專利名稱：從刮宮樣品中獲取人宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于干細(xì)胞分離培養(yǎng)及保存相關(guān)技術(shù)。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞技術(shù)是當(dāng)今生命科學(xué)中最熱門的技術(shù)之一，其研究?jī)?nèi)容幾乎涉及所有生命科學(xué)的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，除了在細(xì)胞治療、組織/器官移植和基因治療中發(fā)揮重要作用外，還在發(fā)現(xiàn)新基因、基因功能分析、發(fā)育生物學(xué)模型及新藥開發(fā)等方面產(chǎn)生重要影響。近幾年來，干細(xì)胞的研究取得了重大突破，1999和2000年，世界最權(quán)威的美國《kience》雜志連續(xù)2年將干細(xì)胞和人類基因組計(jì)劃列為當(dāng)年的10大科學(xué)突破。干細(xì)胞很可能在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引發(fā)革命性進(jìn)步，因而具有不可估量的醫(yī)學(xué)價(jià)值，干細(xì)胞和人類基因組計(jì)劃將同時(shí)成為新世紀(jì)最具有發(fā)展和應(yīng)用前景的領(lǐng)域。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，簡(jiǎn)稱MSCs)是來源于成熟組織中的多能干細(xì)胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，同時(shí)又因?yàn)槠涞兔庖咴远蔀榧?xì)胞移植和組織工程的新型種子細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景。眾所周知，子宮內(nèi)膜細(xì)胞系具有很強(qiáng)的自我更新能力。自1978年I^ianishnikov 提出存在子宮內(nèi)膜干細(xì)胞以來，人們一直沒有停止過研究子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的腳步， 1993-2002子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的存在有了臨床實(shí)踐的支持，進(jìn)一步肯定了研究子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的重要性，直到2004年Chan等證實(shí)了子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的存在，極大的激發(fā)了研究者們的研究熱情。前期子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的研究材料主要是取自體內(nèi)的子宮內(nèi)膜組織，既不方便又限制了研究進(jìn)展。2006年日本研究人員從女性月經(jīng)血中成功提取出干細(xì)胞，掀起了研究經(jīng)血來源子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的熱潮。經(jīng)美日中等多國科學(xué)家的研究證實(shí)在隨女性經(jīng)血脫落的子宮內(nèi)膜組織中，具有相當(dāng)數(shù)量的間充質(zhì)干細(xì)胞——宮內(nèi)膜干細(xì)胞，數(shù)量為骨髓來源的30 倍；這些干細(xì)胞活力更強(qiáng)，更強(qiáng)的自我更新和增殖能力(如心肌細(xì)胞的培育效率為傳統(tǒng)利用骨髓細(xì)胞培育的100倍)，分化潛能更接近胚胎干細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜的再生細(xì)胞 (ERC)不僅具有幾乎每M小時(shí)復(fù)制一次的驚人速率，而且它們產(chǎn)生獨(dú)特生長因子的速率， 比來自于臍帶血的干細(xì)胞要大上10萬倍。從人刮宮術(shù)獲得的體液(包括血液)中就含有隨之一起刮取得到的子宮內(nèi)膜組織，上述理論研究使得從該體液中獲取子宮內(nèi)膜干細(xì)胞成為可能。人流是指用手術(shù)的方法終止妊娠，手術(shù)方法之一就是鉗刮術(shù)，通過刮宮可以在取出少量胚胎組織的同時(shí)獲得一定的子宮內(nèi)膜組織，而隨這些刮取獲得的子宮內(nèi)膜組織一起獲得的體液便成了獲取宮內(nèi)膜干細(xì)胞的最好來源。相比而言，因?yàn)楣w的年齡原因，該干細(xì)胞可能會(huì)擁有更強(qiáng)的增殖能力和更好的活力，除此之外，也可以使得原來被丟棄的體液變廢為寶，無論是從研究角度還是供體角度都是有百利而無一害。如果把這些干細(xì)胞通過科學(xué)的方法儲(chǔ)存起來，在女性未來的一生中，一旦發(fā)生肝硬化、糖尿病、心衰竭、腫瘤等重大疾病或意外嚴(yán)重傷害時(shí)，就可立即做自體干細(xì)胞的移植，恢復(fù)健康，減輕自己及家人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)，還有可能實(shí)現(xiàn)女性夢(mèng)寐以求的“青春常在”、“紅顏永駐”的美好愿望，擁有高品質(zhì)的人生。女性的宮內(nèi)膜干細(xì)胞不但可用于本人，還可為她的子女、相關(guān)親屬(如堂表弟妹，甚至父母)等人的臨床應(yīng)用。由于國內(nèi)實(shí)行獨(dú)生子女政策，一旦患血液系統(tǒng)惡性疾病和遺傳性疾病，就只能采用異基因干細(xì)胞移植，宮內(nèi)膜干細(xì)胞是異基因干細(xì)胞移植最豐富最好的資源。一旦儲(chǔ)存了宮內(nèi)膜干細(xì)胞，就相當(dāng)于為其整個(gè)家族建立了一個(gè)預(yù)防和治療腫瘤及其它相關(guān)需干細(xì)胞治療疾病的生命銀行。儲(chǔ)存的宮內(nèi)膜干細(xì)胞還可供全國和全世界患者選擇作干細(xì)胞移植用， 并逐步替代價(jià)格昂貴、難以找到配型相合的骨髓干細(xì)胞。全世界等待干細(xì)胞移植的患者數(shù)以億計(jì)，僅白血病在我國的發(fā)病率就達(dá)十萬分之三、四，即每年新增四萬名左右的患者，而累計(jì)的白血病患者約有四百萬，其中大部分是兒童，他們都急需通過干細(xì)胞移植來救治。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有干細(xì)胞來源困難或受倫理限制等問題，尋找一種更為高效的來源廣泛且不受倫理限制的宮內(nèi)膜干細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法。在此基礎(chǔ)上，擴(kuò)增和純化干細(xì)胞，并對(duì)所培養(yǎng)的干細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定，從而建立具有干細(xì)胞特性的新型干細(xì)胞株，然后再將優(yōu)質(zhì)的干細(xì)胞資源儲(chǔ)存。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種從刮宮樣品中獲取人宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟1)、樣品收集將人流產(chǎn)物與采集液按照1 0. 9 1. 1的體積比混合；得刮宮樣品；采集液為在每500mL的采集液中含有400單位肝素以及濃度為％ig/mL的環(huán)丙沙星和濃度為lOmg/mL的卡那霉素，其余為DMEM培養(yǎng)基Gnvitrogen公司)；2)、宮內(nèi)膜干細(xì)胞分離培養(yǎng)A、樣本的初處理將刮宮樣品于3 5°C進(jìn)行搖床孵育22 沈小時(shí)，然后進(jìn)行過濾(過濾目的是為了濾除刮宮樣品中的絨毛和蛻膜、胚胎組織)；得濾液；B、利用密度梯度離心法，收集血液中的碎片組織及單核細(xì)胞，依次進(jìn)行以下步驟濾液1500 2500g離心8 12分鐘，分別得位于上層的上清和位于下層的血液；取部分上清用于病毒檢測(cè)，如病毒檢測(cè)為陽性，則結(jié)束整個(gè)操作；如病毒檢測(cè)為陰性，則繼續(xù)進(jìn)行以下操作去除其余上清后，得血液；用PBS緩沖液稀釋血液，PBS緩沖液與血液的體積用量比為1. 5 2. 5 1 ；將稀釋后的血液加至人淋巴細(xì)胞分離液(市購產(chǎn)品)上，稀釋后的血液和分離液的體積比為1.8 2. 2 1，600 IOOOg離心12 18分鐘，離心完畢后，離心管內(nèi)出現(xiàn)明顯的分層；吸出位于中間的單核細(xì)胞層(白膜層)，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞后離心(洗滌2 次，每次均是400g離心10分鐘)，最后用Chang完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液；C、細(xì)胞的培養(yǎng)將上述步驟所得的單細(xì)胞懸液接種于Chang完全培養(yǎng)基中，細(xì)胞接種密度為 IXlO5 lX106/ml，置于37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的(X)2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)時(shí)間為4 5天；Chang完全培養(yǎng)基由以下成分組成65ml的MEM alpha (MEM-alpha培養(yǎng)基， Invitrogen ^w]), 18ml ^ Chang B ( ) (Irvine Scientific ^w]) ,2ml ^ Chang 0( 液)(Irvine Scientific 公司)Uml 的 Penicillin/Str印tomycin (青霉素 / 鏈霉素硫酸鹽，Invitrogen 公司)、Iml 的 L-glutamine (L-谷氨酰胺，Invitrogen 公司，濃度為 200mM) 和15ml的ES-FBS (胎牛血清，Invitrogen公司)；D、細(xì)胞擴(kuò)增和純化待步驟幻的4 5天的培養(yǎng)結(jié)束后，更換培養(yǎng)基，棄除未貼壁細(xì)胞；根據(jù)細(xì)胞生長狀況，每3 4天全量換液一次，待細(xì)胞生長達(dá)到80% 90%融合時(shí)，用重量百分含量為 0. 25%的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，然后按5000 6000個(gè)/cm2密度傳代接種培養(yǎng)，并記為 Pi代；上述過程在37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行；3)、細(xì)胞凍存待上述步驟所得的Pl代細(xì)胞鋪滿瓶底后，用重量百分含量為0.25%的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷的凍存液重懸細(xì)胞，得細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液中細(xì)胞的濃度是1 2*106/ml ；并分裝于4支2ml凍存管中；凍存液為DMSO (Calbiochem公司)與Chang完全培養(yǎng)基按照19的體積比混合而得；將上述細(xì)胞懸液進(jìn)行如下凍存程序(即，將上述4支凍存管放入程控降溫儀進(jìn)行預(yù)冷，開始凍存程序)第一步、4°C，等待(即溫度降至4°C后，進(jìn)入第二步)；第二步、1. O0C /分鐘降至-3. O0C (箱體)；第三步、10. O0C /分鐘降至-20. O0C (箱體)；第四步、1. 0°C /分鐘降至-40. 0°C (箱體)；第五步、10. O0C /分鐘降至-90. O0C (箱體)；第六步結(jié)束；得凍存樣本；將所述凍存樣本放入液氮儲(chǔ)存罐保存。在本發(fā)明中，經(jīng)過培養(yǎng)貼壁生長的部分為目標(biāo)細(xì)胞?，F(xiàn)在世界上大部分干細(xì)胞庫的做法是從人體取得干細(xì)胞(或混有干細(xì)胞的其他組織，人臍帶、羊水、外周血等)后，稍加分離即進(jìn)行凍存，等到需要時(shí)再將凍存的細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)增殖。本發(fā)明的優(yōu)越之處在于從刮宮樣品中取得體液標(biāo)本后，經(jīng)過密度梯度分離后，去除大部分紅細(xì)胞，再進(jìn)行純化擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得純度較高、數(shù)量較大的目標(biāo)細(xì)胞即宮內(nèi)膜干細(xì)胞(人宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞)，再進(jìn)行凍存，這樣就保證了凍存細(xì)胞的質(zhì)量，且以后需要用到該份細(xì)胞，復(fù)蘇后的培養(yǎng)時(shí)間也較其他方法短得多(圖2復(fù)蘇細(xì)胞的生長曲線，顯示細(xì)胞的增殖能力)。本發(fā)明的優(yōu)越之處在于干細(xì)胞資源來自刮宮術(shù)后廢棄的體液，采集方便，變廢為寶，其所含干細(xì)胞含量豐富，增殖較快；通過高效的分離方法能夠保證被儲(chǔ)存的干細(xì)胞的質(zhì)
So在現(xiàn)有技術(shù)中，蛻膜組織和子宮內(nèi)膜活檢組織中分離得到干細(xì)胞沒有進(jìn)行嚴(yán)格的間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定。特別是子宮內(nèi)膜活檢時(shí)，一般是在進(jìn)行常規(guī)例行病理診斷時(shí)順便獲得樣品。而本發(fā)明所采用的是刮宮的方法，從刮宮的體液中分離宮內(nèi)膜干細(xì)胞，進(jìn)過包括微生物的清除、干細(xì)胞鑒定，培養(yǎng)、擴(kuò)增和儲(chǔ)存等技術(shù)。在目前還沒有人報(bào)道。與從經(jīng)血中分離宮內(nèi)膜干細(xì)胞相比，減少了微生物污染的可能性，因?yàn)楣螌m是在無菌的環(huán)境下進(jìn)行的，由此所獲得的細(xì)胞活力更高。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是實(shí)施例1中培養(yǎng)不同時(shí)間的宮內(nèi)膜干細(xì)胞放大100倍的顯微照片；A 為 PO 代換液 4 天，100X ；B 為 Pl 代 3 天，100X ；C 為 P2 代 3 天，100X ；D 為 P7 代 3 天，100X ；E 為 P22 代 3 天，100X ；圖2復(fù)蘇細(xì)胞生長曲線；圖3是實(shí)施例1中流式細(xì)胞分析結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 通過刮宮術(shù)培養(yǎng)獲取人宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增及凍存、復(fù)蘇1)、準(zhǔn)備采集套裝和配制培養(yǎng)基負(fù)壓采集瓶(無菌)。采集液在2000mg的環(huán)丙沙星、5000mg的卡那霉素和400單位肝素中添加DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(即DMEM培養(yǎng)基)，直至定容至500ml，得采集液。S卩，該500ml采集液中含有400單位肝素以及濃度為％ig/mL的環(huán)丙沙星和濃度為 10mg/mL的卡那霉素。使用前，該采集液于2 4°C環(huán)境下存放。配制Chang完全培養(yǎng)基在無菌條件下，在無菌容器中加入65mL MEM-alpha 培養(yǎng)基(MEM alpha, Invitrogen 公司)、18mL Chang B 基液(Irvine Scientific 公司)、2mL Chang C基液(Irvine kientific公司)、ImL青霉素硫酸鹽或者鏈霉素硫酸鹽(Penicillin/Sti^ptomycin，Invitrogen 公司)、lmL 濃度為 200mM 的 L-谷氨酰胺 (L-glutamine, Invitrogen 公司)、15mL ES-FBS (胎牛血清，Invitrogen 公司)，充分混勻， 置4°C冰箱待用。2)、樣品采集在志愿者02歲，已簽訂知情同意書)術(shù)前1個(gè)小時(shí)到達(dá)手術(shù)室。手術(shù)開始前1 分鐘，將負(fù)壓采集瓶放至負(fù)壓吸引器合適的位置。在嚴(yán)格消毒和無痛麻醉下，利用負(fù)壓吸引管吸引子宮腔內(nèi)的胎物至負(fù)壓采集瓶中，再用刮匙清理宮腔并進(jìn)行收集，即，吸出物是由絨毛、蛻膜、子宮內(nèi)膜組織碎片、胚胎組織和一定量的體液(血液)等組成，以此作為人流產(chǎn)物，此為常規(guī)技術(shù)。待手術(shù)結(jié)束后，加等體積的采集液至負(fù)壓采集瓶中(即將人流產(chǎn)物與采集液按照1 1的體積比混合，得刮宮樣品)，保持低溫狀態(tài)(4-10°C )盡快送至實(shí)驗(yàn)室。刮宮樣品送至實(shí)驗(yàn)室后，將負(fù)壓采集瓶中的刮宮樣品轉(zhuǎn)移至新的50ml離心管中， 放入搖床孵育，溫度設(shè)置為4°C。3)、病毒和無菌檢查待刮宮樣品搖床孵育滿24h后，將孵育所得的刮宮樣品先進(jìn)行過濾，以濾除絨毛、 蛻膜、胚胎組織，并將過濾過所得物混勻；2000g離心10分鐘；分別得位于上層的上清和位于下層的血液；取所得的部分上清液按照血培養(yǎng)法進(jìn)行厭氧菌和需氧菌、霉菌檢查，并鑒定，若為陽性結(jié)果，則結(jié)束整個(gè)儲(chǔ)存宮內(nèi)膜干細(xì)胞的程序；同時(shí)，取所得的部分上清液通過ELASA進(jìn)行病毒檢測(cè)，檢測(cè)范圍包括HBsAg、HBcAb、HCVAb、HIV-A、TP-PA、CMV-IgM，若為陽性結(jié)果，則結(jié)束整個(gè)儲(chǔ)存宮內(nèi)膜干細(xì)胞的程序。取位于下層的血液進(jìn)入以下步驟進(jìn)行分離培養(yǎng)。即，進(jìn)行病毒、無菌檢查和進(jìn)行血液分離培養(yǎng)為同時(shí)分別進(jìn)行，由于病毒和無菌檢查需要一定的時(shí)間，如果陽性結(jié)果，則無需繼續(xù)進(jìn)行對(duì)血液的分離培養(yǎng)。4)、宮內(nèi)膜干細(xì)胞分離培養(yǎng)將上述位于下層的血液(即將上述2000g離心10分鐘所得物去除所有的上清后)，利用密度梯度離心分離子宮碎片組織及單核細(xì)胞，具體如下首先用PBS緩沖液按一定比例(PBS緩沖液與血液的體積比為2 1)稀釋血液細(xì)胞，電動(dòng)移液器吹打混勻；得稀釋后血液；在超凈工作臺(tái)中取干凈離心管，轉(zhuǎn)移15mL人淋巴細(xì)胞分離液至每根50ml離心管中；鋪層加樣將稀釋后的血液小心的加至已倒好的人淋巴細(xì)胞分離液上(加樣時(shí)動(dòng)作要輕柔，避免沖散分層液面或與分層液面混合而影響分離效果)，稀釋后血液和人淋巴細(xì)胞分離液的體積比為2 1 ；配平離心管，800g離心15分鐘，離心機(jī)升降速要調(diào)至最低速擋，確保離心穩(wěn)定，分層清晰；提取單個(gè)核細(xì)胞離心完畢后，離心管內(nèi)出現(xiàn)明顯的分層，由下到上依次為紅細(xì)胞層、粒細(xì)胞層、分離液層、單核細(xì)胞(MNC)層和血漿層；吸出單核細(xì)胞層(可見部分碎片組織)把吸管或移液管直接伸入單核細(xì)胞層，先吸該層中央部分細(xì)胞，再吸取四周細(xì)胞，動(dòng)作要輕柔，保證不把該層細(xì)胞吹散。如果分離液層和MNC層呈乳白色，界面不清楚，提示含有較多單核細(xì)胞，酌情吸取分離液層，速度要緩慢，確保不吸取到紅細(xì)胞層；洗滌細(xì)胞吸出的單核細(xì)胞混有部分細(xì)胞分離液，需用PBS緩沖液加以洗滌；用電動(dòng)移液器加PBS緩沖液將細(xì)胞稀釋兩倍以上，混勻，400g離心10分鐘；離心完畢后，小心取出離心管，去除上清；重復(fù)上述步驟一次；細(xì)胞計(jì)數(shù)將以上所得細(xì)胞充分混勻，用臺(tái)盤藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞；接種細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，調(diào)整細(xì)胞密度至2*105/ml接種于75cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)(內(nèi)裝IOml的Chang完全培養(yǎng)基)。當(dāng)然，接種時(shí)的細(xì)胞密度可采用l*105_l*106/ml。 Chang完全培養(yǎng)基的體積比為=Vmem
alpha * ^Chang B * ^Chang C * ^Penicillin/Streptomycin * ^L-glutamine200,1 VES_FBS = 65 18 2 1 1 15 (具體如步驟1)中的配制Chang完全培養(yǎng)基所述)O5)細(xì)胞擴(kuò)增和純化細(xì)胞培養(yǎng)于75cm2培養(yǎng)瓶中(內(nèi)設(shè)含有密度為2*105/ml細(xì)胞的Chang完全培養(yǎng)基10ml)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，瓶蓋擰松半圈，確保瓶?jī)?nèi)空氣與培養(yǎng)箱內(nèi)空氣相通，保持培養(yǎng)箱 37 °C、飽和濕度、CO2體積濃度5%的狀態(tài)開始培養(yǎng)。4天后，從(X)2培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在無菌條件下去除瓶中的培養(yǎng)基，棄除未貼壁細(xì)胞，添加IOmL Chang完全培養(yǎng)基到培養(yǎng)瓶中，再次放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況，每3-4天全量換液一次(即全量更換Chang完全培養(yǎng)基一次)。待細(xì)胞達(dá)到 80%-90%融合時(shí)，在每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入ImLO. 25% (質(zhì)量濃度)的胰蛋白酶消化，水平方向輕輕搖晃，使胰酶鋪滿平底，作用1分鐘后，倒置顯微鏡下觀察消化效果，待大部分細(xì)胞 (即80 % 90 % )縮至圓形后，再加入IOmL Chang完全培養(yǎng)基終止消化；然后按5000-6000 個(gè)/cm2密度傳代接種培養(yǎng)，并記為Pl代。傳代培養(yǎng)過程中，根據(jù)細(xì)胞生長情況，每3-4天進(jìn)行全量或半量換液，直至細(xì)胞再次達(dá)到融合(即細(xì)胞達(dá)到80% -90%融合時(shí))，細(xì)胞鋪滿瓶底，重復(fù)以上操作進(jìn)行傳代，記為 P2代，依此操作進(jìn)行傳代。細(xì)胞原代培養(yǎng)3-4天全量換液后，去除未貼壁細(xì)胞，鏡下觀察，可見較多幾個(gè)細(xì)胞聚集在一起的克隆，細(xì)胞增殖迅速，其倍增時(shí)間大約為M-36小時(shí)，2天后細(xì)胞形態(tài)呈均勻長梭形，培養(yǎng)4-5天后細(xì)胞可達(dá)到80% -90%融合，細(xì)胞呈漩渦狀分布。傳代后細(xì)胞M小時(shí)內(nèi)完全貼壁，3-4天可鋪滿瓶底，繼續(xù)傳代。圖1顯示了培養(yǎng)傳代過程中的細(xì)胞形態(tài)圖A原代培養(yǎng)4天，換液后2天的細(xì)胞形態(tài)圖，可見細(xì)胞形態(tài)較多，有圓形、多角形、梭形等，此時(shí)細(xì)胞較雜；B是Pl代細(xì)胞傳代后3 天的圖，細(xì)胞形態(tài)趨于一致；C是P2代細(xì)胞傳代后3天的圖，D是P7代細(xì)胞傳代后3天的圖， 細(xì)胞呈漩渦狀排列，此時(shí)細(xì)胞純度較高；E是P22代細(xì)胞傳代后3天的圖，細(xì)胞密度較低，增殖速度開始減慢。以上結(jié)果說明，從細(xì)胞形態(tài)來看，本發(fā)明分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合干細(xì)胞的特點(diǎn)，細(xì)胞的增殖能力較強(qiáng)，本發(fā)明中細(xì)胞可傳代至30代左右。6)、細(xì)胞凍存選擇Pl代細(xì)胞進(jìn)行凍存，既保證了凍存時(shí)細(xì)胞的原始狀態(tài)，也能夠使細(xì)胞擴(kuò)增到
足夠數(shù)量級(jí)。每個(gè)試管內(nèi)裝含有密度為1 2*106/ml的Pl代細(xì)胞1ml。具體為在上述步驟幻中，待Pl代細(xì)胞生長至融合80% -90%后，用Iml質(zhì)量濃度為0. 25%的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞。用少量Chang完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺(tái)盤藍(lán)染色，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活率，確定細(xì)胞活率在80 %以上，用Chang完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為 2-4*106/ml，加入等體積預(yù)冷)的2倍濃度的凍存液(20% DMS0)；然后分裝于2ml的凍存管中。采用的凍存液終濃度是含有l(wèi)O^DMSCKcalbiochem公司)的Chang完全培養(yǎng)基 (即，凍存液為DMSO與Chang完全培養(yǎng)基按照1 9的體積比混合而得)；S卩，凍存前細(xì)胞的終濃度為l-2*106/ml。將凍存管放入程控降溫儀進(jìn)行預(yù)冷，開始凍存程序。凍存程序設(shè)置如下
第一步4°C，等待(即溫度降至4°C后，進(jìn)入第二步)；第二步1. O0C /分鐘降至-3. O0C (箱體)；第三步10. O0C /分鐘降至-20. O0C (箱體)；第四步1 · 0°C /分鐘降至-40. 0°C (箱體)；第五步10. O0C /分鐘降至-90. O0C (箱體)；第六步結(jié)束；取出凍存樣本，放入液氮儲(chǔ)存罐(即為-196°C )長期保存。實(shí)施例2、細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)將上述實(shí)施例1所得的凍存的樣本從液氮儲(chǔ)存罐中取出，立即放入37°C水浴中解凍。當(dāng)觀察到凍存管內(nèi)的冰核只有黃豆大小的時(shí)候，將凍存管取出，立刻放入冰水混合物中。在無菌條件下，將凍存管中樣本輕柔吸出，加入一支50mL無菌離心管中，再立即加入 IOmL的Chang完全培養(yǎng)基，充分混勻洗滌，在4°C、IOOOrpm的條件下離心10分鐘，去除管中上清。重復(fù)操作一次。用臺(tái)盤藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及活率分析。按照10000個(gè)/cm2的密度(利用Chang完全培養(yǎng)基)將細(xì)胞接種到75cm2培養(yǎng)瓶中，放入37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5 % 的(X)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況，每3-4天全量換液一次，待細(xì)胞達(dá)到80% -90%融合時(shí)，用濃度為0. 25%的胰蛋白酶消化，以5000-6000個(gè)/cm2密度傳代，復(fù)蘇后細(xì)胞形態(tài)正常，增殖速度沒有改變，傳代至30代左右，細(xì)胞出現(xiàn)老化現(xiàn)象，從圖2復(fù)蘇細(xì)胞的生長曲線看出，細(xì)胞的倍增時(shí)間保持在M-36小時(shí)。實(shí)施例3.流式細(xì)胞檢測(cè)選擇實(shí)施例1中所得培養(yǎng)P5代的宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞按如下步驟進(jìn)行流式檢測(cè)。每個(gè)試管內(nèi)裝有濃度為5*106/ml的P5代細(xì)胞&ι1。1)細(xì)胞懸液制備用Iml的0. 25% (質(zhì)量濃度)的胰酶將細(xì)胞消化下來，500rpm，5min離心，棄上清。 加PBS洗2遍，然后aiil PBS重懸細(xì)胞，從而使細(xì)胞濃度為5*106/ml。2) 4%多聚甲醛(PBS配制)固定15min，然后PBS洗2遍(1500rpm，離心5min)。3)5%的85六固定40111土11。4)根據(jù)流式抗體(直標(biāo))稀釋度要求每IO6個(gè)細(xì)胞/200ul分別加入20ul抗體 (CD29、CD45、CD105、CD117、CD90、CD34、CD73、CD44、HLA-DR)，避光，37°C 孵育 30min。5)用PBS洗一遍，1500rpm，離心5min，棄上清，再加入500ul PBS重懸，準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。6)流式細(xì)胞儀為美國Beckman Coulter公司，型號(hào)FC-500。所用抗體來自于貝克頓迪肯森公司(Becton，Dickinson & Company，富蘭克林湖，NJ)。根據(jù)檢測(cè)的干細(xì)胞大小特點(diǎn)利用前向散射光(FS)、側(cè)向散射光(SS)找到目標(biāo)細(xì)胞群。根據(jù)所選擇的抗體的熒光素標(biāo)記選擇流式檢測(cè)通道，對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的熒光強(qiáng)弱進(jìn)行分析，計(jì)算出細(xì)胞表面標(biāo)記分子的陽性百分比。具體如圖3所示。從以上實(shí)施例可見本發(fā)明方法可以成功從女性經(jīng)血樣品中分離獲得人宮內(nèi)膜干細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)過擴(kuò)增和純化培養(yǎng)可培養(yǎng)至20代；細(xì)胞經(jīng)過凍存后能夠復(fù)蘇繼續(xù)傳代培養(yǎng)， 保持干細(xì)胞形態(tài)。經(jīng)過流式細(xì)胞檢測(cè)，復(fù)蘇細(xì)胞表達(dá)⑶29、⑶105、⑶90、⑶73、⑶44，不表達(dá)⑶34、⑶117、⑶45、HLA(DR-DP-DQ)。表明本發(fā)明能夠建立人宮內(nèi)膜干細(xì)胞株，本發(fā)明的人宮內(nèi)膜干細(xì)胞儲(chǔ)存方法實(shí)際可行，并具有其他細(xì)胞庫儲(chǔ)存方法不具備的優(yōu)點(diǎn)。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.從刮宮樣品中獲取人宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征是包括以下步驟1)、樣品收集將人流產(chǎn)物與采集液按照1 0. 9 1. 1的體積比混合；得刮宮樣品； 所述采集液為在每500mL的采集液中含有400單位肝素以及濃度為％ig/mL的環(huán)丙沙星和濃度為lOmg/mL的卡那霉素，其余為DMEM培養(yǎng)基；2)、宮內(nèi)膜干細(xì)胞分離培養(yǎng)A、樣本的初處理將刮宮樣品于3 5°C進(jìn)行搖床孵育22 沈小時(shí)，然后進(jìn)行過濾；得濾液；B、利用密度梯度離心法，收集血液中的碎片組織及單核細(xì)胞，依次進(jìn)行以下步驟 濾液1500 2500g離心8 12分鐘，分別得位于上層的上清和位于下層的血液；取部分上清用于病毒檢測(cè)，如病毒檢測(cè)為陽性，則結(jié)束整個(gè)操作；如病毒檢測(cè)為陰性， 則繼續(xù)進(jìn)行以下操作用PBS緩沖液稀釋血液，所述PBS緩沖液與血液的體積用量比為1. 5 2. 5 1 ； 將稀釋后的血液加至人淋巴細(xì)胞分離液上，所述稀釋后的血液和人淋巴細(xì)胞分離液的體積比為1.8 2. 2 1，600 IOOOg離心12 18分鐘，離心完畢后，離心管內(nèi)出現(xiàn)明顯的分層；吸出位于中間的單核細(xì)胞層，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞后離心，最后用Chang完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液；C、細(xì)胞的培養(yǎng)將上述步驟所得的單細(xì)胞懸液接種于Chang完全培養(yǎng)基中，細(xì)胞接種密度為1 X IO5 1 X 106/ml，置于37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的(X)2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)時(shí)間為4 5天；所述Chang完全培養(yǎng)基由以下成分組成65ml的MEM alpha培養(yǎng)基、18ml的Chang B、 2ml 的 Chang C、Iml 的 Penicillin/StreptomycinUml 的濃度為 200mM 的 L-glutamine 禾口 15ml 的 ES-FBS ；D、細(xì)胞擴(kuò)增和純化待步驟幻的4 5天的培養(yǎng)結(jié)束后，更換培養(yǎng)基，棄除未貼壁細(xì)胞；每3 4天全量換液一次，待細(xì)胞生長達(dá)到80% 90%融合時(shí)，用重量百分含量為0. 25%的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，然后按5000 6000個(gè)/cm2密度傳代接種培養(yǎng)，并記為Pl代； 上述過程在37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的(X)2培養(yǎng)箱中進(jìn)行；3)、細(xì)胞凍存待上述步驟所得的Pl代細(xì)胞鋪滿瓶底后，用重量百分含量為0. 25%的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷的凍存液重懸細(xì)胞，得細(xì)胞懸液，所述細(xì)胞懸液中細(xì)胞的濃度是1_2*106/ ml ；所述凍存液為DMSO與Chang完全培養(yǎng)基按照1 9的體積比混合而得； 將上述細(xì)胞懸液進(jìn)行如下凍存程序 第一步、4°C，等待； 第二步、1. O0C /分鐘降至-3. O0C ； 第三步、10. O0C /分鐘降至-20. O0C ； 第四步、1. O0C /分鐘降至-40. O0C ； 第五步、10. O0C /分鐘降至-90. O0C ；第六步結(jié)束；得凍存樣本； 將所述凍存樣本放入液氮儲(chǔ)存罐保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從刮宮樣品中獲取人宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟1)將人流產(chǎn)物與采集液按照1∶0.9～1.1的體積比混合；得刮宮樣品；2)宮內(nèi)膜干細(xì)胞分離培養(yǎng)將刮宮樣品經(jīng)搖床孵育后，過濾；得濾液；然后利用密度梯度離心法，收集血液中的碎片組織及單核細(xì)胞；接著進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)以及細(xì)胞擴(kuò)增和純化；3)待上述步驟所得的P1代細(xì)胞鋪滿瓶底后，用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷的凍存液重懸細(xì)胞，得細(xì)胞懸液，將上述細(xì)胞懸液進(jìn)行凍存，將所得的凍存樣本放入液氮儲(chǔ)存罐保存。采用本發(fā)明的方法能獲得純度較高、數(shù)量較大的目標(biāo)細(xì)胞即宮內(nèi)膜干細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK102296048SQ20111024793
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月24日
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