專利名稱：紫花苜蓿解旋酶基因及其克隆與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紫花苜蓿中解旋酶基因MW的克隆、重組及耐逆功能的分析和 應(yīng)用，屬于分子生物學和生物技術(shù)領(lǐng)域。(二) 背景技術(shù)干旱、鹽堿等不良環(huán)境條件在世界范圍內(nèi)嚴重影響作物的生長和產(chǎn)量。因 此，提高作物的耐逆能力愈來愈受到人們的重視。解旋酶在植物耐逆過程中的 作用是近幾年才被發(fā)現(xiàn)的，是一種新的植物耐逆途徑。研究表明過量表達某些 解旋酶基因可以提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽和耐低溫能力。與傳統(tǒng)耐逆途徑的區(qū)別 在于，它有可能直接作用于脅迫敏感的遺傳信息轉(zhuǎn)錄翻譯過程。這大大促進了 耐逆基因工程方面的研究工作，并取得突破性進展。2005年N. Sanan-Mishra 等利用基因工程手段在煙草中過量表達豌豆來源的基因PiWW(Eea ，A lielicase 11),在不影響轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)量的同時極大的提高了其耐鹽能力，轉(zhuǎn) 基因植株可以在含300 mM NaCl的培養(yǎng)基上正常生長(N. Sanan-Mishra， X. H. Pham, S. K. Sopory and N. Tuteja， Pea DNA helicase 45 overexpression in tobacco confers high salinity tolerance without affecting yield, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005)， pp. 509 514.)。由于解旋酶基因在植物耐逆過程中所起的作用，本發(fā)明人利用反轉(zhuǎn)錄-聚合 酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)，從常用豆科牧草紫花苜蓿中分離編碼解旋酶的基因必W, 利用半定量RT-PCR的方法分析了不同逆境脅迫條件下該基因的表達情況。構(gòu)建 正義表達載體，利用花序浸染法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因楦株的耐單、 耐鹽和抗氧化脅迫能力得到了顯著提高。該基因可用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化，提高其耐旱、耐鹽能力。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次從紫花苜蓿中分離出解旋酶基因的全長cDNA，半定量 RT-PCR分析表明該基因的表達受不同逆境脅迫的誘導(dǎo)。將其連接到表達載體 pBI121上，轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株在種子萌發(fā)、幼苗生長和以后的生長發(fā)育 過程中耐旱、耐鹽和抗氧化脅迫能力都得到了提高。該基因的全長cDNA為1609 bp，其中開放閱讀框部分為1221 bp，由此推 得含有406個氨基酸的一段序列，用DNAMan軟件將巡W基因編碼的氨基酸序列 與GenBank中登記的序列進行比較發(fā)現(xiàn)，該序列與豌豆、煙草、擬南芥解旋酶 序列有較高的同源性。MDH具有DEAD-box家族的所共有的九個基序Q、 I 、 I a、 Ib、 II、 III、 IV、 V和VI，屬于DEAD-box解旋酶家族。(見附圖l)。表明經(jīng)過 上述克隆步驟得到了紫花苜蓿中編碼DEAD-box解旋酶的基因。該基因的序列如 下序列表(1) SEQ ID NO 1的信息(a) 序列特征*長度1609堿基對 *類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓撲結(jié)構(gòu)線性(b) 分子類型cDNA(c) 假設(shè):否(d) 反義:否(e) 最初來源紫花苜蓿(f) 序列描述CtcgtCtCtC 33CC333CCt tcttccttttggttccggcg aatcgccgac gaacggttac cgaaggcgtg aaagcaatcg gaagcttcga tggaatctac aattacggat ttgagaaacc gattattcag ggaagagatg ttattgctca gattgctttg acggtttgtc aggttgttga tgtgtctccg acaagagaac tggcctcaca ttatatcaat atacaagccc atgcttgcat ssaacttgsg cstggsgttc atgtcgtgtc a33g3gg3g3 3C3ttgcgc3 ccsgggccst aatgttgsgc ag3gggttt3 3sgatcagat tcttcsggtt tgcctg3ttt ctgct3cgct gtttatgaca gatccagtga ggatccttgt caagcaattt tttgttgcgg ttgaaaggga ataitgstsct ctc3ccstt3 ctcssgctgt ctggttaact gaaaaaatgc gtaacaataa gcctcaaaga gaaagagatg ccattatgag gataacaacc gatgtttggg ctcgtggcct ttatgscctt ccas3ta3tc gagagctct3 tggacgsaag ggtgttgcs3 taaattttgt tattgsgcsa tsttscsgts cccag3ttg3 ataaaaggac aaggcagtat gctgagtgga gtgtttgatt gtggtttctt tttgatactc ggtgtattag atttttagtg tgctcgactg gaaatggttg agacttgaga tcaatttgta actttcgstg tgwtstct3 3ttttgtgstt333333333 3333333333 3333333333(2) SEQ ID NO. 2的信息(a) 序列特*長度406氨基酸征*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b) 分子類型蛋白質(zhì)catctcggcggcgatggcgacagcttctgt60ggcc33cg3gg3C3tggatt1203g3gatggggatttgcttcg180gtctgcgattcsscsgcgtgcggttgcgcc240ggcgcsatctggtactggaaagacttcgat300t3C3tccgtcagagaggtgcaagctttaat360gttatattggcaattgggga420tggagggaaaagtgtgggagS3g3csttsg480tggasctcctggccgsgtctgtgscstgat540caagtt3ct3gttctggatg3atctg3tga600ttatgatgtgt3csg3tatctcccaccgga6603cctc3tgsasttctggaga720333gcgtgstgaattgacattggagggcat780ggsstggssgtttgatactctgtgtgstct840t3tattctgtggssggtgga900tttcsctgtttcatccstgc3cggtg3c3t960tgaattccgcgttggs3C33cccgagtstt1020tg3tgtsc33caggtttctc1080cattcatcggattggtcgttctggacgttt1140t3333gcg3tttttgagaga1200tgsgstgccai3tgsstgttgctgatcttat1260gtgcgtttgtC33stttgtggtaggaatta1320tgcgstgttcttctgasacttttgacattt1380taccgcsgsgataacgtgtttttctttgct1440aattgsgttggaatg3tttgtccattgctt1500tC3agtgatatgtgstgttttgacgaggtt15601609(c)序列描述001 MATASVVPAN RRRTVTANED MDFETTEGVK AIGSFEEMGIK DDLLRGIYN YGFEKPSAIQ 60 061 QRAVAPIIQG RDVIAQAQSG TGKTSMIALT VCQVVDTSVR EVQALIVSPT RELASQTEKV 120 121 ILAIGDYINI QAHACIGGKS VGEDIRKLEH GVHVVSGTPG RVCDMIKRRT LRTRAIKLLV 180 181 LDESDEMLSR GFKDQIYDVY RYLPPDLQVC LISATLPHEI LEMTNKFMTD PVRILVKRDE 240 241 LTLEGIKQFF VAVEREEWKF DTLCDLYDTL TITQAVIFCN TKRKVDWLTE KMRNNNFTVS 300 301 SMHGDMPQRE RDAIMSEFRV GTTRVLITTD VWARGLDVQQ VSLVINYDLP NNRELYIHRI 360 361 GRSGRFGRKG VAINFVKSDD IKILRDIEQY YSTQIDEMPM NVADLI 406構(gòu)建融合蛋白表達載體35S::MH1-GFP，在洋蔥表皮細胞內(nèi)瞬時表達，發(fā)現(xiàn) MH1蛋白定位于細胞核中(見附圖2)。利用200 raM甘露醇，200 raM NaCl， 10 MM H202， 15 u M ABA和500 y M水 楊酸處理水培的紫花苜蓿幼苗并提取總RNA做半定量RT-PCR，結(jié)果表明該基因 的表達受各種逆境脅迫誘導(dǎo)(見附圖3)。利用過量表達策略，構(gòu)建植物表達載PBI121，轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，選取 不同的純合轉(zhuǎn)基因株系進行耐逆性分析，同時以表達PBI121: :0/S空載體的轉(zhuǎn) 基因擬南芥植株做為對照。正常情況下轉(zhuǎn)基因植株和對照植株的萌發(fā)和生長情況沒有明顯差異(見附 圖4-h)。將GM培養(yǎng)基上正常生長14天的幼苗在光照培養(yǎng)箱中干燥6小時，幼 苗復(fù)水48小時以后發(fā)現(xiàn)對照植株的幼苗全部漂白死亡，而轉(zhuǎn)基因株系的幼苗仍 然能保持部分綠色(見附圖4-a)。在含有400 mM甘露醇的GM培養(yǎng)基上對照 植株種子的萌發(fā)率僅為15%左右，而轉(zhuǎn)基因種子均能夠正常萌發(fā)(見附圖4-b)。將萌發(fā)后5天的TL34株系和對照幼苗移栽至盛滿基質(zhì)的同一個花盆中，不 澆水完全干旱處理14天，待幼苗均發(fā)生嚴重枯萎后恢復(fù)澆水5天，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因 幼苗能夠返青并繼續(xù)生長而對照植株卻嚴重失綠最終死亡(見附圖4-c)。由于 不同苗期，植物對干旱的抵抗能力存在很大差異，所以又選擇在短日照條件下 正常生長一個月后的TL34株系和對照植株進行干旱處理。完全干旱4周后，對 照植株生長非常緩慢，相同葉位葉片的面積僅為轉(zhuǎn)基因植株的l/2(見附圖4-d)，葉片枯萎現(xiàn)象嚴重，整株葉片呈現(xiàn)墨綠色。而轉(zhuǎn)基因植株的生長雖然受到一定 程度的抑制但是生長狀況遠遠好于對照植株。在含有200 mM NaCl的GM培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)率為100%,而對照種 子的萌發(fā)率僅為46%左右(見附圖4-e)。對短日照條件下生長25天的幼苗澆 灌200 mMNaCl，連續(xù)澆灌15天后，可以明顯的觀察到對照植株葉片變紫開始 枯萎并最終死亡，而轉(zhuǎn)基因植株雖然生長比較弱但仍能繼續(xù)生長(見附圖4-f)。在含有5 MM甲基紫精的GM平板上檢測不同轉(zhuǎn)基因株系(TL12和TL34)種 子的萌發(fā)與幼苗的生長情況。結(jié)果顯示95%以上的轉(zhuǎn)基因種子均能夠正常萌發(fā)而 對照種子萌發(fā)率低于7% (見附圖4-g)。對照幼苗在含有甲基紫精的培養(yǎng)基上 豎直培養(yǎng)5天后全部漂白死亡，而轉(zhuǎn)基因植株雖然生長較弱，但是仍然可以繼 續(xù)生長(見附圖4-i)。根據(jù)上述技術(shù)，從紫花苜蓿中分離出編碼DEAD-box解旋酶的基因Jft7，該基 因的表達受不同脅迫處理的誘導(dǎo)。在擬南芥中表達基因能夠提高轉(zhuǎn)基因植 株的耐旱、耐鹽和抗氧化脅迫能力。該研究為利用基因工程技術(shù)進行紫花苜蓿 耐逆新品種的培育提供了新的理論資料和基因資源。具有非常重要的經(jīng)濟效益 和理論價值。

圖1推測的MH1蛋白序列與不同物種來源的DEAD-box解旋酶序列比較分 析。序列比較圖用DNAMAN分析軟件完成?；业缀蜏\灰底分別代表100%和75%的 同源性。序列中的原點代表缺少的氨基酸。假定的保守結(jié)構(gòu)域用羅馬字表示。 解旋酶序列的來源分別為PDH45:豌豆(CAA76677)， NelF4A3:煙草(CM43514)， 和elF4Al:擬南芥(NP_566469)。同源比較圖用DNAMAN分析軟件完成。圖2洋蔥表皮瞬時表達分析表明MH1-GFP融合蛋白定位在細胞核中。下圖為表達S55.v^P的洋蔥表皮細胞對照。圖3利用200 mM甘露醇，200 mM NaCl， 10 MM H202， 15 u M ABA和500 PM水楊酸處理水培三周的紫花苜蓿幼苗，處理不同時間后i/iW基因的表達分 析。圖4轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱、耐鹽和抗氧化脅迫能力分析。a:幼苗離體條 件下失水和復(fù)水情況。b;轉(zhuǎn)基因和對照種子在含有400 raM甘露醇的GM培養(yǎng)基 上萌發(fā)10天。c:幼苗干旱處理14天后，恢復(fù)澆水5天。d:正常生長一個月 的轉(zhuǎn)基因和對照植株干旱處理4周。e:轉(zhuǎn)基因和對照種子在含200 mM NaCl的 GM培養(yǎng)基上萌發(fā)10天。f:移植在同一個花盆中的轉(zhuǎn)基因和對照幼苗用200 mM NaCl連續(xù)處理15天。g:在含有5 Mm甲基紫精的GM培養(yǎng)基上種子萌發(fā)10天。 h:在GM培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因和對照種子的萌發(fā)10天。i:正常萌發(fā)10天的幼苗在 含有5 Mm甲基紫精的GM培養(yǎng)上豎直生長5天。 Control:對照植株。TL:表示不同的轉(zhuǎn)基因株系。 (五)具體發(fā)明實施方式實施方式l:紫花苜蓿解旋酶基因的克隆方法(1) RNA的提取利用TRIZOL試劑盒提取RNA。(2) DNA第一條鏈的合成取lng總RNA，加入5X反應(yīng)緩沖液4 pl， 10 raM脫 氧核糖核酸(dNTP) 2 pl，核糖核酸酶抑制劑(40-200 u/|il) 0.5 pl，引物 oligodT (1 ing/pl) 1 nl，反轉(zhuǎn)錄酶(10 u/jil) 2 pi, 42。C條件下反應(yīng)60分 鐘，然后在85。C條件下，放置IO分鐘，終止反應(yīng)。(3) PCR反應(yīng)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)試劑與條件為首先將下列試劑混在一起10 x反應(yīng)緩沖液 2. 5 |nl脫氧核苷酸混合物(dNTP) 2 pi正向引物(5|iiM) 2 pi反向引物(5(iM) 2 pi模板cDNA 2 piTaq DNA聚合酶 0. 25 |il總體積 25 piPCR反應(yīng)條件為94°C 3分鐘；然后進入下列循環(huán)94°C 1分鐘，57°C 1 分鐘，72°C 1分鐘，共35個循環(huán)；最后72。C延伸10分鐘。(4) 基因克隆取3(lPCR產(chǎn)物與pGEM-TEasy載體進行連接，操作步驟按 Promega公司pGEM-T Easy Vector system說明書進行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿 菌DH5(菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3』引哚-(-D-半乳糖苷和X-gal的含氨節(jié)青霉素(100(g/ml)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中過夜培 養(yǎng)。(5) 質(zhì)粒DNA的提取堿法提取質(zhì)粒DNA。(6) 序列測定本工作在大連寶生物工程公司進行。(7) 3'和5'序列的分離按Clontech公司的SMARTRACEcDNA Amplification Kit說明書進行。(8) 同源檢索利用BLAST軟件將分離出的序列與基因銀行中的序列進行比較。實施方式2:紫花苜蓿解旋酶基因(必W)的序列見"發(fā)明內(nèi)容"部分。 實施方式3:表達載體的構(gòu)建(1)根據(jù)分離出的紫花苜蓿解旋酶基因核苷酸序列，設(shè)計引物正向引物Ms-L: 5, -ATCTAGACTCGTCTCTCAACCAAACCTTC-3'反向引物Ms-R: 5, -AGTCGACCTCAGCATACTGCCTTGTCCTT-3， 以根的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行聚合酶鏈式反應(yīng)。(2) 取3pl PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體進行連接，操作步驟按Promega公 司產(chǎn)品pGEM-T Easy Vector system說明書進行。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株， 在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-(3-D-半乳糖苷和X-gal的含氨節(jié)青霉素(100 pg/ml)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。然 后堿法提取質(zhì)粒DNA，進行序列測定。(3) 用J^I和^a7I兩個限制性內(nèi)切酶將該基因從pGEM-T Easy載體上切下， 與相同酶酶切的pBI121連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a細胞，然后在含卡那霉素(50|ig/ml)的LB固體平板上培養(yǎng)，對菌落進行PCR鑒定和質(zhì)粒DNA的酶切分析。(4) 將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，所用菌株為GV3103。 實施方式4:轉(zhuǎn)基因植物耐逆能力分析(1) 種植擬南芥。(2) 挑取鑒定好的農(nóng)桿菌單克隆于含50 ing/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 28 。C振蕩培養(yǎng)。(3) 離心收集菌體，沉淀用滲透培養(yǎng)基(5%蔗糖，0. lMMgCl2， 0.5%Silwet L-77)懸浮，菌液0D6。。值在0.8左右。(4) 將擬南芥花序浸入滲透液中，浸泡5分鐘。(5) 收獲的種子在篩選培養(yǎng)基(lx MS鹽，1%蔗糖，pH 5.7， 0.8%瓊脂， 卡那霉素30 pg/ml)上篩選，得到抗性植株。(6) 對T3代純合的轉(zhuǎn)基因株系進行耐旱、耐鹽和抗氧化脅迫分析，觀察種 子萌發(fā)和幼苗的生長狀況，分析結(jié)果見附圖4。序列表<110>山東農(nóng)業(yè)大學<120>紫花苜蓿解旋酶基因及其克隆與應(yīng)用 <160>1〈170〉patent in 3. 1 <210>1 <211>聽 <212>腿<213>紫花苜蓿(Jfeo^'ca《0<221>1-1609<400>1ctcgtctctctcttccttttC3tctcggcggcgatggcgscagcttctgt60ggttccggcgastcgccgscga3cggttscggccsscgagg3cstggattttgaaacaac120cgaiaiggcgtgg33gcttcg3stttgcttcg180tggastct3caattacggatttgagaaaccgtctgcgattcaacagcgtgcggttgcgcc240gattattcsgggaagagatgtt3ttgctcsggcgcaatctggtactggaa3g3cttcg3t300gattgctttgacggtttgtcaggttgttgatacstccgtcagagatggtgc3sgcttt33t360tgtgtctccgtggcctc3csg3ctg3g333gttstattggcaattgggga420tt3t3tC33tatacaagcccatgcttgcattggagggaaaagtgtgggag480saascttgsgcatggsgttc3tgtcgtgtctggaactcctggccg3gtctgtgacatgat540acattgcgcaccsgggccaitcaagttactagttctggatg600aatgttgagc3gsgggttt3ttatgatgtgt3c3g3tatctcccaccgga660tcttcaggtttgcctg3tttctgctacgctacctcatgaa3ttctggsgstgacaaacaa720gtttatgacagatccagtgaggatccttgtaaagcg'tgatgwttgsc3ttggagggcat780tttgttgcggttg333ggg3gg33tgg33gtttg3tactctgtgtgatct840atstgstactCtC3CC3tt3ctcaagctgttstattctgt33C3CC33gCgg33ggtgg3900ctggttaidctgtaLacaataatttcactgtttcaitcc6Ltgc960gaaagagatgccsttstgsgtgaattccgcgttggsac33cccgsgtatt1020g3t33C33CCgatgtttgggctcgtggccttgstgt3csacaggtttctct3gtt3tCS31080ttatgaccttgagagctctaC3ttcatcgg3ttggtcgttctggacgttt1140tggacgaaagggtgttgc33tasattttgtttttgagsgai1200tattgsgcaat3tt3C3gt3cccsgsttgatg3gstgcc3atgaatgttgctgstcttst12603t3a33gg3caaggcagtatgctgsgtggsgtgcgtttgtcss3tttgtggtaggaatta1320gtgtttgattgtggtttctttttgatactctgcgatgttcttctgasscttttgacattt1380ggtgtattsgatttttagtgtgctcgactgtaccgcagag3t33cgtgtttttctttgct1440gsaatggttgagacttgagatC33tttgt3asttgagttggaatgatttgtccattgctt1500actttcgatgtgsst3tct3attttgtgattcaagtgststgtgatgttttgacgaggtt15601609
權(quán)利要求
1.一種紫花苜蓿解旋酶基因MH1，其特征在于它具有下述所示的序列1CTCGTCTCTC AACCAAACCT TCTTCCTTTT CATCTCGGCG GCGATGGCGA CAGCTTCTGT 6061 GGTTCCGGCG AATCGCCGAC GAACGGTTAC GGCCAACGAG GACATGGATT TTGAAACAAC 120121 CGAAGGCGTG AAAGCAATCG GAAGCTTCGA AGAGATGGGG ATAAAAGACG ATTTGCTTCG 180181 TGGAATCTAC AATTACGGAT TTGAGAAACC GTCTGCGATT CAACAGCGTG CGGTTGCGCC 240241 GATTATTCAG GGAAGAGATG TTATTGCTCA GGCGCAATCT GGTACTGGAA AGACTTCGAT 300301 GATTGCTTTG ACGGTTTGTC AGGTTGTTGA TACATCCGTC AGAGAGGTGC AAGCTTTAAT 360361 TGTGTCTCCG ACAAGAGAAC TGGCCTCACA GACTGAGAAA GTTATATTGG CAATTGGGGA 420421 TTATATCAAT ATACAAGCCC ATGCTTGCAT TGGAGGGAAA AGTGTGGGAG AAGACATTAG 480481 AAAACTTGAG CATGGAGTTC ATGTCGTGTC TGGAACTCCT GGCCGAGTCT GTGACATGAT 540541 AAAGAGGAGA ACATTGCGCA CCAGGGCCAT CAAGTTACTA GTTCTGGATG AATCTGATGA 600601 AATGTTGAGC AGAGGGTTTA AAGATCAGAT TTATGATGTG TACAGATATC TCCCACCGGA 660661 TCTTCAGGTT TGCCTGATTT CTGCTACGCT ACCTCATGAA ATTCTGGAGA TGACAAACAA 720721 GTTTATGACA GATCCAGTGA GGATCCTTGT AAAGCGTGAT GAATTGACAT TGGAGGGCAT 780781 CAAGCAATTT TTTGTTGCGG TTGAAAGGGA GGAATGGAAG TTTGATACTC TGTGTGATCT 840841 ATATGATACT CTCACCATTA CTCAAGCTGT TATATTCTGT AACACCAAGC GGAAGGTGGA 900901 CTGGTTAACT GAAAAAATGC GTAACAATAA TTTCACTGTT TCATCCATGC ACGGTGACAT 960961 GCCTCAAAGA GAAAGAGATG CCATTATGAG TGAATTCCGC GTTGGAACAA CCCGAGTATT 10201021 GATAACAACC GATGTTTGGG CTCGTGGCCT TGATGTACAA CAGGTTTCTC TAGTTATCAA 10801081 TTATGACCTT CCAAATAATC GAGAGCTCTA CATTCATCGG ATTGGTCGTT CTGGACGTTT 11401141 TGGACGAAAG GGTGTTGCAA TAAATTTTGT TAAAAGCGAT GATATCAAGA TTTTGAGAGA 12001201 TATTGAGCAA TATTACAGTA CCCAGATTGA TGAGATGCCA ATGAATGTTG CTGATCTTAT 12601261 ATAAAAGGAC AAGGCAGTAT GCTGAGTGGA GTGCGTTTGT CAAATTTGTG GTAGGAATTA 13201321 GTGTTTGATT GTGGTTTCTT TTTGATACTC TGCGATGTTC TTCTGAAACT TTTGACATTT 13801381 GGTGTATTAG ATTTTTAGTG TGCTCGACTG TACCGCAGAG ATAACGTGTT TTTCTTTGCT 14401441 GAAATGGTTG AGACTTGAGA TCAATTTGTA AATTGAGTTG GAATGATTTG TCCATTGCTT 15001501 ACTTTCGATG TGAATATCTA ATTTTGTGAT TCAAGTGATA TGTGATGTTT TGACGAGGTT 15601561 TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紫花苜蓿解旋酶基因M^的用途，其特征在于該 基因在擬南芥中表達，顯著提高其耐單、耐鹽和抗氧化脅迫能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及紫花苜蓿解旋酶基因的克隆、重組及耐逆功能分析與應(yīng)用，屬于分子生物學和生物技術(shù)領(lǐng)域。從紫花苜蓿中提取總RNA，然后將1微克總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)已公布的EST序列設(shè)計一對特異引物，進行常規(guī)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進行序列測定。然后構(gòu)建表達載體pBI221和PBI121分別轉(zhuǎn)化洋蔥表皮和模式植物擬南芥。洋蔥表皮亞細胞定位表明該基因所編碼的蛋白質(zhì)定位在細胞核內(nèi)。表達MH1基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株具有較高的耐旱、耐鹽和抗氧化脅迫能力。因此，該基因轉(zhuǎn)化苜蓿等雙子葉作物，將會改善其耐逆能力，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，從而可以在淡水資源嚴重匱乏的西部地區(qū)以及鹽堿地較多的濱海地區(qū)大面積推廣種植，具有巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。
文檔編號C12N15/10GK101402962SQ20081001367
公開日2009年4月8日 申請日期2008年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月24日
發(fā)明者張憲省, 琰 羅, 高新起 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學