專利名稱：噬菌體tsp4 dna解旋酶和編碼這種解旋酶的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及噬菌體TSP4 DNA解旋酶和編碼解旋酶的多核苷酸，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
解旋酶，即分離核酸雙鏈的一類酶，它參與所有生物的大部分的細(xì)胞途徑。其催化的核心反應(yīng)一般是非常保守的。解旋酶在分解核酸雙鏈(DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA)的同時(shí)伴隨著核苷三磷酸(NTP，通常是ATP)的水解。解旋酶參與細(xì)胞中大多數(shù)核酸代謝過程，包括染色體和質(zhì)粒的復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯，DNA的重組修復(fù)以及RNA的加工等。生物體內(nèi)有許多有解旋酶功能的酶類，原核方面，目前至少12個(gè)假定的解旋酶在大腸桿菌的基因組中被鑒定出來了 ；真核方面，釀酒酵母中編碼解旋酶相關(guān)蛋白的基因超過基因組的2%，由此可推測(cè)解旋酶對(duì)于細(xì)胞的生存發(fā)展起著重要的作用。通過進(jìn)行蛋白氨基酸序列的比較，可以將解旋酶分五大類，其中最龐大的是I和 II解旋酶超家族(SFI和SFII)，這兩類解旋酶中大多數(shù)具有3’-5’極性，其中包含七個(gè) (I，Ia，II，III，IV，V，和VI)所謂的解旋酶特征基序(motif)；在這兩個(gè)超家族中，較保守的AIPase的特征序列Walker A和B序列是I和II基序，在SFI和SF II蛋白中，其他基序并不是高度保守。SF3解旋酶通常來源于DNA或RNA病毒，僅含有I，II和III三個(gè)保守基序，其他解旋酶數(shù)目較少，如五Coli中的DnaB-Iike的六聚解旋酶自成一類；第五類解旋酶，蛋白較小，其中包含細(xì)菌中的終止轉(zhuǎn)錄Mio因子。目前對(duì)于解旋酶解開DNA雙螺旋的機(jī)制還不是很清楚，但是所有的解旋酶還是具有某種共同的特征，具體表現(xiàn)在解開雙螺旋和在單鏈上進(jìn)行移動(dòng)。有報(bào)道解旋酶的機(jī)制可以分為被動(dòng)(passive)和主動(dòng)(aetive)兩種形式。被動(dòng)形式認(rèn)為解旋酶與ssDNA是被動(dòng)的相互作用并且移動(dòng)方向不確定；而目前通常認(rèn)為多聚解旋酶采用主動(dòng)機(jī)制進(jìn)行解旋，它與dsDNA和ssDNA都能結(jié)合?，F(xiàn)在大家普遍認(rèn)可的解旋酶作用模型是“active roling”和 "inchworm，，模型。高溫菌噬菌體TSP4為感染高溫菌菌株Thermus TC16的噬菌體，李秋鵬的碩士論文(昆明理工大學(xué)，2009)中對(duì)該噬菌體基因組進(jìn)行了初步的解析，并公布了 TSP4的DNA解旋酶的部分序列，但僅有這部分序列，解旋酶結(jié)構(gòu)不完整，無活性。所有生物都有相當(dāng)數(shù)量的基因編碼解旋酶，主要是由于它們?cè)趶?fù)制、重組、修復(fù)、 轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪接、mRNA編輯、染色體重建、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解時(shí)所起的重要功能所致，因此解旋酶也成為了科學(xué)界研究的一個(gè)熱點(diǎn)。目前發(fā)展的一種依賴解旋酶等溫PCR技術(shù)，其原理是模擬生物體的DNA復(fù)制，在 PCR體系中加入解旋酶，省去了高溫變性的步驟，使PCR反應(yīng)在一個(gè)溫度下進(jìn)行。因此這種 PCR技術(shù)可以回歸在一個(gè)水域鍋中進(jìn)行，使PCR反應(yīng)不依賴于PCR儀來進(jìn)行。但是由于目前克隆表達(dá)出來的解旋酶大部分是來自常溫微生物，其穩(wěn)定性和耐熱性不是很好，影響著PCR 的反應(yīng)效率，因此從高溫微生物中尋找耐熱的解旋酶是解決上述問題的一個(gè)重要途徑。棲熱菌作為高溫菌的模式生物，其噬菌體的研究也日益增多，從棲熱菌噬菌體中獲得耐熱的解旋酶在依賴解旋酶等溫PCR技術(shù)領(lǐng)域具有重要價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供TSP4噬菌體DNA解旋酶，即包含有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物；該DNA解旋酶分離自高溫噬菌體TSP4，包括其保守性變異多肽、多肽的活性片段。本專利提供了完整的高溫菌噬菌體TSP4解旋酶的基因及其蛋白質(zhì)序列。本發(fā)明中所述多肽、類似物或衍生物的氨基酸序列具有與SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列至少70%的相同性。本發(fā)明中所述DNA解旋酶具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼TSP4噬菌體DNA解旋酶的多核苷酸，其包含選自下組中的一種
(a).編碼具有SEQID NO. 1所示氨基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物的多核苷
酸；
(b).與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸；或
(c).與(a)或(b)有至少70%相同性的多核苷酸。本發(fā)明中所述多核苷酸編碼具有SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列。本發(fā)明中所述多核苷酸序列包含有SEQ ID N0. 2中200-451位的序列或SEQ ID N0. 2中1-1409位的序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有編碼DNA解旋酶的多核苷酸的重組載體，其是由前文所述的多核苷酸與質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體表達(dá)載體構(gòu)建而成的重組載體。將本發(fā)明的解旋酶蛋白序列進(jìn)行保守區(qū)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。其中 150 360 aa屬于P-Ioop NTPase超家族成員。并且在165 aa、187 aa和沘5 aa附近有保守的ATP結(jié)合位點(diǎn)；在165 aa附近Walker A基序，在觀5 aa為Walker B基序。P-Ioop NTPase超家族成員的一個(gè)特點(diǎn)就是含有三磷酸腺苷的結(jié)合位點(diǎn)，分別叫做Walker A基序(GxxxxGK[S/T]，其中χ代表任何殘基)和Walker B基序(hhhh[D/E], 其中h代表疏水殘基)。其中Walker A基序和Walker B基序分別結(jié)合ATP、GTP和Mg2+， 這是解旋酶的重要保守區(qū)域分布情況。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明獲得的DNA解旋酶，通過實(shí)驗(yàn)證明可以作為PCR擴(kuò)增DNA反應(yīng)體系的添加物，提高DNA的解鏈效率，以達(dá)到提高擴(kuò)增效率的結(jié)果，能實(shí)現(xiàn)提高PCR擴(kuò)增DNA片段的效率，也可用于等溫PCR技術(shù)中，在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)DNA擴(kuò)增的一種技術(shù)，這個(gè)反應(yīng)體系中的的關(guān)鍵成分也是DNA解旋酶。


圖1是同位素標(biāo)記法測(cè)解旋酶酶活原理圖。(右圖中“+ ”表示添加解旋酶，“_”表示不添加解旋酶，本圖表示在添加解旋酶的情況下，標(biāo)記的探針從質(zhì)粒DNA上脫離)
圖2是解旋酶基因tsp4-h42保守結(jié)構(gòu)域分析示意圖，圖中顯示解旋酶的重要Motif，包括 ATP 結(jié)合位點(diǎn)、Walker A 和 Walker B。圖3是解旋酶基因tsp4_h42的克隆片段及相關(guān)酶切圖譜。M為Marker， 泳道1為tsp4-h42基因PCR產(chǎn)物，其大小為1224bp，泳道2為pET_23b質(zhì)粒，泳道3為tsp4-h42-pET-23b質(zhì)粒，泳道4為pET_23b質(zhì)粒雙酶切電泳結(jié)果，泳道5為 tsp4-h42-pET-23b雙酶切電泳結(jié)果。圖4是解旋酶基因tsp4_h42表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析檢測(cè)電泳圖，其分子量約為46490道爾頓。圖5是重組解旋酶ATP酶活的測(cè)定示意圖。1為對(duì)照緩沖液+ dsDNA+ ATP + Mg2+ ，2為重組解旋酶+ATP，3為重組解旋酶+ dsDNA + ATP，4為重組解旋酶+ dsDNA + ATP + Mg2+，解旋酶同時(shí)具有ATP酶的活性，通過定磷法測(cè)定磷酸根的釋放，從而證明解旋酶活性的存在，同時(shí)證明解旋酶的活力需要Mg2+的激活。圖6是重組解旋酶tsp4_h42的DNA解旋活性檢測(cè)圖。(圖中的“ + ”和“_”分別表示“添加”和“不添加”右側(cè)對(duì)應(yīng)的反應(yīng)物)，在重組tsp4-h42解旋酶+ dsDNA + ATP + Mg2+ 同時(shí)存在的條件下，tsp4-h42解旋酶表現(xiàn)出雙鏈DNA解旋活力。圖7是重組解旋酶tsp4_h42的DNA解旋活性的原子力顯微鏡觀察圖。在重組解旋酶+ dsDNA + ATP + Mg2+同時(shí)存在的條件下，tsp4-h42解旋酶表現(xiàn)出將雙鏈DNA解旋， 形成復(fù)制泡和復(fù)制叉這兩種典型的DNA解旋形態(tài)。
具體實(shí)施例方式實(shí)例1 :DNA解旋酶的克隆和表達(dá)
一、TSP4噬菌體DNA解旋酶基因的擴(kuò)增，(以噬菌體TSP4DNA為模板)
(1)TSP4噬菌體DNA解旋酶基因擴(kuò)增所用引物序列如下 正向引物5，- CATATGACGGACATAAAGCTGGAG -3，
反向引物5，- CTCGAGGGTAAGAGAGAAATCAAAGTT -3，
(2)擴(kuò)增體系如下
表1 擴(kuò)增反應(yīng)體系組分
權(quán)利要求
1.噬菌體TSP4DNA解旋酶，其特征在于它包含有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA解旋酶，其特征在于所述多肽、類似物或衍生物的氨基酸序列具有與SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列至少70%的相同性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA解旋酶，其特征在于具有SEQID NO. 1所示的氨基酸序列。
4.一種編碼權(quán)利要求1所述DNA解旋酶的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含選自下組中的一種(a).編碼具有SEQID NO. 1所示氨基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物的多核苷酸；(b).與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸；或(c).與(a)或(b)有至少70%相同性的多核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸編碼具有SEQID NO. 1 所示氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸序列包含有SEQID N0. 2中200-451位的序列或SEQ ID N0. 2中1-1409位的序列。
7.一種含有外源多核苷酸的重組載體，其特征在于它是由權(quán)利要求4-6中的任一權(quán)利要求所述多核苷酸與質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體表達(dá)載體構(gòu)建而成的重組載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了噬菌體TSP4 DNA解旋酶和編碼這種解旋酶的多核苷酸，該DNA解旋酶分離自高溫噬菌體TSP4，此DNA解旋酶是PCR技術(shù)中的關(guān)鍵DNA解旋酶，可提高PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA片段的效率，以達(dá)到提高擴(kuò)增效率的目的。
文檔編號(hào)C12R1/92GK102304500SQ20111024799
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月26日
發(fā)明者季秀玲, 張琦, 李秋鵬, 林連兵, 薛寒, 魏云林 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)