專利名稱：丙型肝炎病毒ns3解旋酶atp結(jié)合位點單克隆抗體識別表位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種丙型肝炎病毒NS3蛋白B細(xì)胞表位，其為丙型肝炎病毒NS3解旋酶ATP結(jié)合位點單克隆抗體識別表位，及使用該細(xì)胞表位刺激得到的抗丙型肝炎NS3蛋白的單克隆抗體，還涉及該細(xì)胞表位的應(yīng)用和由該細(xì)胞表位刺激產(chǎn)生的抗體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
丙型肝炎是一種主要經(jīng)血液傳播的疾病，丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌(HCC)，對患者的健康和 生命危害極大，已成為嚴(yán)重的社會和公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球HCV的感染率約為3%，估計約I. 7億人感染了 HCV，每年新發(fā)丙型肝炎病例約3. 5萬例。僅中國就有大約4，000萬名HCV感染者，感染率約為3. 2%，是HCV感染的高發(fā)區(qū)。大多數(shù)HCV感染者沒有癥狀或癥狀輕微，易于形成慢性感染，20 35%的慢性感染者將最終發(fā)展成肝硬化，其中每年又有大約I 4%的人發(fā)展為肝癌。丙型肝炎目前尚無有效疫苗，也無有效的治愈方法。迄今最有效的抗HCV的治療僅限于干擾素與利巴韋林聯(lián)合使用，效果在不同基因型之間有很大差異，持續(xù)療效約為40%，然而這兩種藥物副作用大和費用昂貴，限制了廣泛應(yīng)用。隨著臨床上蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑在治療HIV中的應(yīng)用及取得的良好療效，近年來以在病毒基因組復(fù)制和多聚蛋白前體加工成熟中起著關(guān)鍵作用的酶類(如絲氨酸蛋白酶、解旋酶和RNA聚合酶)為靶標(biāo)，尋找特異有效的治療藥物已經(jīng)成為HCV防治研究的重要方向。此外，目前HCV的主要診斷方法是用放射免疫診斷(RIA)或酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)檢測血清中HCV抗體，但是抗體檢測一般存在7 10周的窗口期，威脅著用血安全。檢測HCV核酸可有效縮短窗口期，但因其操作復(fù)雜，容易污染且價格昂貴，使之不能廣泛應(yīng)用。血清學(xué)檢測中，除了抗體檢測，還有抗原檢測，可以縮短窗口期。早期診斷是控制HCV發(fā)生和傳播的重要手段。因此，獲得有效抗體，研究抗原檢測試劑成為目前HCV診斷研究的重要方向。HCV屬于黃病毒科，肝病毒屬，單股正鏈RNA病毒。HCV的基因組大小約為9600bp，包括一個大的開放閱讀框(ORF)和兩側(cè)的5’、3’非編碼區(qū)(NCRs)。翻譯結(jié)束后，前體聚蛋白被宿主和病毒的蛋白酶共同切割成10個具有獨立功能的HCV蛋白，根據(jù)功能的不同命名為(3132、口7、吧2、吧3、吧4六、吧48、吧5六和吧58。其中HCV NS3蛋白全長631個氨基酸(aa)，分子量約為70kD，其N端的189個aa具有絲氨酸蛋白酶活性，C端的442個aa具有核苷三磷酸酶(NTPase)和RNA解旋酶的活性。C端解旋酶分為三個區(qū)域，區(qū)域I和區(qū)域2是主要的功能區(qū)，并且序列保守性較高。其中，區(qū)域I中的Walker A (GSGKSTK)在HCV所有亞型中高度保守，為ATP結(jié)合位點，并在解旋酶活性啟動中起到重要作用。NS3解旋酶的活性與RNA的復(fù)制是分不開的，在HCV前體蛋白的成熟和病毒復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。由于HCV NS3蛋白的多功能性和它在病毒基因組復(fù)制及蛋白前體加工成熟中的重要性，它已經(jīng)成為抗HCV感染的理想靶位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種丙型肝炎病毒NS3蛋白B細(xì)胞表位，也為丙型肝炎病毒NS3解旋酶ATP結(jié)合位點單克隆抗體識別表位。本發(fā)明的另一個目的在于提供上述B細(xì)胞表位的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個目的在于提供抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的單克隆抗體，其能識別 上述丙型肝炎病毒NS3蛋白B細(xì)胞表位。本發(fā)明的再一個目的在于提供抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用。為解決以上問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
丙型肝炎病毒NS3蛋白B細(xì)胞表位，具有如下所示的氨基酸序列PTGSGKSTK (SEQ IDN0:1)。上述的丙型肝炎病毒NS3蛋白B細(xì)胞表位在制備診斷、預(yù)防或治療丙型肝炎試劑或藥物中的應(yīng)用。一種抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的單克隆抗體，其重鏈為IgGl、輕鏈為K鏈，該單克隆抗體能與權(quán)利要求I所述的丙型肝炎病毒NS3蛋白B細(xì)胞表位特異性結(jié)合。上述的單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟
1)將權(quán)利要求I所述的丙型肝炎病毒NS3蛋白B細(xì)胞表位免疫動物；
2)取免疫動物的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株；
3)以有限稀釋法克隆化培養(yǎng)陽性雜交瘤細(xì)胞株，獲得穩(wěn)定分泌抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的陽性雜交瘤細(xì)胞；
4)將獲得的陽性雜交瘤細(xì)胞注射到動物腹腔內(nèi)，收集、純化腹水,獲得抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的單克隆抗體。優(yōu)選的，產(chǎn)生免疫反應(yīng)的小鼠的血清間接ELISA效價不低于I :51200。上述的抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的單克隆抗體在在制備診斷、預(yù)防或治療丙型肝炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明的丙型肝炎病毒NS3蛋白B細(xì)胞表位，為新發(fā)現(xiàn)的一個NS3蛋白抗原表位，該表位處于NS3 C端解旋酶第一區(qū)域的ATP結(jié)合位點。本發(fā)明的單克隆抗體能特異性識別上述ATP結(jié)合位點，使解旋酶活性減弱或消失，進而影響HCV的復(fù)制?？贵w與此位點相結(jié)合，有望達到治療HCV的目的。本發(fā)明的單克隆抗體，對HCV NS3蛋白具有很好的特異性識別能力，可以用于HCV血清學(xué)抗原檢測，替代現(xiàn)有的HCV檢測產(chǎn)品。


圖I是PCR擴增目的序列的電泳 圖2是HCV NS3重組蛋白(1192aa 1459aa)表達電泳鑒定 圖3是HCVNS3重組蛋白(1192aa 1459aa)純化電泳鑒定 圖4是純化單克隆抗體HCV NS3-2E12蛋白電泳圖；圖5是Western-Blot試驗檢測單克隆抗體HCV NS3-2E12與感染HCV的huh7. 5. I細(xì)胞中天然蛋白的反應(yīng)性結(jié)果 圖6是間接免疫熒光試驗檢測單克隆抗體HCV NS3-2E12與感染HCV的Huh7. 5. I細(xì)胞反應(yīng)性結(jié)果 圖7是競爭抑制ELISA測定單克隆抗體株HCV NS3-2E12抗原表位結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實驗對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限如此。參照文獻，截短型HCV NS3 (1192aa 1459aa)屬于免疫活性區(qū)域，定為所要表達 的目的蛋白?？刹捎没蚬こ谭椒ㄖ苽銱CV NS3蛋白，或直接購買純化的HCV NS3蛋白?；蚍椒椴捎肞CR方法克隆出編碼HCV NS3 (1192aa 1459aa)的DNA序列，然后將該序列插入到表達載體的多克隆位點，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到表達宿主菌，構(gòu)建得到工程菌株，工程菌株經(jīng)誘導(dǎo)表達，分離純化得到HCV NS3重組蛋白。該具體方法為很多種，以下例舉一具體實施例
HCV NS3重組蛋白表達載體的構(gòu)建
以NS2-4A基因序列為模板擴增目的基因序列(編碼HCV NS3 (1192aa 1459aa)的DNA 序列)，NS2-4A 為編碼 NS2, NS3, NS4A 的全基因序列，序列見 GenBank accession No.JN870283o設(shè)計引物NS3-P1:5’ -CGGAATTCGCGGTGGACTTTATACCCGTTG-3’ (SEQ ID NO: 2) ；NS3-P2:5’ -CCCAAGCTTGGTGACACATGTGTTACAG-3’ (SEQ ID NO: 3)，并在引物中引入相應(yīng)的限制性酶切位點EcoRI，Hindm(下劃線標(biāo)示)。PCR擴增目的基因50 μ L體系包括dNTP 4yL,IOXEx-Taq Buffer 5 μ L，P1、P2 各 I μ L，模版 DNA3 μ L, Ex-Tap DNA 聚合酶 O. 5 μ L，H2O35. 5 μ L。PCR 反應(yīng)條件為95 °C預(yù)變性 2min，94 °C 45s, 58 °C 45s, 72 °C Imin,擴增 30個循環(huán)后，72 °C延伸IOmin。PCR結(jié)果在IOg/ L瓊脂糖凝膠上電泳檢測(見圖1，由圖I可知目的基因片段804bp)，并用膠回收試劑盒回收。將PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD20-T連接并按照pMD20-T載體說明書進行，感受態(tài)的制備、轉(zhuǎn)化與陽性克隆的鑒定均按《分子克隆(第三版)》操作。挑取PMD20-T/ HCV NS3陽性克隆交由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司。測序成功后，用EcoR I / HindIII雙酶切pMD20_T/ HCV NS3，回收小片段即為目的基因片斷。與經(jīng)過相應(yīng)核酸內(nèi)切酶雙酶切的pET_32a質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，陽性克隆提取質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增及EcoR I / HindIII雙酶切鑒定后，交由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司。測序正確，成功構(gòu)建表達載體pET-32a-NS3。重組蛋白的制備
將表達載體pET-32a-NS3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21。將重組菌搖至對數(shù)生長期后，以終濃度ImM IPTG加入誘導(dǎo)目的蛋白表達。誘導(dǎo)后超聲破碎，經(jīng)電泳鑒定上清中含有目的蛋白，見圖2，圖中，M marker ；I :誘導(dǎo)如全囷；2 :誘導(dǎo)后全囷；3 :超聲后上清；4 :超聲后沉淀。Ni-NTA偶聯(lián)的金屬螯合親和層析吸附柱吸附、純化HCV NS3重組蛋白。300mM咪唑濃度的洗脫液(50mM PB緩沖液，500mM NaCl，200mM咪唑，pH7. 4)洗脫目的蛋白純度達80%以上。洗脫的蛋白溶液用50mM PB緩沖液(pH7. 4)進行透析去除咪唑后，將蛋白濃縮并測定蛋白濃度，蛋白純化電泳鑒定圖見圖3，圖中，I :超聲后上清；2 :流穿蛋白；3 :50mM咪唑濃度的洗脫；4 =IOOmM咪唑濃度的洗脫；5 200mM咪唑濃度的洗脫；6 300mM咪唑濃度的洗脫；7 500mM咪唑濃度的洗脫；M :marker,由圖可見純化后的重組蛋白為單一蛋白。制備HCV NS3的單克隆抗體
I.小鼠免疫
1)選擇6周齡的純系雌性BALB/c小鼠，用純化的重組HCVNS3蛋白作為免疫抗原免疫小鼠，將NS3蛋白與等體積的弗氏完全佐劑(CFA)乳化后，背部皮下多點注射；
2)初次免疫2周后將純化的NS3與等體積的弗氏不完全佐劑(IFA)乳化后，背部皮下多點注射；
3)2周后，小鼠尾部取血，離心獲得血清，將血清倍比稀釋采用間接ELISA方法測效 價，效價需不低于I :51200 ；
4)融合前三天，腹腔注射重組HCVNS3蛋白；
三次免疫抗原的量分別為100 μ g/鼠、50 μ g/鼠、100 μ g/鼠。2.細(xì)胞融合
斷頸處死上述免疫好的BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞按5:1在50% PEG1450融合劑下進行融合，融合后以HAT選擇培養(yǎng)基鋪板置于37°C 5%C02培養(yǎng)。3.陽性克隆篩選及克隆
利用純化的重組HCV NS3蛋白以間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株，將陽性孔擴大培養(yǎng)后，用有限稀釋法進行細(xì)胞克隆，經(jīng)過三次克隆獲得I株能穩(wěn)定傳代并分泌抗HCVNS3蛋白的特異性單克隆抗體細(xì)胞株HCV NS3-2E12。4.誘生腹水及抗體的純化
12周齡，雌性BALB\c小鼠腹腔注射無菌液體石蠟，500 μ L/只，一周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞(5Χ IO5Cell/鼠),7天左右開始抽取腹水。通過protein_G親和層析柱純化腹水,用超濾方法脫鹽濃縮抗體。SDS-PAGE鑒定純化后的單抗。取純化后的抗體按1:1加入2XSDS上樣緩沖液，沸水浴中煮5min, 12000rpm離心lmin,取上清10 μ I進行分離膠12%,濃縮膠5%的SDS-PAGE電泳分離，結(jié)果見圖4，圖中，M marker ；1 HCV NS3-2E12單抗，由圖可知，HCV NS3-2E12單抗分成了兩條帶，可見HCV NS3-2E12單抗由重鏈和輕鏈組成。單克隆抗體的鑒定
I.單克隆抗體的亞類鑒定
參照HyCult Biotechnol公司鼠源抗體分型試劑盒說明書對雜交瘤細(xì)胞HCV NS3-2E12進行鑒定，經(jīng)鑒定HCV NS3-2E12單克隆抗體重鏈為IgGl，輕鏈為κ鏈。2. Western-Blot 鑒定
將感染HCV的Huh7. 5. I細(xì)胞超聲破碎后離心。取離心后上清按I: I加入2XSDS上樣緩沖液，沸水浴中煮5min, 12000rpm離心lmin,取上清10 μ I進行分離膠10%,濃縮膠5%的SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，PVDF膜以含5%脫脂奶粉TBST封閉2h ;—抗為純化后的抗體(濃度lug/ml)孵育lh，TBST洗膜三次，每次IOmin ;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG & IgM作為二抗孵育lh，TBST洗膜后發(fā)光顯影。試驗中以布魯氏桿菌BP26的一株單抗作為陰性對照。試驗結(jié)果見圖5，圖中I : HCV NS3-2E12與感染HCV的Huh7. 5. I細(xì)胞中天然蛋白作用結(jié)果；2 :布魯氏桿菌BP26的單抗與感染HCV的Huh7. 5. I細(xì)胞中天然蛋白作用結(jié)果，由圖顯示HCV NS3-2E12與天然蛋白在約為67KDa處有一明顯條帶，而陰性對照布魯氏桿菌BP26的單抗不與蛋白反應(yīng)。3.間接免疫熒光檢測鑒定
將感染HCV的Huh7. 5. I細(xì)胞以IXioVml的密度接種到96孔板中。三天后，去除培養(yǎng)基，并用100%預(yù)冷的甲醇固定細(xì)胞，-20°C 20min ;棄甲醇后，每孔加IOOyL IFBufferdXPBS, 1%BSA, 2. 5Mm EDTA)室溫孵育 Ih ;棄 IF Buffer，一抗為純化后的抗體(濃度3ug/ml)4°孵育過夜，PBS洗三次；加熒光素標(biāo)記二抗(lug/ml)37°孵育lh，PBS洗三次。突光顯微鏡下檢測突光。實驗中以布魯氏桿菌BP26的一株單抗作為陰性對照。實驗結(jié)果見圖6，圖中，I : HCV NS3-2E12與感染HCV的Huh7. 5. I細(xì)胞作用結(jié)果；2 :布魯氏桿菌BP26的單抗與感染HCV的Huh7. 5. I細(xì)胞作用，結(jié)果顯示HCV NS3-2E12與感染HCV的Huh7. 5. I細(xì)胞作用，熒光顯微鏡下可見到紅色的熒光，主要分布在胞漿內(nèi)。而陰性對照布魯 氏桿菌BP26的單抗不與感染HCV的Huh7. 5. I細(xì)胞作用，熒光顯微鏡下無可見熒光。設(shè)計多肽初步篩選HCV NS3-2E12抗原表位
根據(jù)pET-32a-NS3測序結(jié)果，設(shè)計并合成了 29條重疊肽，長度16個氨基酸，每兩條多肽之間重疊7個氨基酸(包括所有<8個氨基酸殘基的表位)(表I)。每條多肽以終濃度5 μ g/ml，每孔100 μ I包被過夜；洗滌液PBST洗滌4次后，以PBS+4%BSA,每孔200 μ I,37°C封閉一小時；洗滌液洗滌4次后，以50 μ I各單克隆抗體株細(xì)胞上清+50 μ I抗體稀釋液(PBST+1%BSA)為一抗37°C孵育45min ;洗滌液洗滌6次后，1:10000抗體稀釋液稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG&IgM為二抗，每孔100μ 1，37°C孵育30min ;洗滌液洗滌6次后，加入TMB-H2O2,每孔100 μ I避光顯色IOmin,每孔50 μ I 2Μ H2SO4終止反應(yīng)。測量450nm波長下每孔的光密度(0D)。以小鼠免疫HCVNS3重組蛋白后血清作為陽性對照，陰性對照為小鼠免疫前血清。以待測孔0D450nm彡2. I倍陰性對照0D450nm判為陽性。經(jīng)過測定單抗HCVNS3-2E12僅與多肽P05反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.丙型肝炎病毒NS3蛋白B細(xì)胞表位，具有如下所示的氨基酸序列PTGSGKSTK(SEQID NO:I)。
2.權(quán)利要求I所述的丙型肝炎病毒NS3蛋白B細(xì)胞表位在制備診斷、預(yù)防或治療丙型肝炎試劑或藥物中的應(yīng)用。
3.一種抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的單克隆抗體，其重鏈為IgGl、輕鏈為K鏈，該單克隆抗體能與權(quán)利要求I所述的丙型肝炎病毒NS3蛋白B細(xì)胞表位特異性結(jié)合。
4.權(quán)利要求3所述的單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟 1)將權(quán)利要求I所述的丙型肝炎病毒NS3蛋白B細(xì)胞表位免疫動物； 2)取免疫動物的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株； 3)以有限稀釋法克隆化培養(yǎng)陽性雜交瘤細(xì)胞株，獲得穩(wěn)定分泌抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的陽性雜交瘤細(xì)胞； 4)將獲得的陽性雜交瘤細(xì)胞注射到動物腹腔內(nèi)，收集、純化腹水，獲得抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于產(chǎn)生免疫反應(yīng)的小鼠的血清間接ELISA效價不低于I :51200。
6.權(quán)利要求3或4所述的抗丙型肝炎病毒NS3蛋白的單克隆抗體在在制備診斷、預(yù)防或治療丙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了丙型肝炎病毒NS3解旋酶ATP結(jié)合位點單克隆抗體識別表位，所述表位具有如下所示的氨基酸序列PTGSGKSTK(SEQ ID NO:1)。本發(fā)明還公開了識別上述表位的單克隆抗體，及上述表位與單克隆抗體的應(yīng)用。本發(fā)明的丙型肝炎病毒NS3解旋酶ATP結(jié)合位點單克隆抗體識別表位，為新發(fā)現(xiàn)的一個NS3蛋白抗原表位，該表位處于NS3C端解旋酶第一區(qū)域的ATP結(jié)合位點。本發(fā)明的單克隆抗體能特異性識別上述ATP結(jié)合位點，使解旋酶活性減弱或消失，進而影響HCV的復(fù)制抗體與此位點相結(jié)合，有望達到治療HCV的目的。
文檔編號A61K39/42GK102766195SQ201210242409
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者李婷婷, 王文敬, 邊奕鑫, 黎誠耀 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)