專利名稱：一種快速高效增加質(zhì)粒上基因片段的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種兩步PCR法快速高效增加質(zhì)粒上基因片段的方法，本發(fā)明涉及一種快速高效在質(zhì)粒上任意位置增加基因片段的方法，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成①模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至94°C左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合； ③引物的延伸DNA模板-引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”。通過巧妙設(shè)計增加引物，在質(zhì)粒中任意位置增加基因片技術(shù)變得簡單有效。設(shè)計一對增加引物(正、反向)，用增加引物擴(kuò)增插入基因片段(第一步PCR)，將擴(kuò)增好的基因片段做為引物和模板質(zhì)粒退火后用高保真DNA聚合酶“循環(huán)延伸”(第二步PCR)，(所謂的循環(huán)延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端終止，再經(jīng)過反復(fù)加熱褪火延伸的循環(huán)，這個反應(yīng)區(qū)別于滾環(huán)擴(kuò)增，不會形成多個串聯(lián)拷貝。)正反向引物的延伸產(chǎn)物退火后配對成為帶缺刻的開環(huán)質(zhì)粒。之后用DpnI酶切延伸產(chǎn)物，由于原來的模板質(zhì)粒來源于常規(guī)大腸桿菌，是經(jīng)dam甲基化修飾的，對DpnI敏感而被切碎(DpnI識別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種質(zhì)粒中都會出現(xiàn)，而且不止一次)，而體外合成的質(zhì)粒由于沒有甲基化而不被切開，因此在隨后的轉(zhuǎn)化中得以成功轉(zhuǎn)化，即可得到目標(biāo)片段已插入的質(zhì)粒克隆。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速高效增加質(zhì)粒上基因片段的方法。本發(fā)明的具體步驟如下I)確定增加基因序列；2)引物設(shè)計將增加基因片段的5’端序列與插入位置的上游序列融合成正向引物，將增加基因片段的3’端序列與插入位置的下游序列融合成反向引物；3)第一步PCR擴(kuò)增用設(shè)計的增加引物擴(kuò)增插入基因片段，純化擴(kuò)增好的插入基因片段；4)第二步PCR擴(kuò)增將純化好的插入片段作為引物，與模板質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增步驟與普通PCR —致，但是延伸溫度的時間設(shè)定與該重組質(zhì)粒的長度有關(guān)，一般含7000bp堿基數(shù)的重組質(zhì)粒延伸時間約為5_8min ；5) PCR擴(kuò)增步驟與普通PCR —致，但是PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)一般約為15-20次；
6) PCR擴(kuò)增完成后經(jīng)DpnI酶消化3h后直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。7)選擇陽性克隆測序本發(fā)明所述方法可以增加的堿基序列大小不受限制，只要能進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增就行。PCR擴(kuò)增步驟與普通PCR —致，只是延伸溫度的時間設(shè)定要根據(jù)重組質(zhì)粒的長度而定，PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)也要盡量少一些，一般15-20次為宜，盡量減少引入因PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)過多而引起的其它突變。本發(fā)明的詳細(xì)的步驟為I)確定增加基因序列；2)引物設(shè)計正向增加引物的5’端與插入位點(diǎn)的上游序列互補(bǔ)配對，3’端與插入基因的上游序列互補(bǔ)配對；反向引物的5’端與插入位點(diǎn)的下游序列互補(bǔ)配對，3’端與插入基因的下游序列互補(bǔ)配對； 增加引物設(shè)計時需要注意，引物的5’端與插入載體上互補(bǔ)配對的堿基數(shù)要多一些，一般為25-35bp，引物的3’端與插入目標(biāo)基因互補(bǔ)配對的堿基數(shù)要少一些，一般15_20bpo2)設(shè)定第一步PCR擴(kuò)增程序；
預(yù)變性94°C4 min
變性94°CI min
退火59°CI min
延伸72°C1-2 min
最后延伸72°C2 min“變性-退火-延伸”這個過程進(jìn)行18-20個循環(huán)，延伸時間視擴(kuò)增基因的大小而定，對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，并作為第二次PCR反應(yīng)的引物。3)設(shè)定第二步PCR擴(kuò)增程序；
預(yù)變性94°C4 min
變性94°CI min
退火59°CI min
延伸72°C5-8 min
最后延伸72°C8 min“變性-退火-延伸”這個過程進(jìn)行18-20個循環(huán)。4) PCR擴(kuò)增完成后經(jīng)DpnI酶消化3h后直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；PCR擴(kuò)增完成后，跑DNA凝膠電泳檢驗一下有弱的條帶就可以了。然后再用DpnI酶消化3h，之后可直接轉(zhuǎn)化克隆宿主菌或表達(dá)宿主菌。5)選擇陽性克隆測序。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種快速高效在質(zhì)粒上任意位置增加基因片段的方法。


圖I :兩步PCR法快速高效在質(zhì)粒上任意位置插入基因片段的原理。
具體實施例方式材料和檢測方法吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus WSH03-13)谷氨酸胺轉(zhuǎn)氨酶protg 基因克隆自 Streptomyces hygroscopicus WSH03-13重組質(zhì)粒模板pET_22b (+)。實施例I :I)從NCBI上下載GenBank號為EU477523. I的序列并且識別SEQ ID NO. 2 ；2)引物設(shè)計正向增加引物的5’端與插入位點(diǎn)的上游序列互補(bǔ)配對，3’端與插入·基因的上游序列互補(bǔ)配對；反向引物的5’端與插入位點(diǎn)的下游序列互補(bǔ)配對，3’端與插入基因的下游序列互補(bǔ)配對；增加引物設(shè)計時需要注意，引物的5’端與插入載體上互補(bǔ)配對的堿基數(shù)要多一些，一般為25-35bp，引物的3’端與插入目標(biāo)基因互補(bǔ)配對的堿基數(shù)要少一些，一般15_20bp。上游引物Pl如SEQ ID NO. 3所示；下游引物P2如SEQ ID NO. 4所示。插入位點(diǎn)位于pET22b(+)多克隆位點(diǎn)如SEQ ID NO. I中70位與71位堿基之間。插入序列為protg如 SEQ ID NO. 23)設(shè)定第一步PCR擴(kuò)增程序；
預(yù)變性94°C4 min
變性94°CI min
退火59°CI min
延伸72°C2 min
最后延伸72°C2 min“變性-退火-延伸”這個過程進(jìn)行20個循環(huán)，對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，并作為第二次PCR反應(yīng)的引物。 4)設(shè)定第二步PCR擴(kuò)增程序；
預(yù)變性94°C4 min
變性94°CI min
退火59°CI min
延伸72°C8 min
最后延伸72°C8 min“變性-退火-延伸”這個過程進(jìn)行20個循環(huán)。5) PCR擴(kuò)增完成后經(jīng)DpnI酶消化3h后直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；PCR擴(kuò)增完成后，跑DNA凝膠電泳檢驗一下有弱的條帶就可以了。然后再用DpnI酶消化3h，之后直接轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)表達(dá)宿主菌。6)選擇陽性克隆測序。選擇陽性克隆送生工生物工程上海股份有限公司測序，結(jié)果顯示成功增加了目標(biāo)序列。
權(quán)利要求
1.一種兩步PCR法增加質(zhì)粒上基因片段的方法，是采用一對特異性引物片段，通過兩步PCR實現(xiàn)在質(zhì)粒上任意位置插入基因片段方法。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，兩個特異性引物的設(shè)計。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，將增加基因片段的5’端序列與插入位置的上游序列融合成正向引物，將增加基因片段的3’端序列與插入位置的下游序列融合成反向引物。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，兩個引物擴(kuò)增方向相向。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，兩步PCR法擴(kuò)增得到含增加片段的的重組質(zhì)粒，不需要重疊PCR、酶切、連接等傳統(tǒng)的構(gòu)建方法。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，第一次PCR與普通PCR方法一致，第二次PCR方法與普通PCR方法略有不同，即PCR延伸時間為延伸整個重組質(zhì)粒長度的時間，一般含7000bp堿基數(shù)的重組質(zhì)粒延伸時間約為5_8min。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，PCR方法與普通PCR方法一致，但PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)一般約為15-20次。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增完成后經(jīng)DpnI酶消化3h后直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速高效增加質(zhì)粒上基因片段的方法，是采用兩個特異性引物片段，通過兩步PCR實現(xiàn)將目標(biāo)基因插入到載體質(zhì)粒上，屬于基因克隆技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法操作簡單，具有非常高的效率和成功率。
文檔編號C12N15/10GK102899317SQ201210345249
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者周哲敏, 杜坤, 崔文璟, 周麗, 王益姝 申請人:江南大學(xué)