專利名稱：海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌及其分離純化和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌及其分離純化和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氯氰菊酯含有多個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)，不溶于水，為高親脂性農(nóng)藥，是一種高效、廣譜人工合成擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑，目前被廣泛應(yīng)用于果園、茶園、農(nóng)田以及漁業(yè)養(yǎng)殖等害蟲(chóng)的防治。然而，殘余的氯氰菊酯可通過(guò)地表徑流或養(yǎng)殖海域使用等途徑進(jìn)入水體，給環(huán)境、食品安全和人類健康帶來(lái)極大危害，對(duì)漁業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境造成影響。目前，對(duì)農(nóng)藥的殘留的修復(fù)方法主要有物理、化學(xué)和生物修復(fù)方法，與物理化學(xué)方 法費(fèi)用高、副作用大等相比，生物修復(fù)方法具有高效、成本低、無(wú)二次污染等優(yōu)勢(shì)，尤其是微生物修復(fù)在降解和消除農(nóng)藥殘留方面具有安全、高效等特點(diǎn)，可以農(nóng)藥作為碳源和能源對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行代謝，是治理農(nóng)藥環(huán)境污染的有效生物修復(fù)途徑。因此，篩選不同類型的擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥高效降解菌，對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥殘留的生物修復(fù)和應(yīng)用具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌及其分離純化和應(yīng)用，該降解菌可安全、高效、快速的降解海水環(huán)境中氯氰菊酯，使其降解率達(dá)90%以上。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為一種海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌，該菌為HS-12菌株，分類命名為海環(huán)站菌屬(Mesonia sp.)，于2012年4月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6045，該菌株的16S rRNA 的 Genbank 登陸號(hào)為 JX087927。該菌株的生物學(xué)特征如下革蘭氏陰性，為桿菌，半乳糖甙酶、精氨酸雙水解試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧試驗(yàn)、V-P反應(yīng)、明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性，尿素酶試驗(yàn)、H2S反應(yīng)、色氨酸脫羧酶、吲哚酶試驗(yàn)陰性，不可以利用蔗糖。該菌株海水中生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度25_30°C，最適生長(zhǎng)pH為7. 0-7. 8，在固體培養(yǎng)基上，菌落圓形、較薄，呈白色，半透明。一種海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌的分離純化方法，具體包括如下步驟
(1)培養(yǎng)基配制
將氯氰菊酯溶液加入到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，使氯氰菊酯終濃度為100 mg/L，得到富集培養(yǎng)
液；
(2)降解菌分離純化
取500 mL海水樣品于無(wú)菌狀態(tài)下過(guò)濾富集后，加入到富集培養(yǎng)液中，在溫度28V、轉(zhuǎn)速180 rpm的條件下，培養(yǎng)7 d，重復(fù)上述操作過(guò)程3次，每次培養(yǎng)的接種物均取自前次所得培養(yǎng)液，將最后一次培養(yǎng)所得的培養(yǎng)液稀釋8-10倍后，取100 μ L涂布于含100mg/L氯氰菊酯的固體平板上，28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至菌落單一，將純化后的各菌落分別接至富集培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)，在溫度28°C、轉(zhuǎn)速180 rpm的條件下，培養(yǎng)7 d，通過(guò)氣相色譜-電子捕獲器檢測(cè)各富集培養(yǎng)液中擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥殘留量，最后篩選獲得一株對(duì)氯氰菊酯農(nóng)藥具有高效降解能力的菌株，即氯氰菊酯降解菌HS-12菌株。所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基配制方法如下精確稱取磷酸高鐵O. Olg、蛋白胨5. 0g、酵母膏I. 0g，加入過(guò)濾海水IOOOmL,混合均勻后，調(diào)節(jié)pH為7. 0-7. 8，于121 °C高壓蒸汽滅菌20 min后制得。一種海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌的應(yīng)用，該菌株對(duì)氯氰菊酯具有較高的生物降解能力，可用于氯氰菊酯農(nóng)藥污染的海水及沉積物環(huán)境的生物修復(fù)。
該菌株在溫度25-30°C、pH 7.0-7.8、氯氰菊酯農(nóng)藥濃度10011^/1的條件下，7 d后對(duì)海水中氯氰菊酯的降解率達(dá)到90 %以上。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌，可安全、高效、快速的降解海水環(huán)境中殘留的氯氰菊酯農(nóng)藥，在溫度25-30°C、pH 7. 0-7. 8、農(nóng)藥濃度100mg/L的條件下，7d后對(duì)海水中氯氰菊酯的降解率為達(dá)到90. 1%，進(jìn)一步采用發(fā)光細(xì)菌法研究了微生物降解前后，海水中氯氰菊酯污染的生物毒性，結(jié)果表明，該菌株對(duì)海水中氯氰菊酯具有較好的降解效果，極大的消除了氯氰菊酯及其降解產(chǎn)物的生物毒性。綜上所述，本發(fā)明從海水中分離出氯氰菊酯降解菌，對(duì)海水中氯氰菊酯具有較好的降解效果，對(duì)保護(hù)海洋生態(tài)環(huán)境、水產(chǎn)品安全及人類健康具有重要的意義，同時(shí)為擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥農(nóng)殘降解研究提供了基礎(chǔ)，開(kāi)發(fā)前景廣闊。上述海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌，該菌株分類命名為海環(huán)站菌屬(Mesonia sp.)菌株為HS-12株，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6045，于2012年4月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。


圖I為本發(fā)明HS-12農(nóng)藥降解菌的掃描電鏡 圖2為本發(fā)明氯氰菊酯的標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。具體實(shí)施例一
降解菌株的篩選與鑒定
I、培養(yǎng)基和試劑
營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基精確稱取磷酸高鐵0.01 g、蛋白胨5. O g、酵母膏I. O g，加入過(guò)濾海水1000 mL，混合均勻后，調(diào)節(jié)pH為7.0-7.8，高壓蒸汽滅菌(1211，20 min)后制得。富集培養(yǎng)液在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中加入氯氰菊酯溶液，使得氯氰菊酯的濃度為100 mg/L02、菌株分離純化海水樣品采自寧波近岸海域，取500mL海水于無(wú)菌狀態(tài)下過(guò)濾富集后，加入到含100mg/L氯氰菊酯的富集培養(yǎng)液中，在溫度28°C、轉(zhuǎn)速180 rpm的條件下,培養(yǎng)7d,重復(fù)上述操作過(guò)程3次，每次培養(yǎng)的接種物均取自前次所得培養(yǎng)液，將最后一次培養(yǎng)所得的培養(yǎng)液稀釋10倍后，取100 μ L涂布于含100 mg/L氯氰菊酯的固體平板上，28 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至菌落單一，將純化后的各菌落分別接至富集培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)(28 °C, 180 rpm) 7 d，通過(guò)氣相色譜-電子捕獲器(GC-ECD)檢測(cè)各富集培養(yǎng)液中擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥殘留量，最后篩選獲得一株對(duì)氯氰菊酯農(nóng)藥具有高效降解能力的菌株，命名為HS-12。該HS-12菌株，分類命名為海環(huán)站菌屬(Mesonia sp.)，于2012年4月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6045，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。該菌株的16S rRNA的Genbank 登陸號(hào)為 JX087927。具體實(shí)施例二 高效氯氰菊酯農(nóng)藥降解菌株的鑒定
將上述獲得的菌株進(jìn)行形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定，該菌株的電鏡照片如圖I所示。該菌株的主要生物學(xué)特征為革蘭氏陰性，為桿菌，β-半乳糖甙酶、精氨酸雙水解試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧試驗(yàn)、V-P反應(yīng)、明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性，尿素酶試驗(yàn)、H2S反應(yīng)、色氨酸脫羧酶、吲哚酶試驗(yàn)陰性，不可以利用蔗糖。該菌株海水中生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度25-30 °C，最適生長(zhǎng)pH為7. 0-7. 8，在固體培養(yǎng)基上，菌落圓形、較薄，呈白色，半透明，該菌株經(jīng)16s rRNA序列分析鑒定為海環(huán)站菌屬(Mesonia sp.)。具體實(shí)施例三
氯氰菊酯降解菌對(duì)海水中擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥的降解效果及應(yīng)用將分離、純化后的菌株接種于100 mL含氯氰菊酯100 mg/L的富集培養(yǎng)液中(配制方法如實(shí)施例一所示)，以不接菌的富集培養(yǎng)基作對(duì)照，在28°C、180 rpm的恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，吸取2 mL培養(yǎng)液，加O. 4 g NacL，渦旋混勻，依次采用4 mL的正己烷與丙酮(體積比1:1)的混合溶液和2 mL的正己烷與丙酮的混合溶液萃取，合并兩次萃取所得上清液，取3 mL上清液，加入0.4 g無(wú)水硫酸鈉，氮?dú)獯蹈珊笥肐 mL異辛烷與丙酮(體積比1:1)的混合溶液溶解，供GC-ECD分析檢測(cè)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，通過(guò)考察降解率來(lái)判斷該菌的降解能力。氣相色譜檢測(cè)條件島津GC-2010氣相色譜儀，色譜柱，E⑶檢測(cè)器，進(jìn)樣口溫度2500C，柱溫2400C，檢測(cè)溫度3200C，柱流I. Omg/L,分流比為3:10，載氣為N2 (99. 999%)，進(jìn)樣量為lyL。降解率(％)=(對(duì)照樣品殘留量-處理樣品殘留量)X100/對(duì)照樣品殘留量
氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖如圖2所示，測(cè)得的富集培養(yǎng)基中氯氰菊酯的回收率為98. 2%，變異系數(shù)為2.5%。本發(fā)明菌株在純培養(yǎng)條件下對(duì)100 mg/L的氯氰菊酯的降解率為90. 1%，所有未加菌的空白對(duì)照7d后的水解率均小于5. 0%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該菌對(duì)海水中氯氰菊酯農(nóng)藥殘留具有較好的降解能力，因此，該菌對(duì)環(huán)境中氯氰菊酯農(nóng)藥的降解，尤其是海水養(yǎng)殖環(huán)境污染的修復(fù)具有廣泛的應(yīng)用前景。上述實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于上述實(shí)施例，以權(quán)利要求書(shū)為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌，其特征在于該菌為HS-12菌株，分類命名為海環(huán)站菌屬(Mesonia sp.),于2012年4月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏編號(hào)為CGMCC No. 6045，該菌株的16S rRNA的Genbank登陸號(hào)為JX087927。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌，其特征在于該菌株的生物學(xué)特征如下革蘭氏陰性，為桿菌，半乳糖甙酶、精氨酸雙水解試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧試驗(yàn)、V-P反應(yīng)、明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性，尿素酶試驗(yàn)、H2S反應(yīng)、色氨酸脫羧酶、吲哚酶試驗(yàn)陰性，不可以利用蔗糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌，其特征在于該菌株海水中生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度25-30°C，最適生長(zhǎng)pH為7. 0-7. 8，在固體培養(yǎng)基上，菌落圓形、較薄，呈白色，半透明。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌的分離純化方法，其特征在于具體包括如下步驟 (1)培養(yǎng)基配制 將氯氰菊酯溶液加入到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，使氯氰菊酯終濃度為100 mg/L，得到富集培養(yǎng)液； (2)降解菌分離純化 取500 mL海水樣品于無(wú)菌狀態(tài)下過(guò)濾富集后，加入到富集培養(yǎng)液中，在溫度28V、轉(zhuǎn)速180 rpm的條件下，培養(yǎng)7 d，重復(fù)上述操作過(guò)程3次，每次培養(yǎng)的接種物均取自前次所得培養(yǎng)液，將最后一次培養(yǎng)所得的培養(yǎng)液稀釋8-10倍后，取100 μ L涂布于含100mg/L氯氰菊酯的固體平板上，28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至菌落單一，將純化后的各菌落分別接至富集培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)，在溫度28°C、轉(zhuǎn)速180 rpm的條件下，培養(yǎng)7 d，通過(guò)氣相色譜-電子捕獲器檢測(cè)各富集培養(yǎng)液中擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥殘留量，最后篩選獲得一株對(duì)氯氰菊酯農(nóng)藥具有高效降解能力的菌株，即氯氰菊酯降解菌HS-12菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌的分離純化方法，其特征在于所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基配制方法如下精確稱取磷酸高鐵O. 01 g、蛋白胨5. O g、酵母膏I. O g，加入過(guò)濾海水1000 mL，混合均勻后，調(diào)節(jié)pH為7. 0-7. 8，于121°C高壓蒸汽滅菌20 min后制得。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌的應(yīng)用，其特征在于該菌株對(duì)氯氰菊酯具有較高的生物降解能力，可用于氯氰菊酯農(nóng)藥污染的海水及沉積物環(huán)境的生物修復(fù)。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求6所述的海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌的應(yīng)用，其特征在于該菌株在溫度25-30°C、pH 7. 0-7. 8、氯氰菊酯農(nóng)藥濃度100 mg/L的條件下，7 d后對(duì)海水中氯氰菊酯的降解率達(dá)到90 %以上。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌，該菌株為HS-12株，分類命名為海環(huán)站菌屬(Mesoniasp.)，于2012年4月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.6045，該菌株的16SrRNA的Genbank登陸號(hào)為JX087927，該發(fā)明同時(shí)公開(kāi)了海水環(huán)境中氯氰菊酯降解菌的分離純化方法及應(yīng)用，優(yōu)點(diǎn)是可安全、高效、快速的降解海水環(huán)境中氯氰菊酯，在近海環(huán)境保護(hù)、養(yǎng)殖環(huán)境農(nóng)藥殘留污染治理和保障食品安全方面具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102899269SQ201210345258
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者劉菁華, 史西志, 孫愛(ài)麗, 李德祥, 周磊, 陳炯 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)