專利名稱：細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明是利用中國的五種紅豆杉細胞的生物合成法通過紅豆杉細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法。
紫杉醇是目前國際上公認的有效抗癌新藥，而且紫杉醇又是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能促進微管蛋白聚合并抑制其解聚的天然化合物。因此紫杉醇不僅是抗癌新藥而且是研究微管蛋白結(jié)構(gòu)和功能的新型重要的生物探針。據(jù)文獻報道(J Am Chem.Soc 1971，932325)，1971年Wani等從短葉紅豆杉(T，brevifolia)[又稱太平洋紫杉(Pacific Yew)]的樹皮中分離得到紫杉醇(Taxol)，并且證明了紫杉醇具有抗癌作用。由于紅豆杉樹生長極慢(通常要100-250年才能成材使用)，紫杉醇在植物中含量很低(＜0.02%)，而且分離十分困難。因此，紫杉醇來源稀少，要獲得1公斤紫杉醇需要采集近十噸樹皮，相當于伐掉三千株百年古樹。此外，紫杉醇又難溶于水，故一直未能進行系統(tǒng)的臨床試驗。
由于紫杉醇的顯著的抗癌作用引起了國內(nèi)外的關(guān)注，為解決紫杉醇的藥源，各國紛紛尋找擴大紅豆杉樹栽培以外的新途徑，主要有半合成、全合成及生物合成三條途徑。國內(nèi)八十年代初便開展了從天然紅豆杉樹中提取紫杉醇及其類似物的研究以及紫杉醇的藥理研究，到目前為止，未見有紫杉醇人工合成及生物合成方面的報道。國外由于紫杉醇的抗癌療效臨床試驗受到紫杉醇藥源稀少的限制，很快把目標轉(zhuǎn)向從事紫杉醇及其類似物的半合成、全合成和結(jié)構(gòu)改造。1988年由法國Denis等用從法國漿果紅豆杉(T.baccta)的葉中得到的10-去乙酰baccatin-Ⅲ作為母核，進行半合成，得到紫杉醇(J AM Chem Soc，1988;1105917)。但紫杉醇的半合成仍需要大量的紅豆杉樹針葉為原料，這也極大地限制了半合成的應用前景。紫杉醇的全合成近十年來做了大量的工作，但從1992年9月美國召開的關(guān)于紫杉醇的第二屆國際會議最新文集資料來看，紫杉醇的全合成至今沒有成功。
由于紫杉醇的半合成及全合成出現(xiàn)問題，利用紅豆杉細胞培養(yǎng)生物合成紫杉醇近年來開始受到一些先進國家的重視，美國農(nóng)業(yè)部的一個研究中心，目前已獲得數(shù)十個愈傷組織系，并采用固體和液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到類紫杉醇物質(zhì)，美國威斯康星大學的研究人員提出在含分化型細胞的紅豆杉根瘤系中尋找合成較多紫杉醇的細胞系的方法，但其紫杉醇含量比天然植物低一個數(shù)量級。根據(jù)1992年9月在美國召開的第二屆關(guān)于紫杉醇的國際會議文集所記載，其中大部分是關(guān)于藥理及臨床以及化學合成方面的研究報告，與細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇有關(guān)的共七篇，結(jié)果最好的是在搖瓶中懸浮培養(yǎng)26天的細胞，其紫杉醇含量為細胞干重的0.04%(Cornell Uni.M.L.Shuler et.al);另一結(jié)果為E.R.Wickremensinhe(Pennsylvania State Uni.)在搖瓶中懸浮培養(yǎng)的紅豆杉細胞，其紫杉醇含量為細胞干重的0.01%-0.03%(Agricell Rep.Vol.18.7，1992.July)表明細胞培養(yǎng)生物合成紫杉醇已取得較大進展，細胞中紫杉醇含量已達到天然植物中的水平。
目前國內(nèi)尚無紫杉醇生物合成方面的報道，國外報道細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇情況是所采用的細胞株來源于三種紅豆杉，分別為T.brevifolia(短葉紅豆杉)，T.baccata(漿果紅豆杉)，T.Cuspidata(東北紅豆杉)。培養(yǎng)規(guī)模都在搖瓶水平，未采用反應器培養(yǎng)，因此離細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的中試及生產(chǎn)距離相當遠。其中搖瓶培養(yǎng)細胞生長最好情況是培養(yǎng)26天生物量增至4倍。培養(yǎng)過程皆采用一步法培養(yǎng)，即整個過程只用一種培養(yǎng)基。培養(yǎng)基皆采用通用的MS、B5，沒有培養(yǎng)基方面的詳細研究報道。
由于目前國際上細胞培養(yǎng)紫杉醇的最好結(jié)果是紫杉醇含量為細胞干重的0.04%。且是搖瓶中進行的，還沒有反應器的小試結(jié)果，而且含量在0.04%還達不到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求。有必要進一步篩選細胞株和培養(yǎng)條件。
本發(fā)明目的是提出一種采用來自中國的五種紅豆杉的無性細胞系進行兩步法培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法。
本發(fā)明所采用的細胞株是從中國的五種紅豆杉(4個種和1個變種)的愈傷組織系篩選建立起來的。這五種紅豆杉學名分別是紅豆杉(T.Chinensis(Pilger)Rehd)、東北紅豆杉(T.Cuspidata Sieb et Zucc)、云南紅豆杉(T.Yunnanensis Cheng et L.K.Fu)、西藏紅豆杉(Tasus Wallichiann zucc)、南方紅豆杉(又稱美麗紅豆杉)(T.Chinensis Var.mairei(lemée et levl)Cheng et L.K.Fu)。愈傷組織是從中國的五種紅豆杉不同類型的外植體采用不同方法誘導獲得的，與目前國際上所采用的紅豆杉細胞株來源是不同的。誘導的愈傷組織系經(jīng)過20至60代繼代培養(yǎng)，從中篩選出細胞生長快，合成紫杉醇能力強的無性細胞系。
本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方法是兩步法，即細胞株先在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間以累積生物量，再轉(zhuǎn)入生產(chǎn)培養(yǎng)基促使細胞大量合成紫杉醇。
用本發(fā)明的中國的五種紅豆杉細胞株通過細胞培養(yǎng)生物合成法生產(chǎn)紫杉醇，其具體方法是將固體培養(yǎng)的紅豆杉細胞株經(jīng)無菌操作轉(zhuǎn)入pH為4.5-7.0，含碳源濃度為2-6%(W/V)，無機氮源離子濃度為50-80mM，磷酸鹽濃度為2-8mM，激素水平是2，4-D為0-3.5mg/L，BA為0-3.0mg/L，NAA為0-3.0mg/L，KT為0-2.0mg/L，GA為0-2.5mg/L，ZT為0-3.5mg/L及其它營養(yǎng)源的液體生長培養(yǎng)基進行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20-28℃，光照1000-3000勒克斯，搖床及攪拌式反應器轉(zhuǎn)速為60-250rpm。反應器的通氣量0.05-0.50vvm，培養(yǎng)10-20天后，換生產(chǎn)培養(yǎng)基繼續(xù)懸浮培養(yǎng)，生產(chǎn)培養(yǎng)基是pH為4.5-6.5，含碳源濃度為1-4%(W/V)，無機氮源離子濃度為20-60mM，磷酸鹽濃度為1-4mM，激素種類及水平范圍不變，同時還含有其它營養(yǎng)源的流體培養(yǎng)基，在如上所述的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)10-20天后，收獲細胞，烘干后對細胞培養(yǎng)物中的紫杉醇進行分離提純，經(jīng)重結(jié)晶法得紫杉醇針狀結(jié)晶，采用MS，NMR，紅外光譜等方法對所得的紫杉醇進行了結(jié)構(gòu)鑒定，見

圖1，2，3。結(jié)果證明所得的針狀結(jié)晶為紫杉醇。同時還進行了紫杉醇的活性實驗，結(jié)果見附件。
用本發(fā)明的方法，可得到產(chǎn)量較高的紫杉醇，采用2升有效體積的攪拌式反應器在適宜條件下進行兩步法培養(yǎng)25-30天，細胞生物量增至4倍，細胞培養(yǎng)物中紫杉醇含量達細胞干重0.07%。最好情況可達到細胞干重的0.11%。這一結(jié)果比天然植物中含量高出一個數(shù)量級，而國外目前報道的最好結(jié)果是在搖瓶中一步法培養(yǎng)26天，紫杉醇含量達細胞干重的0.04%，顯然我們的結(jié)果要大大優(yōu)于目前國際上報道的結(jié)果。
本發(fā)明采用與目前國際上所用的完全不同的細胞株，獨特的培養(yǎng)基設計及相應的兩步法培養(yǎng)，在小型生物反應器中取得了優(yōu)于目前國際上報道的在搖瓶水平上得到的結(jié)果。
紫杉醇是國際上公認的近二十年來最有希望成為首選的抗癌新藥，對多種腫瘤有明顯療效，尤其對晚期卵巢癌、乳腺癌和非小細胞肺癌療效更為突出。據(jù)1991年統(tǒng)計，美國每年約有20萬婦女患卵巢癌或乳腺癌，其中5萬人死亡。我國患此類癌癥的婦女估計在百萬人以上。但紫杉醇天然資源極為有限，因植物生長緩慢，難以通過擴大栽培來解決藥源問題。半合成同樣受到天然資源的限制，化學全合成至今沒有取得進展。因此，利用生物合成法采用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇就成為解決紫杉醇藥源的重要途徑。目前由美國國立癌癥研究所(NCI)提供的針劑，每安瓿含30mg紫杉醇，售價105美元，原料藥售價2000美元左右一克，經(jīng)計算，預計用本發(fā)明所述的方法，能進行工業(yè)化生產(chǎn)，大大縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本。初步估算只要目前美國售價的1/4。本發(fā)明是利用中國的五種紅豆杉建立的細胞系，進行細胞培養(yǎng)生物合成紫杉醇。故此方法將可從根本上解決紫杉醇藥源受自然資源限制的問題，從而帶來巨大的社會效益和經(jīng)濟效益，并顯示出不可估量的應用前景。
附圖1紫杉醇的質(zhì)譜圖(MS).
附圖2紫杉醇的核磁共振圖譜(NMR).
附圖3紫杉醇的紅外光譜.
附件紫杉醇的活性實驗報告檢測報告書樣品名稱:紫杉醇晶體及紅豆杉細胞水相提取物.
送檢單位:華中理工大學生物工程系 送檢者:王君健送檢目的:紫杉醇對人宮頸癌細胞(Hela)的殺傷作用.
收樣日期:93年2月2日 報告日期:93年2月15日樣品:A為紫杉醇標準品; B為紅豆杉細胞中提取的紫杉醇晶體;
C為紅豆杉細胞水相提取物(內(nèi)含微量紫杉醇).
檢測方法:細胞培養(yǎng).
檢測結(jié)果如下:
1%甲醇 正常細1000(ng/ml) 500(ng/ml) 250(ng/ml) 50(ng/ml) 對照 胞對照1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 1 2 1 2A - - - - - - - - - + + + +B - - - - - - - - - + + + +C - +-結(jié)論樣品A、B在濃度為250ng/ml時能夠完全殺死Hela細胞;
樣品C只能部分抑制Hela細胞的生長.
權(quán)利要求
1.一種細胞生物合成法生產(chǎn)紫杉醇的方法，其特征在于利用中國的五種紅豆杉愈傷組織系篩選出來的細胞株，采用生長培養(yǎng)基和生產(chǎn)培養(yǎng)基兩步培養(yǎng)法生產(chǎn)紫杉醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于采用的五種紅豆杉是紅豆杉(T.Chinensis(Pilger)Rehd)，東北紅豆杉(T.Cuspidata Sieb et Zucc)，云南紅豆杉(T.Yunnanensis Cheng et L.K.Fu)，西藏紅豆杉(Tasus Wallichiann Zucc)，南方紅豆杉(又稱美麗紅豆杉)[T.Chinensis Var.mairei(Lemee et Levl)Cheng et L.K.Fu].
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第一步采用生長培養(yǎng)基，第二步采用生產(chǎn)培養(yǎng)基的兩步培養(yǎng)法。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于生長培養(yǎng)基的無機氮源離子濃度在50～80mM，磷酸鹽濃度在2～8mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于生產(chǎn)培養(yǎng)基的無機氮源離子濃度在20～60mM，磷酸鹽濃度在1～4mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、4和5所述的方法，其特征在于培養(yǎng)基pH值為4.5-7.0。激素水平采用2.4-D為0-3.5mg/L，BA為0-3.0mg/L，NAA為0-3.0mg/L，KT為0-2.0mg/L，GA為0-2.5mg/L，ZT為0-3.5mg/L。
全文摘要
一種利用從中國的五種紅豆杉愈傷組織系中篩選出來的細胞株，采用兩步法培養(yǎng)，細胞生物合成法生產(chǎn)抗癌新藥紫杉醇的方法。把來自中國的五種紅豆杉的細胞株分別作為種細胞，接入生長培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后，再轉(zhuǎn)入生產(chǎn)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，然后從獲得的細胞培養(yǎng)中將紫杉醇分離提純。應用此法不僅從根本上解決了紫杉醇藥源受到自然資源限制的問題，而且能進行工業(yè)化生產(chǎn)，大大縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本。
文檔編號C12N5/04GK1096820SQ93107539
公開日1994年12月28日 申請日期1993年6月25日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月25日
發(fā)明者王君健, 梅興國, 余龍江, 魯明波, 唐曉紅 申請人:華中理工大學