延伸。加:脫氧尿巧； InvdT:反向胸巧;星號:硫代憐酸醋鍵。
[0044] 圖14A-B是運樣的照片，其闡釋了直接來自轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)而不進行SPRI純化的轉(zhuǎn)座 酶反應(yīng)產(chǎn)物的擴增：（A)不利用祀DNA，但利用帶有適體對1、3或4的V化bar轉(zhuǎn)座酶進行轉(zhuǎn)座 酶反應(yīng)持續(xù)25分鐘；（B)在利用帶有適體對1、3或4的V化bar轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)中使人類 DNA( 2化g/20ul)片段化和標(biāo)簽化持續(xù)20分鐘或45分鐘
[0045] 圖15是運樣的照片，其闡釋了 ：高祀DNA輸入(200ng/20ul)轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)之后，利用 或不利用SPRI純化得到的PCR產(chǎn)物的比較。
[0046] 圖16是運樣的圖，其闡釋了用于NGS的樣品制備的標(biāo)準(zhǔn)適體和示意圖，包括AgPU A評2、3i化、Snb、3ilt和8ilt(SEQ ID NO分別為79、116、81、82和91-92)。？5和？7指定了附 著到111皿ina流動池(flow Ce 11)所必需的部分。
[0047] 圖17是運樣的照片，其闡釋了：使用標(biāo)準(zhǔn)適體、利用50ng/m巧日lOOng/ml轉(zhuǎn)座酶(分 別為"A"和"B")持續(xù)15分鐘、25分鐘或42分鐘時，觀察到的對DNA片段化和標(biāo)簽化的核酸酶 活性。
[004引圖18是運樣的照片，其顯示了 ：利用20pg人類DNA輸入(對應(yīng)于~3個二倍體細胞） 時，在不同轉(zhuǎn)座酶濃度（即，A-180ng/ml、B-120ng/ml、C-80ng/ml)下，使用適體78對轉(zhuǎn)座酶 DNA片段化和標(biāo)簽化缺乏核酸酶活性，在不同轉(zhuǎn)座酶濃度（即，A-180ng/ml、B-120ng/ml、C-80ng/ml)下，使用適體78的硫代憐酸醋衍生物(適體ES)賦予提高的轉(zhuǎn)座酶活性。
[0049] 圖19A-C顯示了轉(zhuǎn)座酶適體的衍生物：（A)適體78的硫代憐酸醋衍生物的實例；（B) 標(biāo)準(zhǔn)適體的硫代憐酸醋衍生物(僅顯示了關(guān)于圖16中所述的頂鏈）；和(C)組合了錯配、反向 dT和加修飾的硫代憐酸醋適體。括號內(nèi)的數(shù)字指的是SEQ ID NO。
[0050] 圖20闡釋了適合在Illumina儀器上進行NGS測序的樣品制備的4引物PCR反應(yīng)中， 用于適體78或其衍生物的PCR擴增的引物。P5和P7指定了附著到Illumina流動池所必需的 部分。括號內(nèi)的數(shù)字指的是SEQ ID NO。
[0051] 圖21A-C是運樣的一組圖，其顯示了用于微陣列的樣品制備中的DNA片段化/標(biāo)簽 化(A)、擴增(B)和標(biāo)記(C)。
[0052] 圖22A-B的照片顯示了運樣的人類DNA，其在轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)中被片段化和標(biāo)簽化并且 在利用與用于微陣列的標(biāo)簽互補的引物的PCR中被擴增。A:16pg DNA輸入，B:200ng DNA輸 入。
[0化3] 發(fā)明詳述
[0054]本發(fā)明至少部分基于多種分離的合成核酸轉(zhuǎn)座酶適體的意外發(fā)現(xiàn)。令人驚訝地， 雖然運些合成適體在大部分保守位點與已知的功能轉(zhuǎn)座酶適體(天然的或經(jīng)修飾的二者） 不同，但合成適體保留活性且它們中的一些具有甚至更高的活性，從而導(dǎo)致用于NGS時提高 的隨機性、降低的重復(fù)率或二者。在一些實施方式中，已證明了 ：可通過修飾天然適體中保 守的第1位置來產(chǎn)生多種賦予所選的轉(zhuǎn)座酶不同性質(zhì)的有用的適體。還驚訝地發(fā)現(xiàn):對適體 的一些修飾允許制備用于NGS的DNA樣品而不用耗時地去除適體，和/或允許處理具有很少 量DNA的樣品。
[0化5] 墊墜
[0056] ^明提供分離的合成核酸適體，其含有第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和第二鏈 分別包含上文提到的第一序列和第二序列、基本上由上文提到的第一序列和第二序列組成 或者由上文提到的第一序列和第二序列組成。所述第一序列和第二序列彼此完全互補或者 基本互補，且適體被轉(zhuǎn)座酶識別。
[0057] 如上文所述，轉(zhuǎn)座酶不作為分離蛋白起作用，而是與特定DNA序列或適體形成復(fù)合 體起作用，所述特定DNA序列或適體可W與轉(zhuǎn)座酶形成穩(wěn)定的復(fù)合體并因此使得它們有活 性。適體可W是在自然中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座酶識別序列，或者它們也可W是經(jīng)修飾的天然序列。通 常，作為慣例，僅一種運樣的序列被推薦與特定轉(zhuǎn)座酶一起使用。例如，被突變W使得更加 活躍、更加穩(wěn)定且更好表達的"超活性化yperactive)"化5轉(zhuǎn)座酶識別"嵌合體(mosaic)"序 列(適體），所述"嵌合體"序列也是由天然序列突變的且僅運種序列被推薦與運種轉(zhuǎn)座酶一 起使用（Zhou等人 J Mol Biol. 1998,276(5) :913-25;化OUilette等人，Dev Dyn.2012,241 (10):1584-90)。
[005引已知轉(zhuǎn)座酶DDE氨基酸基序是催化位點的一部分且對于轉(zhuǎn)座酶活性是必需的 (Nesmelova和Hackett,Adv Drug Deliv Rev.2010,30;62(12):1187-95;Steinige;r-White 等人，Curr Opin Struct Biol.2004年2月；14(1):50-7)。由于DDE基序W及適體在其附近 存在運二者對于活性是必要的，所W發(fā)明人意識到:可通過改變位于接近DDE基序的催化位 點的適體中的核巧酸來適當(dāng)調(diào)節(jié)復(fù)合體的性質(zhì)。然而，本領(lǐng)域已知，類似于嚴格保守的DDE 基序，最接近催化位點的適體中的核巧酸也嚴格保守。為此，圖I列出了一些已知的轉(zhuǎn)座酶 的天然適體和經(jīng)修飾的適體，其中僅顯示了一條鏈。如圖所示，在適體中的第一位置的C在 所有的不同適體中是保守的。
[0059] 當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語"適體"指的是非祀核酸組分，一般是DNA，其提供了尋址 (addressing)其隨后連接的核酸片段的方式。例如，在一些實施方式中，適體包含運樣的核 巧酸序列，所述核巧酸序列允許與適體相連的DNA的鑒定、識別和/或分子或生化操作（例 如，通過為寡核巧酸退火提供位點，所述寡核巧酸例如用于通過DNA聚合酶延伸的引物，或 者用于捕獲或連接反應(yīng)的寡核巧酸）。如本文所公開的，本發(fā)明的適體具有（i)具有第一序 列的第一鏈，所述第一序列是轉(zhuǎn)座酶的天然或已知識別序列的修飾版本，和/或（ii)具有第 二序列的第二鏈，所述第二序列是所述識別序