專利名稱：N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶v蛋白及基因的制作方法
本申請(qǐng)是1992年6月29日申請(qǐng)的U.S.SN.07/905，795的續(xù)展申請(qǐng)。
本發(fā)明的領(lǐng)域?yàn)榈鞍踪|(zhì)糖基化領(lǐng)域，具體涉及特定的酶，即N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶V，該酶參與三天線和四天線N-連接寡糖中β(1，6)分枝結(jié)構(gòu)的形成。領(lǐng)域涉及純化的具活性的酶，大鼠的該酶蛋白的氨基酸順序，編碼活性酶的基因及通過(guò)遺傳工程表達(dá)編碼活性酶的核苷酸順序的細(xì)胞系。
UDP-N-乙酰葡萄糖胺;α-6-D-甘露糖苷β-1，6-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶V(Glc NAc T-V，EC 2.4.1.155)是高爾基酶，負(fù)責(zé)三天線和四天線N-連接寡糖中β(1，6)分枝結(jié)構(gòu)的合成。為方便起見，該酶在下文中簡(jiǎn)稱Glc NAc T-V。已經(jīng)在許多哺乳動(dòng)物組織和細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)Glc NAc T-V的活性。
在用腫瘤病毒、致癌物轉(zhuǎn)化的，或者用某些致癌基因轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，已觀察到膜糖蛋白和糖脂類的改變的糖基化作用。在某些情況下，特定的取代基有量的增加，如唾液酸化作用(sialylation)。在另一些例子中，一些通常僅存以于胎兒組織中寡糖結(jié)構(gòu)重現(xiàn)于腫瘤，如在腺癌中檢測(cè)到某些路易斯組織-血液基團(tuán)抗原。
寡糖的質(zhì)的差別在某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞中也可觀察到。用多瘤病毒或用Rous肉瘤病毒轉(zhuǎn)化的BHK成纖維細(xì)胞，與相應(yīng)的正常細(xì)胞相比，具有分枝程度更多的復(fù)合N-連接寡糖。在三天線和四天線N-連接的寡糖中發(fā)現(xiàn)的β-1，6分枝結(jié)構(gòu)(-[Glc NAc-β(1，6)Man-α(1，6)Man]-)的表達(dá)，在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有所增加。這種增加與Glc NAc T-V的比活性的2-3倍的增加是互相關(guān)聯(lián)的。用多瘤病毒，腺病毒，腫瘤基因DNA，以及用ras或fps/fes致癌基因轉(zhuǎn)化鼠細(xì)胞，同樣導(dǎo)致Glc NAc T-V活性的增加。相反，涉及N-連接糖基化的其他幾種糖基轉(zhuǎn)移酶在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中無(wú)變化。在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，Glc NAc T-V比活性增加的機(jī)制還不清楚。
細(xì)胞表面結(jié)合的寡糖的β(1，6)分枝的增加，至少在某些情況下，與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。β-1，6分枝增加后的水平超過(guò)了在正常組織中的水平，這一點(diǎn)在某些人乳房腫瘤組織中已觀察到。
大鼠腎Glc NAc T-V的純化技術(shù)已經(jīng)公開。(Shoreibah et al.(1992)J.Biol.Chem.2672920-2927)。
本發(fā)明的目的之一在于N-2酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶V以及編碼具有該酶活性的蛋白質(zhì)的DNA順序?；炯儍艉?或重組產(chǎn)生的Glc NAc T-V在體外很有用處，同時(shí)表達(dá)編碼Glc NAc T-V順序的重組宿主細(xì)胞在體外糖基化反應(yīng)方面，是很有用處的。
在此提供了編碼Glc NAc T-V的基因組的和cDNA的順序，Glc NAc T-V酶的氨基酸順序，和通過(guò)遺傳工程表達(dá)編碼活性Glc NAc T-V的順序的重組宿主細(xì)胞。
本發(fā)明同時(shí)提供了對(duì)大鼠腎Glc NAc T-V特異的多克隆和單克隆抗體。這些抗體也可結(jié)合來(lái)自其他哺乳動(dòng)物的Glc NAc T-V，并且在檢測(cè)及分離中很有用。應(yīng)該理解，從不同于大鼠腎臟的其他來(lái)源而得的Glc NAc T-V的分子量，動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及其一級(jí)氨基酸順序，都可以不同于在此公開的有關(guān)大鼠腎臟的該酶的特征。
本發(fā)明的目的之二在于在原核與真核宿主細(xì)胞中通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的Glc NAc T-V。本發(fā)明在此公開了大鼠Glc NAc T-V的完整的氨基酸順序，以及編碼大鼠Glc NAc T-V的完整的核苷酸順序。在此公開了用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生重組的有活性的Glc NAc T-V的示范方法。作為范例的氨基酸順序，編碼Glc NAcT-V的核苷酸順序以及其中的其他順序，正如已有技術(shù)中所知的那樣，可以用于在大量物種中分離Glc NAc T-V編碼順序以及通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生大量有用的Glc NAc T-V。
本發(fā)明的目的之三在于編碼Glc NAc T-V的cDNA克隆和編碼Glc NAc T-V的基因組克隆。針對(duì)大鼠腎Glc NAc T-V的抗體或由此衍生的結(jié)合多肽的抗體，通過(guò)使用已有技術(shù)公知的分析和結(jié)合方法，(例如此處公開的Glc NAc T-V的氨基酸順序的分析)，可以因?yàn)榭贵w與其他Glc NAc T-V的交叉反應(yīng)性而用于檢測(cè)不同于大鼠腎來(lái)源的Glc NAc T-V;或者，這些抗體可用于篩選cDNA表達(dá)文庫(kù)。類似地，本發(fā)明的簡(jiǎn)并寡核苷酸探針和/或編碼順序和/或擴(kuò)增物順序可用于篩選用哺乳動(dòng)物的不同于大鼠腎臟來(lái)源的核酸構(gòu)建的基因組或cDNA文庫(kù)，它們還可用于制備擴(kuò)增用的引物，從以大鼠腎臟或其他哺乳動(dòng)物源制得的mRNA群體中擴(kuò)增編碼Glc NAc T-V的順序。編碼Glc NAc T-V的cDNA和/或基因組順序在指導(dǎo)Glc NAc T-V的重組表達(dá)方面很有用。
本發(fā)明的目的之四在于編碼大鼠Glc NAc T-V的核苷酸順序，以及編碼其他腎椎動(dòng)物，最好在哺乳動(dòng)物的Glc NAc T-V的核苷酸順序。此外提供的編碼大鼠Glc NAc T-V的核苷酸順序編為順序識(shí)別序號(hào)No.15(SEQ IQ NO15)，為從核苷酸299處開始的ATG翻譯起始密碼子到核苷酸2521處的翻譯終止子。熟練的技術(shù)人員都了解，因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，可以有一種以上的核苷酸順序可以編碼同樣的氨基酸順序。這些順序，以及它們的編碼功能相同的Glc NAc T-V的變換順序都能用來(lái)在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)Glc NAc T-V。來(lái)自其他腎椎動(dòng)物，最好是哺乳動(dòng)物的Glc NAc T-V的編碼順序在核苷酸順序水平，與此公開的作為示范的大鼠Glc NAc T-V編碼順序會(huì)是高度同源的。與作為示范的大鼠Glc NAc T-V編碼順序具有不少于70%，較佳為不少于80%，更佳為不少于90%核苷酸同源性的且功能上相同的Glc NAc T-V編碼順序，能夠通過(guò)使用眾所周知DNA-DNA雜交技術(shù)和此處提供的作為示范的大鼠Glc NAc T-V編碼順序，而被從非大鼠細(xì)胞的mRNA源制備的cDNA文庫(kù)中鑒別和分離出來(lái)的。編碼Glc NAc T-V的基因組克隆，同樣在考慮之中，該克隆含有天然的調(diào)控順序。應(yīng)該理解，在編碼Glc NAc T-V的基因組克隆中的所有內(nèi)含子順序都不包括在與示范的全長(zhǎng)的大鼠的編碼順序的順序比較中。
本發(fā)明的目的之五在于含有編碼具酶活性的Glc NAc T-V的第一核苷酸順序以及與天然的Glc NAc T-V編碼順序無(wú)關(guān)的第二核苷酸順序(在此命名為“外源核苷酸順序”)的DNA分子。較佳地，第一核苷酸順序編碼具Glc NAc T-V活性的多肽序列，所述多肽的氨基酸順序如圖8中所示，其順序識(shí)別編號(hào)為NO16(SEQ.ID NO16)。
本發(fā)明的目的之五在于通過(guò)遺傳工程改造的細(xì)胞，其含有帶編碼具酶活性的Glc NAc T-V的第一核苷酸順序及與天然的Glc NAc T-V編碼順序無(wú)關(guān)的第二核苷酸順序的DNA分子。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞是優(yōu)選用于重組表達(dá)Glc NAc T-V編碼順序的。特別優(yōu)選的是COS-7細(xì)胞和CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞。作為示范的大鼠的Glc NAc T-V的氨基酸順序是特別優(yōu)選的，較佳的是由圖8中或順序識(shí)別編號(hào)No15中從核苷酸299到核苷酸2521的示范的核苷酸編碼順序所編碼的。


圖1為用溴化乙錠染色再現(xiàn)的瓊脂糖膠電泳結(jié)果，顯示Glc NAc T-V編碼順序的PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物。泳道1含分子量標(biāo)準(zhǔn)(123級(jí));泳道2和7為以小鼠淋巴瘤細(xì)胞系BW5147總RNA cDNA為模板的擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果;泳道3和8為以小鼠淋巴瘤細(xì)胞系BW5147的聚腺苷酸RNA cDNA為模板的擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果;泳道4和9為以大鼠乳房瘤細(xì)胞系MAT C1總RNA cDNA為模板的擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果;泳道5和10為以大鼠乳房瘤細(xì)胞系MAT C1的聚腺苷酸RNA cDNA為模板的擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果;泳道6和11為無(wú)加入模板的擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果。跑于泳道2-6的反應(yīng)是用引物1(SEQ ID NO5)和反引物2(antiprimer 2)(SEQ ID NO8)作為PCR的引物而進(jìn)行的。跑于泳道7-11的反應(yīng)是用引物2(SEQ ID NO7)和反引物1(SEQ ID NO6)進(jìn)行的。
圖2顯示用放射性標(biāo)記的200擴(kuò)增物(amplimer)(PCR產(chǎn)物)進(jìn)行的Southern雜交的放射性自顯影圖。200擴(kuò)增物是用大鼠乳房瘤細(xì)胞系MAT C1聚腺苷酸RNA cDNA為模板，以引物1(SEQ ID NO5)和反引物2(SEQ ID NO8)為引物制備向得的。圖5A為BglⅡ消化的結(jié)果;圖5B為NcoI/XhaI消化結(jié)果;圖5C為NcoI消化結(jié)果;圖5D為Bam HI/BglⅡ消化結(jié)果。在每一板(panel)中，道1含經(jīng)消化的MAT C1基因組DNA而道2含經(jīng)消化的大鼠肝臟基因組DNA。
圖3為溴化乙錠染色再現(xiàn)的瓊脂糖凝膠電脈結(jié)果，顯示PCR擴(kuò)增大鼠1-EJ文庫(kù)cDNA順序得到的產(chǎn)物。泳道2含分子量標(biāo)準(zhǔn)(分子量標(biāo)記物Ⅱ，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN);泳道2含分子量標(biāo)準(zhǔn)(分子量標(biāo)記Ⅶ Boehringer Mannheim);泳道3含有一份用引物T7473-30(SEQ ID NO11)引物B474-16用(SEQ ID NO10)擴(kuò)增大鼠1-EJ cNA的PCR反應(yīng)的產(chǎn)物。
圖4為放射性自顯影再現(xiàn)的結(jié)果，得自于用引物A474-14(SEQ ID NO9)為探針與從圖3中的凝膠的反方向轉(zhuǎn)移的DNA-Southern雜交。
圖5為溴化乙錠染色再現(xiàn)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，顯示了在圖4的放射性自顯影圖中可見的約為2.1kb的PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物。泳道1含分子量標(biāo)準(zhǔn)(分子量標(biāo)準(zhǔn)物Ⅶ，Boehringer Mannheim);泳道2含有引物T7476-30(SEQ IDNO11)和引物485-26(SEQ ID NO12)擴(kuò)增約2.1kb的PCR片段之后得到的PCR產(chǎn)物;泳道3含分子量標(biāo)準(zhǔn)(分子量標(biāo)記物Ⅱ，Boehringer Mannheim)。
圖6顯示了包含部分Glc NAc T-V編碼順序的幾種序列，此處命名為擴(kuò)增物順序(amplimer sequence)，有小鼠的(SEQ ID NO17)，大鼠的(SEQ ID NO18)，和人的(SEQ ID NO19)。冒號(hào)()表示相同的堿基。在小鼠與大鼠之間有13處差別，在小鼠與人之間有2處差別，這是通過(guò)與已有順序的比較而得出的。
總體上，正如分子生物學(xué)，生物化學(xué)，蛋白質(zhì)化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的一般熟練技術(shù)人員所知，此處使用的術(shù)語(yǔ)都是標(biāo)準(zhǔn)的。為了更加清楚起見，在此定義了一些術(shù)語(yǔ)。使用了標(biāo)準(zhǔn)的簡(jiǎn)寫這些簡(jiǎn)寫與那些經(jīng)該領(lǐng)域的科學(xué)雜志(如，Journal of Biological Chemistry，Science，Nature，等)使用并贊同的簡(jiǎn)寫是一致的。
此外用及的方法或者是特別參考的，或者是充分公知的，在幾本易理解的已出版的方法學(xué)的專輯中的至少一本中是可以找到的。(參見，如Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning.A Laboratory Manual(2nd ed.)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，Innis et al.(1990)PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，Academic Press，New York，New York，以及此處提及的參考文獻(xiàn)，全部結(jié)合參考而使用)。
互補(bǔ)DNA(cDNA)的合成涉及通過(guò)酶反向轉(zhuǎn)錄從供體(donor)細(xì)胞分離得到的mRNA而進(jìn)行的雙鏈DNA順序的體外合成。在本發(fā)明中，聚腺苷酸化的RNA從大鼠1-EJ培養(yǎng)細(xì)胞制備(描述于Peles et al.(1992)Cell 69205-216)。大鼠1-EJ細(xì)胞是用人EJ基因轉(zhuǎn)染的大鼠1的成纖維細(xì)胞。人體EJ基因是活化的Harvey ras基因，據(jù)信可以提高Glc NAc T-V的表達(dá)水平。cDNA分子和/或文庫(kù)能用于分離編碼被選擇蛋白的DNA順序，當(dāng)還不知道該蛋白質(zhì)的完整的氨基酸順序時(shí)。當(dāng)知道了至少一部分氨基酸順序時(shí)，從cDNA文庫(kù)中分離一個(gè)基因相當(dāng)方便，當(dāng)至少一物種的完整的編碼順序已知時(shí)，將更為便利。從反轉(zhuǎn)錄mRNA制備cDNA順序質(zhì)粒文庫(kù)的步驟在本領(lǐng)域是公知的。
多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)提供了另一種cDNA克隆的有力手段，可以擴(kuò)增編碼被選蛋白質(zhì)的順序，當(dāng)被選蛋白質(zhì)的至少一部分順序已知時(shí)。根據(jù)編碼部分氨基酸順序的互補(bǔ)序列，制備簡(jiǎn)并的寡核苷酸。該簡(jiǎn)并的核苷酸(即，一個(gè)順序族)作為引物，用于采用聚腺苷酸RNA cDNA作為模板的PCR合成。其他作為PCR引物的寡核苷酸是從唯一的(即已知的)核苷酸順序衍變而來(lái)的。
表達(dá)指結(jié)構(gòu)基因(編碼順序)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而合成具有Glc NAc T-V生物活性的蛋白質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)控制順序”指控制和調(diào)節(jié)另一DNA順序(即，編碼順序)的轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA順序。當(dāng)表達(dá)控制順序控制和調(diào)節(jié)編碼順序的轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)，該編碼順序是與此表達(dá)控制順序操作性連鎖的。術(shù)語(yǔ)“操作性連鎖的”包括在被表達(dá)的DNA順序前面具有一個(gè)適當(dāng)?shù)钠鹗夹盘?hào)(如，ATG)，以及維持正確的閱讀框架，從而允許在表達(dá)控制順序控制之下的DNA順序的表達(dá)和由DNA順序編碼的所需的產(chǎn)物的生成。如果欲將一基因插入重組DNA分子，而該基因不含合適的起始信號(hào)，那么可以在該基因前插入這樣的一個(gè)起始信號(hào)。
正如此處用到的那樣，外源核苷酸順序是一種在自然界并不與特定的核苷酸順序，如Glc NAc T-V編碼順序共價(jià)連接的順序。外源核苷酸順序的例子包括，但并不于局限于，質(zhì)粒載體順序，并不與特定的Glc NAc T-V天然相關(guān)的表達(dá)控制順序，和病毒載體順序。
類似地，正如此處用到的那樣，外源基因是在特定的重組宿主細(xì)胞中并不天然存在的，但用已有技術(shù)中公知的遺傳工程技術(shù)導(dǎo)入的基因。此處用到的外源基因可以含有Glc NAc T-V編碼順序，該編碼順序在并不與之天然相關(guān)的表達(dá)控制順序的控制下進(jìn)行表達(dá)。
本發(fā)明的另一特征是編碼Glc NAc T-V的順序的表達(dá)。正如已有技術(shù)領(lǐng)域中公知的那樣，DNA順序的表達(dá)可以將它們與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中的表達(dá)控制順序操作性連鎖，然后用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。
大量不同的宿主/表達(dá)載體組合可以用來(lái)表達(dá)本發(fā)明的DNA順序。有用的表達(dá)載體，例如，可以包括染色體的、非染色體的和人工合成的DNA順序的片段。合適的載體包括SV 40的衍生物和已知的細(xì)菌質(zhì)粒，例如大腸桿菌(Escherichia coli)的質(zhì)粒ColE1，pCR1，pBR322，pMB9和它們的衍生物;RP4類質(zhì)粒;噬菌體DNA，例如M13衍生物，噬菌體λ的大量衍生物，如λgt11，和其他噬菌體DNA;從2μ環(huán)衍生而得的酵母質(zhì)粒;可用于真核細(xì)胞，如昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的載體;從質(zhì)粒和噬菌體DNA組合得到的載體，例如經(jīng)修飾可采用噬菌體DNA或其他表達(dá)控制順序的質(zhì)粒;桿狀病毒衍生物;以及類似的載體。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，已有技術(shù)中有大量可用的公知的表達(dá)載體。
眾多的表達(dá)控制順序的任一個(gè)都可以用于這些載體以表達(dá)本發(fā)明的DNA順序。這些有用的表達(dá)控制順序包括，例如用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的SV 40或者腺病毒的早期和晚期啟動(dòng)順序，lac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，TAC或TRC系統(tǒng)，噬菌體λ的主操縱基因和啟動(dòng)子區(qū)域，fd外殼蛋白質(zhì)的控制區(qū)域，磷酸酯酶的3-磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子(如，pho 5)，酵母α-接合因子的啟動(dòng)子，和其他已知的控制原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或它們的病毒的基因的表達(dá)的順序，以及它們的不同組合。熟練的技術(shù)人員都知道，那些表達(dá)控制順序?qū)τ谔囟ǖ妮d體和宿主細(xì)胞是合適的。
眾多的單細(xì)胞宿主細(xì)胞同樣能用于表達(dá)本發(fā)明的DNA順序。這些宿主細(xì)胞包括公知的真核宿主和原核宿主，如E.coli，假單胞菌(Pseudomonas)，芽孢桿菌(Bacillus)，鏈霉菌(Streptomyces)的菌株，真菌如酵母，和動(dòng)物細(xì)胞，如CHO，R1.1，B-W和L-M細(xì)胞，非洲綠猴腎細(xì)胞(如，COS1，COS-7，BSC1，BSC40和BMT10)，昆蟲細(xì)胞(如sf9)和人細(xì)胞和培養(yǎng)的植物細(xì)胞。
應(yīng)當(dāng)理解，并不是載體、表達(dá)控制順序和宿主細(xì)胞的所有組合都能同樣好地表達(dá)本發(fā)明的DNA順序。但是，本技術(shù)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員能夠選擇合適的載體，表達(dá)控制順序和宿主細(xì)胞的組合，而不會(huì)不導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)完成所需的表達(dá)，這沒(méi)有超出本發(fā)明的范圍。
在選擇適合的表達(dá)控制載體中通常要考慮大量的因素。這些因素包括，例如，啟動(dòng)子的相對(duì)強(qiáng)度，它的可控性，與被表達(dá)的特定的DNA順序或基因的相容性，如考慮可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。合適的單細(xì)胞宿主可以通過(guò)考慮以下因素而選擇出與所述的載體的相容性，分泌特性，正確折疊蛋白質(zhì)的能力，發(fā)酵條件，以及被表達(dá)的DNA順序所編碼的產(chǎn)物對(duì)宿主的毒性，表達(dá)產(chǎn)物的純化方便與否。本領(lǐng)域的專家都能找到適合于特定目的的宿主細(xì)胞和表達(dá)機(jī)制。
N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶V.(Glc NAc T-V)表示酶UDP-N-乙酰葡糖胺α-6-D-甘露糖苷β(1，6)-N-乙酰的氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶(EC2.4.1.155)。該酶負(fù)責(zé)在三天線和四天線的N-連接寡糖中發(fā)現(xiàn)的β(1，6)支鏈結(jié)構(gòu)(-[Glc NAc-β-(1，6)Man-α(1，6)-Man]-)的合成。
在重組宿主體系中表達(dá)之后，可以有多種方法分離和純化重組Glc NAc T-V。一種方法包括在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)，裂解細(xì)胞和用常規(guī)手段純化蛋白質(zhì)。此外，人們可以用工程方法構(gòu)建用于從細(xì)胞中分泌所需的DNA順序。參見實(shí)施例11和/或Colley et al.(1989)J.Biol.Chem.26417619-17622，該文獻(xiàn)描述了通過(guò)遺傳工程將人的α-干擾素的可切除的信號(hào)肽加于轉(zhuǎn)移酶DNA順序，從而純化唾液酸轉(zhuǎn)移酶的方法。Larsen et al.(1990)Proc.Natl.A-cad.Sci.USA 876674-6678，提及將蛋白質(zhì)A的DNA順序與墨角藻糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基末端基因融合，然后以外分泌的融合蛋白形式表達(dá)。在這樣的構(gòu)建中，人們可以選擇性地將跨膜區(qū)域從編碼順序的3’端附近除去。分泌之后，蛋白質(zhì)從培養(yǎng)基中純化出來(lái)。對(duì)細(xì)菌表達(dá)體系，有很多類似的方法是可行的。
本技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員都知道，作為示范的大鼠Glc NAc T-V編碼順序，即在此提供的SEQ ID NO15中從核苷酸299至核苷酸2521，是作為其他脊椎動(dòng)物來(lái)源，尤其是哺乳動(dòng)物(包括人)來(lái)源的Glc NAc T-V的代表。此處提供的大鼠Glc NAc T-V的編碼順序是適合用于制備或衍生PCR引物，從而鑒別和/或擴(kuò)增編碼人或其他動(dòng)物Glc NAc T-V的順序，還可以用作雜交探針用以在合適的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)中鑒別編碼人或大鼠，其他哺乳動(dòng)物或其他脊椎動(dòng)物的Glc NAc T-V的克隆。
應(yīng)當(dāng)理解，此處公開的大鼠腎Glc NAc T-V的純化技術(shù)是可以用于純化人的或其他Glc NAc T-V并達(dá)到與大鼠腎Glc NAc T-V相應(yīng)的水平。熟練的技術(shù)人員知道，在分離非示范的Glc NAc T-V酶時(shí)，此處公開的程序的常規(guī)改進(jìn)可以提供更好的結(jié)果。
除了大鼠之外的物種，包括小鼠和人，含有編碼象大鼠Glc NAc T-V一樣催化同樣酶促反應(yīng)的蛋白質(zhì)的基因。這些基因與大鼠編碼Glc NAc T-V的順序有顯著的核酸順序的同源性。在標(biāo)準(zhǔn)的雜交條件下，人們可以使用本發(fā)明的DNA順序作為探針或引物，從而分離出這些同源的基因。本發(fā)明特別關(guān)注并包括這些順序。
對(duì)有限的核苷酸順序資料(“擴(kuò)增物”順序的約160-180個(gè)堿基)，在大鼠(SEQ ID NO17)，小鼠(SEQ ID NO18)，和人(SEQ ID NO19)的編碼順序(用以處公開的引物PCR擴(kuò)增mRNA而得)內(nèi)進(jìn)行比較，揭示了顯著的順序保守性;在大鼠-小鼠以及大鼠-人比較中，觀察到90%核苷酸順序同源性(見圖6)。因此，來(lái)源于脊椎動(dòng)物的Glc NAc T-V編碼順序與此處公開的示范的大鼠Glc NAc T-V編碼順序?qū)⒂酗@著的順序同源性。普通熟練的技術(shù)人員能利用示范的順序，或其部分，最好長(zhǎng)度不少于25-30堿基，在雜交中作為探針從而鑒別編碼Glc NAc T-V的cDNA(或基因組)的克隆。其中，使用合適的已有技術(shù)領(lǐng)域公知的雜交技術(shù)時(shí)，至少與探針順序有70%的順序同源性。熟練的技術(shù)人員知道，克隆的cDNA編碼有功能的Glc NAc T-V酶的能力能方便地測(cè)試出，如此處提及的(見實(shí)施例11)。
適合于檢測(cè)探針與靶順序之間核苷酸順序的同源性不同程度的雜交條件以及理論上的和實(shí)際操作上的考慮因素都已給出，例如參見B.D.Hames和S.J.Higgins(1985)Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，Oxford，和Sambrook et al.(1989)(見前)。在特定的雜交條件下，本發(fā)明DNA順序可與其他具足夠同源性的DNA順序(包括來(lái)自不同物種的同源順序)雜交。已有技術(shù)中公知，雜交條件的嚴(yán)緊程序是雜交所需的同源性程度中的一個(gè)影響因素。熟練的技術(shù)人員的知道如何操作雜交條件，從而使雜交的嚴(yán)緊程度處于所期望的水平(高，中，低)。如果使用高嚴(yán)緊程度條件時(shí)，鑒別和分離來(lái)自其他哺乳動(dòng)物源的Glc NAc T-V基因的嘗試失敗了，那么熟練的技術(shù)人員知道如何降低雜交條件的嚴(yán)緊程度，從而使得具有較低同源程度的順序可與用作探針的順序雜交。選擇探針的長(zhǎng)度和順序?qū)τ谑炀毤夹g(shù)人員而言是輕而易舉的。
當(dāng)使用一個(gè)cDNA文庫(kù)作為Glc NAc T-V編碼順序的來(lái)源時(shí)，熟練的技術(shù)人員會(huì)采取步驟以保證文庫(kù)的高質(zhì)量，即稀有的mRNA有其克隆而大的mRNA(大于約3kb)以全長(zhǎng)cDNA克隆形式存在。如果技術(shù)人員使用市售的或其他來(lái)源的cDNA文庫(kù)的話，他可以選擇一個(gè)符合此處提到的標(biāo)準(zhǔn)的文庫(kù)。提供稀有的和/或大的信息代表是屬于已有技術(shù)的。
本發(fā)明的RNA順序指用重組DNA技術(shù)制備或分離的DNA順序。包括，cDNA順序，用PCR分離得到的順序，從其天然的基因組分離得到的DNA順序以及合成的DNA順序。正如此處用到的那樣，該術(shù)語(yǔ)并不包括天然存在的染色體或基因組。從Glc NAc T-V基因衍變而來(lái)的順序能用于研究在正常細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中以及轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞中Glc NAc T-V表達(dá)的調(diào)控，也能用于設(shè)計(jì)抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制，例如通過(guò)反義RNA或DNA。這些順序還能用于指導(dǎo)Glc NAc T-V的重組合成。
根據(jù)本發(fā)明的重組DNA分子的表達(dá)可包括宿主細(xì)胞對(duì)產(chǎn)物多肽的翻譯后修飾。例如，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，表達(dá)可以包括諸如，多肽的糖基化，脂化或磷酸化，信號(hào)肽順序的蛋白酶能解切除從而產(chǎn)生“成熟的”蛋白質(zhì)。相應(yīng)的，正如此處用到的那樣，術(shù)語(yǔ)“Glc NAc T-V”包括全長(zhǎng)的多肽及其修飾或衍生物，如該多肽的糖基化形成，成熟的蛋白質(zhì)，保留信號(hào)肽的多肽，具有類似的生物學(xué)活性的截短的多肽，以及類似物。在表達(dá)具生物活性糖蛋白的真核細(xì)胞系中的Glc NAc T-V的表達(dá)，如果需要的話，可以允許由Glc NAc T-V介導(dǎo)的支鏈結(jié)構(gòu)的有效的引發(fā)。
大鼠腎是純化Glc NAc T-V的有用的來(lái)源，因?yàn)槟苜?gòu)得相對(duì)大量的該組織。大鼠腎Glc NAc T-V的純化及有關(guān)技術(shù)在Shoreibah et al.(1992)(見前)和實(shí)施例1-5中有描述。對(duì)小鼠、倉(cāng)鼠和大鼠的調(diào)查表明，腎是這些嚙齒動(dòng)物中該酶最豐富的來(lái)源之一。從大鼠腎得到的基本純凈的Glc NAc T-V，在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳時(shí)，占優(yōu)勢(shì)的為69 KDa和75KDa的雙條帶。該酶制劑在20%甘油中于4℃可穩(wěn)定保存數(shù)月。
表1大鼠腎N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶Ⅴ的純化下列結(jié)果以從300克冰凍大鼠腎臟制備而得的酶為基礎(chǔ)。
步驟 體積 蛋白質(zhì) 總活性 比活性 產(chǎn)率 純化ml mg nmol/h nmol/ % 倍(mg·h)大鼠腎丙酮粉 3,300 13,900 2,221 0.16 100 1Triton X-100提取物UDP-己醇胺- 96 38.0 889 23.2 40 145Sepharose抑制制-BSA- 6 0.0078 568 73,000 26 450,000Sepharose為了證實(shí)來(lái)自于兩個(gè)柱純化體系的兩條主要SDS-PAGE條帶(69和75KDa)含有Glc NAc T-V，將一份純化的酶制劑在1ml UDP-己醇胺-瓊脂糖層析柱再次色譜層析。結(jié)合物用若干配體UDP的分段洗脫液進(jìn)行洗脫，而不是用第一次色譜層析中使用的單一濃度的NaCl。在用10mM或20mM濃度UDP洗脫的組分中都幾乎沒(méi)有檢測(cè)到任何活性。50mM UDP將大部分Glc NAc T-V活性物從層析柱上置換下來(lái)。用50mM UDP加150mMNaCl洗脫得到一個(gè)小的洗脫峰。正如通過(guò)銀染所判斷的那樣，再以色譜層析并沒(méi)有導(dǎo)致Glc NAc T-V的純度的進(jìn)一步增加。當(dāng)從兩個(gè)柱純化體得到的樣品材料在抑制劑-BSA親合性層析柱上再次色譜層析時(shí)，也得到了類似的結(jié)果。
一旦Glc NAc T-V被基本純化，分析的條件便可優(yōu)化。酶活性在20%甘油和0.5mg/ml IgG中穩(wěn)定化并有所增加。對(duì)大體純化的Glc NAc T-V，最適pH范圍為6.5-7.0;最適的Triton X-100的濃度范圍在約1.0-1.5%之間。酶活性在約0.2M NaCl時(shí)最大，而在高鹽濃度下被抑制。當(dāng)加入諸如MnCl2，CaCl2和MgCl2時(shí)，二價(jià)最離子對(duì)表觀酶活性只有極小的影響。加入20mMEDTA并不表現(xiàn)抑制。
使用優(yōu)化的分析條件，定出了基本純凈的Glc NAc T-V酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。對(duì)寡糖受體(βGlcNAc(1，2)αMan(1，6)βMan-O-(CH2)8COOCH3)的表觀Km為87μM.，對(duì)UDP-Glc NAc的表觀Km為11.0mM。對(duì)糖核苷酸的表觀Vmax為18.8μmol/(mg·min)。
對(duì)氨基酸順序分析，酶通過(guò)制備性的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)一步純化，使用Applied Biosystems公司的高效電泳儀器(High Performance Electrophoresis Apparatus)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California)。將含酶的組份合并濃縮。接著加入乙醇并降溫至-20℃從而使酶蛋白沉淀。沉淀用離心收集，洗滌并干燥。
嘗試進(jìn)行NH2-末端的氨基酸測(cè)序，但是結(jié)果表明蛋白質(zhì)的N-末端被封閉?；炯儍舻拇笫竽IGlc NAc T-V的樣品用固定化的胰蛋白酶消化，再與固定化的胰蛋白酶分離。然后消化液中的肽用反相HPLC，在2.1×150mm VYDAC C18層析柱上，并用梯度的乙腈洗脫，從而得以分離。選擇了4個(gè)肽的峰作氣相測(cè)序。結(jié)果如下峰 ＃34 AsnThrAspPhePheIleGlyLysProThrLeuArg(SEQ ID NO1)峰 ＃49 AlaIleLeuAsnGlnLysIleGluProTyrMetProTyrGluPheThr(SEQ ID NO2)峰 ＃28 ValLeuAspSerPheGlyThrGluProGluPheAsn(SEQ ID NO3)峰 ＃61 SerAspPro[Cys]TyrAla[Asp]Tyr[Glu]Val(SEQ ID NO4)
括號(hào)內(nèi)的氨基酸殘基表示不太確定。從四個(gè)峰得到的氨基酸的順序在瑞士蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Swiss Protein Data Bank)中進(jìn)行檢索，推導(dǎo)出的簡(jiǎn)并的編碼順序在Genbank data base中進(jìn)行檢索。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有顯著同源的順序。
對(duì)Glc NAc T-V部分氨基酸順序的確定可以得到幾套簡(jiǎn)并的寡核苷酸探針或引物，這樣便能克隆相應(yīng)的cDNA和基因組克隆。這些寡核苷酸可以用來(lái)研究控制編碼Glc NAc T-V的基因的表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯機(jī)制。
根據(jù)相應(yīng)于峰34和身49的內(nèi)部肽的氨基酸順序，設(shè)計(jì)了相應(yīng)的簡(jiǎn)并的寡核苷酸用作PCR擴(kuò)增編碼Glc NAc T-V的cDNA順序的引物。在此使用的核苷酸的簡(jiǎn)寫符號(hào)與IUPAC的慣例是一致的A代表腺嘌呤;C代表胞嘧啶;G代表鳥嘌呤;T代表胸腺嘧啶;I為次黃嘌呤核苷;R為A或G;Y或?yàn)镃或T;H為A或C或T;D為G或A或T;以及N為A或C或G或T。根據(jù)峰34肽的前十個(gè)氨基酸的順序而設(shè)計(jì)出的簡(jiǎn)并的29堿基的寡核苷酸作為引物1(SEQ ID NO5)。引物1的反義對(duì)應(yīng)物(SEQ ID NO6)，此處命名為反引物1，能作為PCR擴(kuò)增存在于聚腺苷酸化的mRNA群體中的編碼Glc NAc T-V的順序。該mRNA群體是從細(xì)胞制備而來(lái)的，這些細(xì)胞包括(但不僅局限于)大鼠腎，小鼠淋巴瘤BW5147細(xì)胞和腹水生長(zhǎng)和大鼠乳腺腫瘤MAT C1細(xì)胞。
引物1AAYACIGAYTTYTTYATHGGIAARCCNAC(SEQ ID NO5)反引物1GTIGGYTTICCDATRAARAARTCIGTRTT(SEQ ID NO6)(反義)根據(jù)與峰49相應(yīng)的肽的最后10個(gè)氨基酸的順序，設(shè)計(jì)了第二簡(jiǎn)并的29堿基的寡核苷酸引物2ATHGARCCITAYATGCCITAYGARTTYAC(SEQ ID NO7)反引物2TCRTAIGGCATRTAIGGYTCDATYTTYTG(SEQ ID NO8)
(反義)上面給出的反義引物同樣能用于PCR擴(kuò)增編碼Glc NAc T-V的mRNA。一個(gè)本領(lǐng)域的普通熟練人員能根據(jù)此處公開的肽順序和/或Glc NAc T-V順序而設(shè)計(jì)出其他的寡核苷酸引物和“反引物”，從而用于引發(fā)PCR合成Glc NAc T-V編碼順序。
反義引物的順序(反引物1和2)，即SEQ ID NO6和SEQ ID NO8)是分別與相應(yīng)引物1和2的順序(SEQ ID NO5和SEQ ID NO7)互補(bǔ)的。不論是有意義的或反義的引物，還是更佳的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物引物1和反引物2，都能作為雜交探針或作為PCR引物，用來(lái)在大鼠腎cDNA文庫(kù)，大鼠基因組文庫(kù)或小鼠文庫(kù)篩選編碼Glc NAc T-V的克隆。引物與反引物的適當(dāng)組合能用來(lái)引發(fā)使用從諸如大鼠腎細(xì)胞聚腺苷酸RNA制備的cDNA的PCR反應(yīng)?？捎眠@些引物和反義引物在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增的順序是那些編碼部分Glc NAc T-V的順序。
為了PCR擴(kuò)增編碼Glc NAc T-V的順序，引物1和反引物2被用來(lái)引發(fā)PCR指導(dǎo)的DNA合成。引物2(SEQ ID NO7)和反引物1(SEQ ID NO6)的組合從兩細(xì)胞系中都不產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。使用從大鼠乳房腫瘤細(xì)胞系MAT C1或從小鼠淋巴瘤細(xì)胞系BW5147制備的聚腺苷酸RNA，用引物1和反引物2進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，得到了約200bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，如圖1所示。大鼠的擴(kuò)增物DNA順序在圖6中給出，即SEQ ID NO18。PCR反應(yīng)中通過(guò)使用55℃而不是50℃作為退火溫度，可以大大降低背景信號(hào)。結(jié)果同樣表明在小鼠和大鼠的Glc NAc T-V編碼順序之間有高度的同源性。因此，此處公開的引物/反引物順序能用于鑒別除了大鼠之外的來(lái)源的Glc NAc T-V基因和編碼順序。
用從MAT C1聚腺苷酸RNA制得的cDNA作為模板，用引物1(SEQ ID NO5)中反引物2(SEQ ID NO8)作為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到的擴(kuò)增物被32P標(biāo)記，用作雜交探針。大鼠MAT C1基因組DNA和大鼠腎基因組DNA在單獨(dú)的核酸內(nèi)切酶反應(yīng)中被消化，片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電脈平行分開，并印跡于支持物，然后在低嚴(yán)緊程度的標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下進(jìn)行DNA-DNA雜交。雜交模式與編碼Glc NAc T-V的單遺傳座位十分相符。圖2顯示了用大鼠乳房腫瘤細(xì)胞系MAT C1與大鼠肝臟基因組DNA的Southern雜交的放射性自顯影圖。用Bgl Ⅱ，Bam HI/Bgl Ⅱ和NcoI消化，單一的雜交基因組條帶的大小在2kb-10kb之間。再NcoI/XhaI消化，雜交條帶的大小大約在6-9kb之間。常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法能更精確地估計(jì)條帶大小。在本實(shí)驗(yàn)中用到的約180bp的擴(kuò)增能用于篩選cDNA或基因組文庫(kù)以鑒別Glc NAc T-V順序。能進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的“步行”(“Walking”)實(shí)驗(yàn)法以得到在雜交片段兩側(cè)的順序(在克隆了該片段之后)，從而分離完整的基因。
具有引物1和2(SEQ ID NO5和7)或反引物1和2(SEQ ID NO6和8)的順序，或者較佳地用引物1和反引物2作為引物而得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(即擴(kuò)增物)，標(biāo)記后，能成功地作為雜交探針用于從不同來(lái)源制備而得的cDNA文庫(kù)中篩選出編碼Glc NAc T-V的順序，這些來(lái)源包括小鼠淋巴瘤BW5147細(xì)胞，小鼠3T3細(xì)胞和腹水生長(zhǎng)的大鼠乳腺M(fèi)AT C1細(xì)胞。
當(dāng)來(lái)自于部分小鼠cDNA克隆的編碼區(qū)域的Hind Ⅲ/Bgl Ⅱ限制性片段作為雜交探針，用于被瓊脂糖凝膠電泳分開的大鼠腎mRNA的Northern印跡時(shí)，與明顯的降解產(chǎn)物一起出現(xiàn)了一條約7kb的條帶。因此，Glc NAc T-V mRNA的尺寸是大的，在制備(或選擇)cDNA文庫(kù)(從該文庫(kù)分離分全長(zhǎng)的Glc NAc T-V編碼順序)時(shí)應(yīng)格外小心。
實(shí)施例7-10描述了采用PCR-cDNA策略成功鑒別和克隆大鼠Glc NAc T-V編碼順序的各步驟。在其他實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)PCR制得約170-200堿基的擴(kuò)增物。該擴(kuò)增物用來(lái)篩選小鼠cDNA文庫(kù)，并分離到約1.7kb的部分克隆。順序分析表明該長(zhǎng)的開放閱讀框架中并不含起始密碼子，通過(guò)開放閱讀框架決定了約300個(gè)氨基酸。從大鼠1-EJ細(xì)胞的mRNA制備cDNA文庫(kù)，再?gòu)膩?lái)自該cDNA文庫(kù)的子集(subsets)的DNA克隆的培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒DNA，使用該質(zhì)粒DNA進(jìn)行了一系列的PCR擴(kuò)增和篩選步驟(見實(shí)施例7-8)。
帶有全長(zhǎng)Glc NAc T-V編碼順序的約4.8kb的大鼠cDNA克隆被分離出。一部分cDNA被測(cè)序，得出的DNA順序顯示于SEQ ID NO15。編碼順序從位于核苷酸299開始的ATG起始密碼子一直延伸至核苷酸2521處的終止密碼子。6個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)在天冬酰胺殘基處，即氨基酸編號(hào)109，114，117，333，430和446。推定的跨膜區(qū)域包括氨基酸14-30。大約有300 bp 5′不翻譯順序，在其后為2220 bp的編碼順序和約100 bp 3′不翻譯區(qū)域。
推導(dǎo)出的氨基酸順序(84，561)給出于SEQ ID NO16。預(yù)計(jì)的編碼Glc NAc T-V的分子量比在SDS-PAGE凝膠電泳中觀察到的蛋白質(zhì)條帶的分子量要大。當(dāng)在大量過(guò)量的混合蛋白酶抑制劑的存在下從大鼠腎純化Glc NAc T-V時(shí)，除了69 KDa和75 KDa的條帶之外，還觀察到一絳約95 KDa的條帶。當(dāng)使用具放射活性的光親和(photoaffinity)活性位點(diǎn)標(biāo)記物標(biāo)記活性酶時(shí)，所有的三條帶都被標(biāo)記。這些觀察結(jié)果暗示著，75 KDa和69KDa條帶代表了更大的蛋白質(zhì)的蛋白酶水解片段。95 KDa條帶似乎代表了SEQ ID NO15編碼的多肽的糖基化的形式。鑒定了6個(gè)潛在N-連接糖基化位點(diǎn)即位于SEQ ID NO16中氨基酸順序109，114，117，333，432和446位于的天冬酰胺殘基。通過(guò)使用kyte和Doolittle的方法而進(jìn)行的疏水性分析鑒別出一個(gè)可能的跨膜區(qū)域，即從氨基酸14-30，這個(gè)提出的跨膜區(qū)域具有Ⅱ型膜蛋白的特征，并且與高爾基體腔的其他酶相似。
在推導(dǎo)出的大鼠Glc NAc T-V的氨基酸順序(SEQ ID NO16)中，與峰＃S34，49和28相對(duì)應(yīng)的順序分別為氨基酸546-557，592-607和375-386。峰＃61的氨基酸順序(SEQ ID NO4)位于SEQ ID NO16中的氨基酸168-177?？隙税腚装彼岷凸劝滨０窔埢奈恢?。以SEQ ID NO15為基礎(chǔ)，在SEQ ID NO4中第九位的氨基酸被推導(dǎo)為甘氨酸，而不是谷氨酸。
在生物學(xué)領(lǐng)域，有一點(diǎn)是公知的，即在一個(gè)蛋白質(zhì)內(nèi)的某些氨基酸可被取代而不影響該蛋白質(zhì)的功能。最后這樣的取代是大小和/或電荷特性相似的氨基酸。例如，Dayhoff et al.(1978)在Atlas of Protein Sequence and Structure，第5卷，補(bǔ)充3，第22章，345-352頁(yè)中(該內(nèi)容在此作為參考結(jié)合使用)提供了氨基酸取代的頻率表，能用作氨基酸相似性的衡量標(biāo)準(zhǔn)。Dayheff et al的頻率表是根據(jù)大量進(jìn)化上不同來(lái)源但卻有同樣的功能的蛋白質(zhì)的氨基酸順序的比較得出的。
兩個(gè)小鼠Glc NAc T-V部分克隆被順序。將推導(dǎo)出的小鼠編碼順序與SEQ ID NO15和16中的相應(yīng)的大鼠Glc NAc T-V氨基酸387-740進(jìn)行比較。從初步測(cè)得的比較中，得到的小鼠順序的推導(dǎo)的氨基酸唯一的差別在對(duì)應(yīng)于大鼠氨基酸679處。推導(dǎo)的大鼠的氨基酸為異亮氨酸，而小鼠的氨基酸為蘇氨酸。對(duì)得到的核苷酸順序的編碼區(qū)域的比較表明，約有95%的順序同源性。將得到大鼠的103個(gè)堿基順序與小鼠的3′非編碼區(qū)域的比較表明約有88%的順序同源性。因此，小鼠和大鼠的編碼和非編碼順序(3′端的)是高度保守的，尤其編碼區(qū)域，(其核苷酸的差別)除一外之處，所有的核苷酸差別都是同義突變。
由部分DNA順序分析確定的含有表現(xiàn)全長(zhǎng)Glc NAc T-V編碼順序的4.8 kb cDNA插入片段被亞克隆入pJT-2表達(dá)載體并用電穿孔法導(dǎo)入COS-7細(xì)胞(見實(shí)施例11)。在電穿孔法導(dǎo)入后培養(yǎng)3或4天，收獲轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，冰凍，隨后測(cè)定Glc NAc T-V活性。用pJT-2但不插入DNA的平行制備的轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照。估計(jì)約3%的細(xì)胞被有效地用電穿孔法導(dǎo)入。表2中的數(shù)據(jù)表明，克隆的大鼠cDNA片段編碼有功能的Glc NAc T-V酶。
表2在瞬間表達(dá)分析中的Glc NAc T-V的活性樣品 電穿孔導(dǎo)入后的培養(yǎng)小時(shí) 比活性(pmol/mg*hr)COS-7(pJT-2) 68 3892 65COS-7(pJT-2-TV) 68 62492 499對(duì)于普通熟練的技術(shù)人員而言，出于所需目的而使用此處提供的DNA順序信息優(yōu)化Glc NAc T-V在特定的表達(dá)載體和細(xì)胞系中的表達(dá)，將只是常規(guī)實(shí)驗(yàn)而已。通過(guò)遺傳工程從而含有并穩(wěn)定表達(dá)Glc NAc T-V編碼順序的細(xì)胞系能用于重組表達(dá)具有(依賴于Glc NAc T-V的糖蛋白修飾的)糖基化特征的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。任何該領(lǐng)域公知的手段都能用于將可表達(dá)的Glc NAc T-V編碼順序引入細(xì)胞，從而產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，即通過(guò)遺傳工程構(gòu)建一個(gè)這樣的宿主細(xì)胞。可高水平表達(dá)Glc NAc T-V的重組宿主細(xì)胞能用作純化Glc NAc T-V的來(lái)源，比如，用于研究Glc NAc T-V活性的抑制劑，從而防止或減緩腫瘤的轉(zhuǎn)移。Glc NAc T-V的編碼順序能用于制備與Glc NAc T-V特異的反義結(jié)構(gòu)，從而在所需要的地方例如，在轉(zhuǎn)移中的腫瘤中抑制Glc NAc T-V的表達(dá)。
出于闡述和實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的提供以下實(shí)施例。這些實(shí)施例并不用來(lái)限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中用到許多公知的，而且對(duì)分子生物學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是可以理解的技術(shù)。對(duì)于熟練的技術(shù)工人來(lái)說(shuō)，有一點(diǎn)是十分明顯的，即能對(duì)此處公開的方法進(jìn)行修改，并且能對(duì)DNA順序進(jìn)行修改，并保留所期望得到的結(jié)果。對(duì)于本領(lǐng)域的普通熟練技術(shù)人員而言，有一點(diǎn)很明顯，即在此公開的核苷酸順序及氨基酸順序使得重復(fù)實(shí)施例來(lái)實(shí)施本發(fā)明變得沒(méi)有必要了。所有在此說(shuō)明書中提及的參考文獻(xiàn)在此以參考形式一起表述。
實(shí)施例1 UDP-己醇胺瓊脂糖的制備按Barker et al.(1972)J.Biol.Chem.2477135-7147所述方法制備UDP-己醇胺并將其偶聯(lián)到CNBr激活的瓊脂糖凝膠4B(SEPHAROSE 4B)上。SEPHAROSE(Pharmacia，Piscataway，N.J.)的取代以每毫升沉降的凝膠14μmol UDP-己醇胺的水平為臨界點(diǎn)，每毫升6μmol和9μmol的取代水平只得到明顯低活性產(chǎn)量。
實(shí)施例2 從大鼠腎臟提純GlcNAc T-V冰凍的大鼠腎臟購(gòu)自Pel冷凍生物有限公司(Rogers Arkansas)。
在4℃下，在Waring混合器中，將300g冰凍大鼠腎臟用3升冷丙酮制成勻漿。除非另指，以后的步驟均在4℃下進(jìn)行。在Whatman 4號(hào)濾紙上收集丙酮不溶物。將丙酮不溶物在丙酮中再勻漿，再過(guò)濾。所得粉末在1.8升緩沖液A〔0.1M乙酸鈉(pH6.0)，0.2M Nacl，0.01m EDTA〕中攪拌30分鐘。在7100×g下離心15分鐘收集存留物。沉淀用緩沖液A再提取并再離心。
然后將所得沉淀在2升水中攪拌，并離心收集。在洗滌過(guò)的存留物中加入如下蛋白酶抑制劑0.1mM PMSF、0.05mM/ml抑蛋白酶肽(apzotonin)、0.5mg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑、0.5μg/ml亮抑蛋白酶肽(leupaptin)和1μg/ml胃蛋白酶抑制劑(pepstatin)。然后將此混合物在1升緩沖液B〔0.01M Tris-HCl(pH7.8)，0.4M KCl〕中制勻漿。
將所得勻漿在1%TritonX-100(W/V)中攪拌30分鐘。懸浮液在7100xg下離心20分鐘，得第一提取液(上清液)。將顆粒再勻漿兩次，用TritonX-100溶解，用離心法使其澄清，得到第二和第三提取液。
合并三次提取液，用20升緩沖液C〔50mM MES(pH6.5)，0.2%(W/V)TritonX-100，5mM EDTA，0.05%疊氮鈉〕透析72小時(shí)以上，透析緩沖液換一次。所得透析物經(jīng)離心達(dá)到澄清，然后測(cè)定蛋白質(zhì)濃度和酶活性。
在第一步親和層析中，將3升丙酮粉末Triton提取液加到用緩沖液C預(yù)平衡的1.2×7cm UDP-己醇胺瓊脂糖(Sepharase)柱上。用約400ml緩沖液C洗柱，然后用緩沖液C+0.5M Nacl洗脫。收集各級(jí)份，測(cè)定GlcNAc T-V活性。
將從UDP-己醇胺瓊脂糖柱上洗脫下來(lái)的活性級(jí)份合并(約100ml)，用緩沖液C透析。將透析物轉(zhuǎn)到1mM UDP-GlcNAc和20%甘油中，加到用緩沖液D(50mM MES，pH6.5;0.1%Triton X-100;20%甘油;0.05%疊氮鈉)預(yù)平衡的1.2×3cm抑制劑-BSA-瓊脂糖(Sepharose)柱上，再用無(wú)UDP-ClcNAc的20ml緩沖液D洗柱。最后停柱，回至室溫中，然后用pH已調(diào)至8.0的含500mM NaCl的緩沖液D洗脫。收集各級(jí)份，測(cè)定GlcNAc T-V活性。
將從抑制劑-BSA親和層析柱上得到的活性級(jí)份合并，取其中1份(0.1ml)用緩沖液C透析，并加到用緩沖液D預(yù)平衡的0.4×8cm UDP-己醇胺瓊脂糖柱上。然后將柱用在緩沖液D中UDP含量漸增(10mM UDP，20mM UDP，50mM UDP+120mM NaCl，最后是100mM UDP+150mM NaCl)的緩沖液進(jìn)行洗脫。收集各級(jí)份，測(cè)定GlcNAc T-V活性。(在這一提純步驟中，既可用緩沖液D洗脫，也可用如下洗脫液洗脫50mM卡可酸鈉，pH6.5;0.1%Triton X-100;20%甘油;0.05%疊氮鈉，其中含有如上緩沖液D洗脫液中那樣增大的NaCl濃度。)用真空離心蒸發(fā)濃縮器(Speed Vac.)(快速真空干燥器)將等量的每一級(jí)份通過(guò)減壓、升溫濃縮。將濃縮的樣品在一倍凝膠樣品緩沖液中煮沸使蛋白質(zhì)還原及變性后，在10%SDS-丙烯酰胺凝膠上將各種級(jí)份進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Laemmli(1970)Nature 227680-685)。按Morrisey(1981)Anal.Biochem.117307-310所描述的方法，將凝膠作銀染，以顯現(xiàn)物質(zhì)。
實(shí)施例3 GlcNAc T-V活性測(cè)定在提純過(guò)程中測(cè)定活性的典型放射化學(xué)測(cè)定法包括如下試劑，它們?cè)?.5ml錐形離心管中真空干燥2mM ADP(焦磷酸酶抑制劑)，2.5mM β-甲基GlcNAc(β-(氨基己糖苷酶)抑制劑)，106cpm UDP-〔6-3H〕-GlcNAc(10cpm/pmol)和1mM合成的受體(β-D-GlcNAc)-(1，2)-α-D-Man-(1，6)-β-D-Man-O-(CH2)8CO2Me，總體積為10μl。
為了啟動(dòng)反應(yīng)，將0.01ml樣品〔在含50mM MES(pH6.0)，0.1%Surfact-Amps(Triton)X-100(pierce，Rockford，Illinois)的緩沖液中〕加到干試劑中，于37℃下溫育幾小時(shí)。
加0.5ml水到每一管中，充分混旋，以終止反應(yīng)，將管中的內(nèi)容物離心。然后將上清液加到用甲醇活化并用水預(yù)平衡的C18 Sep-Pak薄膜柱(Millipore，Bedford，Massachusetts)上。用200ml水洗柱以除去來(lái)自未反應(yīng)底物和降解產(chǎn)物的水溶性放射活性物質(zhì)。然后用0-100%甲醇梯度洗脫GlcNAc T-V反應(yīng)的放射標(biāo)記產(chǎn)物，用液體閃爍計(jì)數(shù)對(duì)放射活性進(jìn)行定量。所有測(cè)定試驗(yàn)均采用雙管法，結(jié)果求平均值。為了制作表1，至少進(jìn)行兩次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果加以平均。從雙管法得到的數(shù)值或單獨(dú)實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)值之間的差值不超過(guò)±10%，典型地為小于平均值的±2%。
然后，借助疏水基團(tuán)，用C-18層析將放射標(biāo)記產(chǎn)物從未反應(yīng)的受體和放射標(biāo)記的UDP-GlcNAc中分離出來(lái)。
一旦GlcNAc T-V蛋白被提純，測(cè)定中的以下參數(shù)為最佳20%甘油，近生理水平的NaCl(約200mM)，0.5mg/ml IgG，pH約6.5-7.0，Triton X-100濃度約1.0-1.5%。
用Crawely et al.(1990)Analytical Biochem.185112-117所描述的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定GlcNAc T-V蛋白。該ELESA使用未標(biāo)記的UDP-GlcNAc和連結(jié)于BSA的三糖受體(β-D-GlcNAc)-(1，2)-α-D-Man-(1，6)-β-O-Man-D-(CH2)8CO2Me。本試驗(yàn)依賴于使用對(duì)GlcNAc T-V反應(yīng)的四糖-BSA產(chǎn)物有特異性的多克隆抗體。由于ELISA的高度敏感性，例如，含抑制量NaCl的柱級(jí)份可以不經(jīng)預(yù)先透析而采用簡(jiǎn)單地稀釋樣品的方法進(jìn)行試驗(yàn)。在每一試驗(yàn)中作出標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，通過(guò)與放射化學(xué)試驗(yàn)測(cè)得的已知GlcNAc活性的樣品所得到的數(shù)值進(jìn)行比較，將吸附(或相應(yīng)的活性)與比活性相關(guān)連。
實(shí)施例4 小量蛋白質(zhì)的測(cè)定采用BCA蛋白測(cè)定法(Pierce，Rockford，Illinois)，以采用標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯96孔板(Pierce，Rockford，Illinois)的微量滴定板形式，測(cè)定提純過(guò)程中柱級(jí)份的蛋白質(zhì)含量。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。
實(shí)施例5 抑制劑、受體、底物和親和吸附劑的制備按Barker et al.(1972)J.Biol.Chem.2477135-7147所描述，合成UDP己醇胺并偶聯(lián)于CNBr活化的瓊脂糖支持物(SEPHAROSE 4B)上。相對(duì)于支持物的配體濃度為每毫升沉降凝膠14μmol。
按Palcic et al.(1990)J.Biol.Chem.2656759-6769所述，合成GlcNAc T-V活性的去氧寡糖抑制劑n-辛基-6-0-〔2-0-(2-乙酰氨基-2-去氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-6-去氧-α-D-吡喃甘露糖基〕-β-D-吡喃葡萄糖苷，并用于試驗(yàn)中。
按Pinto et al.(1983)Carbohydr.Res.124313-318的方法，將類似的GlcNAc T-V寡糖抑制劑βGlc NAc-(1，2)-6-去氧-α-Man-(1，6)-β-Man-O-(CH2)8COOCH3連結(jié)到BSA上，用作親和層析配體。在柱上的配體是模擬GlcNAc T-V天然寡糖受體的活性部位抑制劑，但含一代替反應(yīng)性6′-羥基的氫原子。在-15℃下，將該抑制劑寡糖(4.1mg)轉(zhuǎn)移到?；B氮上，成為25mM DMF(二甲基甲酰胺)溶液。然后加入222.2mg BSA(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri)〔在2ml 0.35M KHCO3和0.07M Na2B4O7(pH9.0)中〕。將所得溶液在4℃下保持24小時(shí)，然后在Amicon PM-10超濾膜(Amicon，Inc.，Division of WR Grace，Danvers，Massachusetts)上用蒸餾水充分地透析。將透析物凍干，再溶解。用Bradford測(cè)定法(Bradford(1976)Analyt.Biochem.72248-254)，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定蛋白質(zhì)含量。用苯酚-硫酸法(Dubois et al.(1956)Analyt.Chem.28350-356)測(cè)定糖類含量。結(jié)果表明，每分子BSA摻入了13個(gè)寡糖分子(67%偶聯(lián)度)。
按Stults et.al.(1989)Analyt.Biochem.180114-119所述，用NH2(CH2)OH-HCl為最終阻斷劑，將3.6mg抑制劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物偶聯(lián)到3ml高碘酸氧化的瓊脂糖(SEPHADEX CL-6B，Pharmacia，Piscataway，New Jersey)上。如Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)構(gòu)法所測(cè)出的，34%寡糖-BSA復(fù)合物偶聯(lián)到瓊脂糖上，使每毫升沉降的凝膠上最終摻入0.07μmol配體寡糖。
關(guān)于三糖寡糖受體及其合成的描述見Palcic et al.(1990)supra;Pierce et al.(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.146679-684;Arango et al.(1988)J.Cell.Biochem.37225-231;and Srivastava et al.(1988)Carbohydr.Res.179137-161.
實(shí)施例6 GlcNAc T-V特異性抗體的產(chǎn)生加入3倍體積無(wú)水乙醇將GlcNAc T-V從貯備緩沖液中沉淀出來(lái)，使其在4℃下靜置30分鐘。離心收集沉淀的蛋白質(zhì)(10，000×g，10分鐘0，再懸浮于0.3ml緩沖液D中，與1.0ml福氏完全佐劑混合。將所得乳劑經(jīng)背部皮內(nèi)注射2只家兔，劑量為50-75ml/部位或約75μg蛋白質(zhì)/部位。在首劑后14天，每只家兔接受每劑150μg的加強(qiáng)注射，在首次注射后21、34、57和64天，每只家兔接受75μg。每周一次從每只家兔的耳靜脈采血10-20ml，制備血清，貯于-20℃。評(píng)估GlcNAc特異性抗體的相對(duì)水平，通過(guò)測(cè)定用人造底物作為受體的試驗(yàn)中抑制50%活性所需的血清量來(lái)進(jìn)行。合并具有最高活性的血清樣品。
用純化的大鼠腎臟GlcNAc T-V免疫小鼠后，按標(biāo)準(zhǔn)方法制備對(duì)大鼠腎臟GlcNAc T-V特異性的單克隆抗體(例如，Campbell(1984)Monoclonal Antibody TechnoloqyLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology(Burdon and van Knippenberg，eds.)Vol.13，Elsevier，Amsterdam;Harolw and Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Habor，New York).
實(shí)施例7 含大鼠GlcNAc T-V序列的PCR片段的分離A.大鼠1-EJ cDNA文庫(kù)構(gòu)建大鼠1-EJ cDNA文庫(kù)以前已構(gòu)建。用標(biāo)準(zhǔn)方法(Maniatis et al.，1982)從轉(zhuǎn)染了人EJ基因，一種活性的Harvey ras基因，(Peles et al.(1992)Cell 69205-216)的大鼠1細(xì)胞分離出信使RNA。用mRNA分離試劑盒(Clontech Lab，Inc.，PaJo Alto，CA)選擇聚腺苷酸mRNA，用Superscript盒(BRL Life Technologies，Inc.，Bethesda，MD)合成cDNA。將柱分級(jí)的雙鏈cDNA連接到SalI和NotI消化的pSPORT-1質(zhì)粒載體(BRL Life Technologies，Inc.，Bethesda，MD)中，并用電穿孔法轉(zhuǎn)化到Escherichia coli DH10B細(xì)胞中(Dower et al.(1988)Nucl.Acids Res.166127-6145)。SalI位點(diǎn)在每個(gè)克隆cDNA序列的5′端，NotI位點(diǎn)在3′端。將轉(zhuǎn)化的E.coli DH10B細(xì)胞增殖為43個(gè)各自獨(dú)立的小庫(kù)，從每個(gè)小庫(kù)分離出質(zhì)粒DNA。
B.寡核苷酸的設(shè)計(jì)和構(gòu)建分析來(lái)自小鼠、大鼠和人的大約180bp PCR擴(kuò)增物(amplimer)序列，設(shè)計(jì)復(fù)蓋小鼠、大鼠和人序列相同區(qū)域的特異寡核苷酸。
引物A474-14 GGGCCATGAAGACTTCTGCG(SEQ ID NO9)(反義)引物B474-16 GGGCTACTTCCTCTCGGTTATTGAG(SEQ ID NO10)(反義)此外，用克隆載體pSPORT-1的T7啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)寡核苷酸。
引物T7476-30 GCTCTAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID NO11)(有意義)C.大鼠1-EJ cDNA文庫(kù)的PCR擴(kuò)增將來(lái)自大鼠1-EJ cDNA文庫(kù)的每一小庫(kù)的一份質(zhì)粒DNA合并，形成大鼠1-EJ cDNA文庫(kù)DNA混合物(大鼠1-EJ cDNA庫(kù))。用引物T7476-30(SEQ ID NO11)和B474-16(SEQ ID NO10)，在大鼠1-EJ cDNA庫(kù)上進(jìn)行PCR。pSPORT-1的T7序列位于cDNA合成中所用的5′SalI克隆位點(diǎn)的上游。因此，用寡核苷酸T7476-30(SEQ ID NO11)引發(fā)PCR，合成復(fù)蓋cDNA5′頂端并在編碼序列的3′端方向上延伸的擴(kuò)增物。PCR產(chǎn)物延伸編碼序列到引物B474-16(SEQ ID NO10)中，它位于約200bp擴(kuò)增物中。
PCR是采用GeneAmp DNA擴(kuò)增盒(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)，按制造商的說(shuō)明進(jìn)行的。簡(jiǎn)言之，100μl反應(yīng)液組成如下8μl Mgcl225mM10μl 10xPCR 緩沖液70.8μl 滅菌水2μl dGTP 10mM2μl dATP 10mM2μl dTTP 10mM2μl dCTP 10mM1μl dCTP 10mM1μl T7:476-30引物 15μM1μl B:474-16引物 15μM500ng 大鼠1-EJ cDNA 文庫(kù)DNA用礦物油(Sigma，St.Louis，MO)復(fù)蓋反應(yīng)混合物，將其放在DNA溫控循環(huán)儀(Perkin Elmer Cetus)中。在加熱起始步驟中加入Taq多聚酶(0.5μl，2.5U)，溫控循環(huán)進(jìn)行如下

用瓊脂糖凝膠電泳分析一份反應(yīng)產(chǎn)物(0.8%瓊脂糖，在含溴化乙錠的Tris硼酸鹽EDTA緩沖液(TBE)中)，將凝膠照相(圖7)。在溴化乙錠染色的凝膠上可見在約1200bp處的一個(gè)主要區(qū)帶，還有一些較小的次要區(qū)帶。
D.PCR產(chǎn)物的Southern雜交在PCR后，將實(shí)施例7C的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳法分離，并用標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)行分析。簡(jiǎn)言之，通過(guò)在1.5MNaCl、0.5N NaOH中浸泡30分鐘使凝膠變性。然后通過(guò)在1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl(pH7.5)中浸泡30分鐘來(lái)中和凝膠。將凝膠上的DNA在10x SSC中過(guò)夜，通過(guò)毛細(xì)管作用轉(zhuǎn)移到硝基纖維素上。轉(zhuǎn)移后，將硝基纖維素用6x SSC漂洗，空氣中干燥，并在UV stratalinker(Strategene，La Jolla，CA)中交聯(lián)。
用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光3′寡聚標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)盒(Amersham，Arlington Heights，IL)，按制造商的說(shuō)明將硝基纖維素預(yù)雜交、雜交和標(biāo)記。預(yù)雜交在50℃進(jìn)行30分鐘。雜交在50℃進(jìn)行約1.5小時(shí)，用約8ng/ml寡核苷酸探針A474-14(SEQ ID NO9)。
雜交后，將硝酸纖維素用5x SSC、0.1%SDS在室溫下洗兩次，每次5分鐘，然后用1x SSC、0.1%SDS在50℃下洗兩次，每次15分鐘。然后按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行辣根過(guò)氧化酶抗體顯色和ECL檢測(cè)。
將硝酸纖維素在室溫下使X光片曝光20分鐘。硝酸纖維素的放射自顯影顯示約2.1kb的單一區(qū)帶(圖8)。這一特異但罕見的PCR產(chǎn)物在溴化乙錠染色的凝膠上是看不見的。
E.特異PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增因?yàn)閷?shí)施例7D描述的特異性2.1kb PCR產(chǎn)物的是如此之少，以致只能用放射自顯影檢測(cè)，便將它通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。先切下瓊脂糖凝膠區(qū)域，在該凝膠上特異性DNA預(yù)期已發(fā)生遷移。用S & S Elu-Quik DNA純化盒(Schleicher & Schuell，Keene，NH)，按制造商的說(shuō)明從凝膠上洗脫DNA。在一份洗脫的DNA上進(jìn)行PCR反應(yīng)。5′端使用引物T7476-30(SEQ ID NO11)，3′引物為485-26 GGGTACGTGTGAATGATATCCAGGTAG(SEQ ID NO12)(反義)此寡核苷酸序列位于2.1kb PCR片段的3′端上游約350bp。此序列是通過(guò)部分由小鼠cDNA順序測(cè)定闡明的，該部分小鼠cDNA是通過(guò)用約200bpPCR擴(kuò)增物序列篩選小鼠淋巴瘤BW5147庫(kù)而分離得到的。
用洗脫的2.1kb PCR片段為模板的100μlPCR反應(yīng)液配制如下8μl Mgcl225mM10μl 10xPCR緩沖液61.5μl 滅菌水2μl dGTP10mM2μl dATP10mM2μl dTTP10mM2μl dCTP10mM1μl T7:476-30引物15μm1μl 485-26引物15μm10μl 洗脫的2.1kbPCR片段按實(shí)施例7C所述，處理反應(yīng)混合物，溫控循環(huán)安排如下

用瓊脂糖凝膠電泳分析一份反應(yīng)產(chǎn)物(0.8%瓊脂糖，在含溴化乙錠的TBE中)，將凝膠照相(圖4)。溴化乙錠染色的凝膠的分析顯示約1.8kb的單一DNA區(qū)帶。
F.DNA序列分析用Taq染料雙脫氧末端終止循環(huán)測(cè)序盒(Taq DyeDioxy Terminator cycle sequencing kit)(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)和自動(dòng)DNA序列儀(Applied Biosystems 373A)，按制造商的說(shuō)明，將實(shí)施例7E所描述的約1.8kb PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析。在通過(guò)Centricon-100 unit(Amicon，Beverly，MA)和用滅菌水洗滌后，進(jìn)行PCR片段序列分析。在某些情況下，將PCR片段亞克隆進(jìn)pUC13載體(Promega，Madison，WI)后再測(cè)定。用合成的寡核苷酸為引物進(jìn)行核苷酸序列分析。
PCR片段約1750bp的序列分析和所有可能的閱讀框架的分析顯示與部分小鼠BW5147 cDNA序列重疊。部分小鼠cDNA含未翻譯的3′序列及可編碼約295個(gè)氨基酸的約885個(gè)堿基的開放閱讀框架，但無(wú)起始密碼子。PCR片段的序列分析通過(guò)外加約445個(gè)氨基酸殘基而延伸了開放閱讀框架編碼區(qū)域，并定位甲硫氨酸ATG超始密碼子。此外，在PCR片段上鑒定了未翻譯的5′區(qū)域的300bp。
或者，用下面的方法可分離編碼GlcNAc T-V的cDNA克隆。
在按標(biāo)準(zhǔn)方法從大鼠腎臟組織及按Sambrook et al.，(eds)(1989)(見前)所述從小鼠淋巴瘤BW5147細(xì)胞和從腹水生成的大鼠乳腺M(fèi)AT-C1細(xì)胞的平行分離中制備了總RNA。ATCC T1B47是適應(yīng)于培養(yǎng)物的BW5147細(xì)胞系的一個(gè)克隆(BW5147.3)(J.Natl.Cancer Inst.(1973)51883;J.Immunol.(1973)1101470)。MAT C1細(xì)胞的描述見Carraway et al.(1976)J.Biol.Chem.2516173-6178。總RNA的聚腺苷酸部分按Sam-brook et al.(eds)(1989)(見前)所述用寡(dt)纖維素層析法加以制備。編碼GlcNAc T-V的聚腺苷酸mRNA包括在這樣制成的聚腺苷酸RNA中。
按Sambrook et al.(eds)(1989)(見前)的方法，用從大鼠腎臟、小鼠淋巴瘤BW5147細(xì)胞和MAT-B1細(xì)胞總RNA制得的聚腺苷酸RNA可制備cDNA文庫(kù)。將cDNA群體克隆進(jìn)合適的載體(如入gt11)按標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行(例如見Huynh et al.(1985)in DNA Cloning a Practical Approach Vol.1(Glover，D，M.，ed)，IRL Rress，Washington，D.C.，PP.49-78)。
商業(yè)上可得到的cDNA文庫(kù)(例如，大鼠腎臟cDNA文庫(kù)Clontech Laboratories，Palo Alto，California)也可用來(lái)篩選Glc-NAc T-V克隆。
使用如Sambrook et al.，(eds.)(1989)(見前)所述用隨機(jī)六聚物標(biāo)記物作放射標(biāo)記的約200bp擴(kuò)增物，在不太嚴(yán)緊的條件下進(jìn)行空斑雜交，從cDNA文庫(kù)篩選編碼GlcNAc T-V的序列。選擇與擴(kuò)增物序列特異性雜交的克隆作進(jìn)一步分析(限制性內(nèi)切核酸酶消化，核苷酸序列測(cè)定)。
用諸如引物1(SEQ ID NO5)或引物2(SEQ ID NO7)或合用引物1和2，可從大鼠(或小鼠或其他哺乳動(dòng)物)鑒定編碼GlcNAc T-V的基固組克隆，或用引物1(SEQ ID NO5)和反引物2(SEQ ID NO8)可引發(fā)如上所述PCR合成于其上的擴(kuò)增物以鑒定適當(dāng)?shù)幕蚪M序列。
從所分析的克隆可重建GlcNAc T-V的完全編碼序列。如果不能重建全長(zhǎng)編碼序列，可按Frohman et al.(1988)Proc.Natl.SCi.USA 858998-9002所述，用靠近已分析序列區(qū)域末端的序列，設(shè)計(jì)進(jìn)一步的引物，用于RACE程序(cDNA末端的快速擴(kuò)增)。在需要完整基固時(shí)，可篩選基因組文庫(kù)，并用現(xiàn)有技術(shù)中已知的“步查”方法，向兩個(gè)方向延伸。
實(shí)施例8 編碼GlcNAc T-V的大鼠cDNA序列的克隆A.大鼠1-EJ文庫(kù)的Southern雜交將含有從43個(gè)獨(dú)立的大鼠1-EJ cDNA文庫(kù)的小庫(kù)中所得的NotI-直鏈化質(zhì)粒DNA的硝基纖維素濾膜進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)，以鑒定哪些小庫(kù)含有全長(zhǎng)GlcNAc T-V cDNA。cDNA探針來(lái)自部分小鼠cDNA編碼區(qū)，并以HindⅢ/PsyⅠ片段得到，該片段從大鼠1-EJPCR片段ATG序列的下游約855bp開始，向序列的3′末端延伸約650bp。
按Sambrook et al.，(eds.)(1989)(見前)所述，在42℃下將硝基纖維素濾膜與預(yù)雜交溶液一起培養(yǎng)。然后，用多重引發(fā)DNA標(biāo)記系統(tǒng)盒(Amersham)以〔α32P〕-dCTP標(biāo)記的約650bp小鼠cDNA探針培養(yǎng)過(guò)夜，進(jìn)行雜交。將硝基纖維素濾膜洗滌，并于-80℃下與帶增感屏的X光片曝光過(guò)夜。濾膜的放射自顯影揭示，在所篩選的43個(gè)小庫(kù)中有4個(gè)是陽(yáng)性的。
B.大鼠1-EJ文庫(kù)小庫(kù)的PCR分析用從實(shí)施例8A鑒定出的4個(gè)陽(yáng)性大鼠1-EJ cDNA文庫(kù)小庫(kù)的每一個(gè)所得到的模板DNA進(jìn)行PCR，以確定哪個(gè)小庫(kù)含有全長(zhǎng)cDNA。除了使用如下引物外，反應(yīng)按實(shí)施例7C所述進(jìn)行引物 501-16 CCCGTCGACGAGAGCCAAGGGAATGGTAC(SEQ ID NO13)(有意義)引物496-2 CCCAGCAGGTACAGAGATGTG(SEQ ID NO14)(反義)通過(guò)大鼠1-EJ PCR片段序列分析確定引物501-16(SEQ ID NO13)，以在ATG起始密碼子上游約15-35個(gè)堿基的5′未翻譯區(qū)進(jìn)行雜交。經(jīng)序列分析確定引物496-2(SEQ ID NO14，以在ATG超始密碼子下游約900個(gè)堿基的編碼區(qū)內(nèi)進(jìn)行雜交。因此，用這兩個(gè)引物進(jìn)行PCR得到復(fù)蓋編碼區(qū)5′端的長(zhǎng)度約900bp的預(yù)期的產(chǎn)物。溫控循環(huán)進(jìn)行如下

按實(shí)施例7C所述，用瓊脂糖凝膠電泳分離出一份反應(yīng)混合物。溴化乙錠染色分析表明，4個(gè)小庫(kù)中2個(gè)有大小正確的區(qū)帶(約900bp)。這一信息，連同用大鼠1-EJ cDNA文庫(kù)的Southern雜交(實(shí)施例8A)所得到的區(qū)帶大小，揭示了一個(gè)小庫(kù)可含有全長(zhǎng)GlcNAc T-VcDNA。
C.用菌落雜交方法篩選大鼠1-EJ cDNA的文庫(kù)將從上述實(shí)施例8B鑒定的大鼠1-EJ cDNA文庫(kù)之一的甘油貯存物中得到的轉(zhuǎn)化E.coli以每10×10cm平板約4，500克隆的密度涂布于含50μg/ml氨芐青霉素的營(yíng)養(yǎng)物平板上。用硝基纖維素濾膜使克隆從平板上分離下來(lái)。將濾膜(克隆化的一面向上)依次放在一片用如下溶液飽和的Whatman 3MM濾紙上進(jìn)行處理1.1.5M NaCl，0.5N NaOH，10分鐘2.1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl(pH7.5)，5分鐘3.2x SSC，5分鐘然后將濾紙?jiān)诳諝庵懈稍?，用紫外照射法進(jìn)行交聯(lián)。再在含0.2%SDS、100mM Tris-HCl(pH8.5)、50mM NaCl、10mM EDTA(pH8)和50μg/ml蛋白酶K的溶液中在55℃下培養(yǎng)30分鐘，用蛋白酶K進(jìn)行消化。再將濾紙轉(zhuǎn)移到含5x SSC、0.5%SDS和1mMEDTA(pH8)的溶液中，在55℃下培養(yǎng)30分鐘。用ECL 3′寡聚標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)盒(Amersham)在如下條件下進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和隨后的處理1.在53℃下進(jìn)行預(yù)雜交約2小時(shí);
2.用引物501-16(SEQ ID NO13)約7ng/ml，在50℃下培養(yǎng)過(guò)夜，進(jìn)行雜交。
在雜交后，按實(shí)施例7D所述洗滌濾膜。經(jīng)ECL檢測(cè)后，將濾膜在室溫下X光片曝光4分鐘。
在所篩選的36，000個(gè)克隆中，挑出24個(gè)克隆及克隆的混合物用于進(jìn)一步的PCR分析。除了用20μl反應(yīng)液和將吸管尖端接觸細(xì)菌平板然后將吸管尖端浸入PCR混合液以得到模板外，按實(shí)施例8B所述的方法進(jìn)行PCR。用礦物油復(fù)蓋后，將PCR管在溫控循環(huán)儀中在94℃下培養(yǎng)4分鐘，然后加入0.2μl Taq聚合酶。采用以下溫度控制方式

如實(shí)施例7C所述，用瓊脂糖凝膠電泳分離一份反應(yīng)混合物。溴化乙錠染色的凝膠的分析揭示，在24個(gè)受試混合物中有3個(gè)為陽(yáng)性。
如上所述，將3個(gè)陽(yáng)性混合物再制板并用引物496-2(SEQ ID NO14)為探針檢測(cè)，按ECL 3′標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書，在53℃下進(jìn)行預(yù)雜交和雜交分別為30分鐘和約2小時(shí)。如上所述進(jìn)行洗滌，并在室溫下放射自顯影20分鐘。X光片分析揭示，在所篩選的約600個(gè)克隆中有1個(gè)為陽(yáng)性。除了反應(yīng)液體積為50μl外，如上所述，以501-16(SEQ ID NO13)和496-2(SEQ ID NO14)為引物，用PCR分析確認(rèn)這一克隆。
除了預(yù)雜交和雜交在55℃下進(jìn)行之外，如上所述，將從上面得到的這一陽(yáng)性克隆混合物以低密度再制板，并用引物496-2(SEQ ID NO14)為探針檢測(cè)。將濾膜X光片曝光2分鐘，顯示在所篩選的約300個(gè)克隆中有7個(gè)為陽(yáng)性。
D.大鼠1-EJ cDNA序列分析從實(shí)施例8C描述的最終陽(yáng)性的克隆中的4個(gè)克隆分離出質(zhì)粒DNA。限制性酶分析揭示，這些質(zhì)粒每個(gè)都含有約4.8kb的cDNA插入物。用實(shí)施例7F所述方法對(duì)這些質(zhì)粒之一進(jìn)行核苷酸序列分析。結(jié)果見于SEQ ID NO15。
圖8中，起始DNA序列標(biāo)明約300個(gè)堿基的有意義鏈，其中看來(lái)包含位于大鼠GlcNAc T-V cDNA的翻譯部分與之前的5′未翻譯區(qū)域。緊跟著的序列被認(rèn)為是編碼大鼠GlcNAc T-V的氨基酸序列的。這一區(qū)域跨越2220個(gè)堿基，編碼740個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子(TAG)。相繼的序列似乎是大鼠GlcNAc T-V cDNA的未翻譯的3′區(qū)。根據(jù)質(zhì)粒DNA的限制性酶譜分析，這一cDNA的3′未翻譯區(qū)似乎長(zhǎng)度為約2300個(gè)堿基。只有這3′未翻譯區(qū)的前面約100個(gè)堿基存在于SEQ ID NO15中。
SEQ ID NO16從而提供大鼠GlcNAc T-V的一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)，包含740個(gè)特異的氨基酸殘基(估測(cè)的M.W.＝84，561)。成熟大鼠GlcNAc T-V多肽可能發(fā)生N-偶聯(lián)糖基化作用的六個(gè)部位用星號(hào)標(biāo)在圖10中。
實(shí)施例9 Southern雜交在用限制酶(BglⅡ、NcoⅠ及NcoⅠ/XhaⅠ和BamHⅠ/BglⅡ)按提供者說(shuō)明書進(jìn)行的平行反應(yīng)中，將適量大鼠乳房瘤基因組DNA和大鼠肝臟基因組DNA進(jìn)行消化。然后用瓊脂糖凝膠電泳分離限制性片段(1.0%瓊脂糖，Tris-乙酸鹽-EDTA緩沖液)。
然后，將凝膠用溴化乙錠染色，浸泡于TAE緩沖液中除去過(guò)量染料，將凝膠照相。將凝膠浸泡在0.25N HCl中攪拌10分鐘，使凝膠上的DNA發(fā)生脫嘌呤作用。
在轉(zhuǎn)移到硝基纖維素上之前，將凝膠浸泡在0.5N NaOH、1.5M NaCl中30分鐘，使DNA變性。將硝基纖維素浸泡在重蒸餾水中20-30分鐘，再浸泡在10x SSC中20-30分鐘。用重蒸餾水漂洗凝膠，再將凝膠浸泡在0.5M Tris-HCl(pH7.4)、3M NaCl中30分鐘，使堿基被中和。
在室溫中，在10x SSC中，通過(guò)毛細(xì)管傳輸過(guò)液，使處理過(guò)的凝膠上的DNA區(qū)帶被吸到硝基纖維素上。用＃1鉛筆將孔的位置和凝膠的方向標(biāo)在硝基纖維素上。
用4x SSC漂洗硝基纖維素片，在空氣中干燥30分鐘，在真空烘箱中于80℃下烘2小時(shí)(直到完全干燥)。
在42℃下，用預(yù)雜交溶液將硝基纖維素洗4小時(shí)。用約200bp擴(kuò)增物探針培養(yǎng)過(guò)夜進(jìn)行雜交，該擴(kuò)增物探針是用〔α-32P〕-CTP標(biāo)記的隨機(jī)六聚體(見Sambrook et al.(eds.)(1989)(見前)。如上文所述，該約200bp的擴(kuò)增物是在用引物1(SEQ ID NO5)和抗引物2(SEQ ID NO8)進(jìn)行的Taq聚合酶反應(yīng)中判備的。再將硝基纖維素用2x SSC、0.2%SDS于50℃下洗兩次，每次30分鐘。
然后，將雜交的硝基纖維素放在帶增感屏的X光片上，于-80℃下過(guò)夜，使X光片曝光。
實(shí)施例10 用PCR分離部分小鼠和人GlcNAc T-V序列按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行PCR以測(cè)定引物1和2能否擴(kuò)增來(lái)自兩個(gè)細(xì)胞系(小鼠淋巴瘤BW5147和大鼠乳房瘤Mat Cl細(xì)胞)的特異產(chǎn)物。
從每個(gè)細(xì)胞系分離出總RNA和聚腺苷酸RNA，并用來(lái)用逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生cDNA。這些cDNA制備在如下平行PCR反應(yīng)中作為模板10-50ng 模板cDNA5μl 10xTaq緩沖液(無(wú)Mg)3μl 25mM MgCl21μl dNTP混合液(各10mM)1μl 30μM引物11μl 30μM引物238μl 滅菌水0.5μl Taq聚合酶每份反應(yīng)液用油復(fù)蓋，再放入溫控循環(huán)儀中，采用以下溫度控制方式

用瓊脂糖凝膠電泳(2%瓊脂糖)分離反應(yīng)產(chǎn)物。
實(shí)施例11A.大鼠GlcNAc T-V在COS-7細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)將來(lái)自實(shí)施例8D所述一個(gè)大鼠GlcNAc T-V克隆的約4.8kb完整cDNA插入物連結(jié)到SalI和NotI消化的pJT-2質(zhì)粒表達(dá)載體中(Wen et al.(1992)Cell 69559-572)。用單一pJT-2質(zhì)?；蛴煤笫驡lcNAc T-V cDNA的pJT-2質(zhì)粒借助如下電穿孔法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞(CRL 1651，American Type Culture Collection，Rockville，MD)將4×106個(gè)細(xì)胞(在0.8ml DMEM中)(Dulbecco′s Modified Minimal Medium，Gibco，Grand Island，NY)和7.5% FBS(胎牛血清，Bocknek，Ltd.)轉(zhuǎn)移到0.4cm小試管中，與10μg質(zhì)粒DNA(在10μl水中)混合。電穿孔在室溫下進(jìn)行，1600伏特，25μF，用基因脈沖儀(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)脈沖控制單元調(diào)節(jié)在200歐姆(Wen et al.(1988)(見前))。然后將細(xì)胞稀釋到約40ml DMEM、7.5% FBS中，并轉(zhuǎn)移到100mm培養(yǎng)皿中。在37℃下培養(yǎng)17小時(shí)后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)51小時(shí)或75小時(shí)。
B.制備COS細(xì)胞，用于GlcNAc T-V活性試驗(yàn)從每個(gè)轉(zhuǎn)染COS-7質(zhì)粒的培養(yǎng)皿中除去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖的生理鹽水(PBS)洗細(xì)胞。用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，放在試管中，用PBS稀釋，并離心使細(xì)胞成沉淀。吸去PBS后，將試管浸入液氮，使細(xì)胞沉淀快速冷凍。將細(xì)胞在干冰上冷凍保存直至在作放射化學(xué)試驗(yàn)和ELISA分析時(shí)再懸浮于緩沖液中。
C.GlcNAc T-V活性試驗(yàn)將細(xì)胞沉淀再懸浮于20μl MES(pH6.0)150μM NaCl緩沖液，并用聲波破碎。按實(shí)施例4所述測(cè)定每一提取物的蛋白質(zhì)含量。然后用放射化學(xué)和ELISA試驗(yàn)測(cè)定GlcNAc T-V活性。
放射化學(xué)試驗(yàn)使用合成的三糖受體分子(Srivastava etal.(1988)(見前);Pierce et al.(1987)supra;Arango and Pierce(1988)supra;Palcic et al.(1988)Glycoconjugate J.549-63;Pierce and Arango(1986)J.Biol.Chem.26110772-10277;Crawely et al.(1990)Anal.Biochem.185112-117)。
典型的試驗(yàn)混合物含有如下試劑，它們?cè)?.5ml離心管中真空干燥106cpm UDP-〔3H〕-GlcNAc(25cpm/pmol)和1mM合成受體，總?cè)莘e為0.01ml。為啟動(dòng)反應(yīng)，將0.01ml細(xì)胞提取物，典型地含約30μg蛋白質(zhì)，〔在含50mM MES(pH6.0)和1% Surfact-Amps(Triton)X-100的緩沖液中〕加入到試管中，在37℃下培養(yǎng)幾小時(shí)(例如，約7小時(shí))。為終止反應(yīng)，將0.5ml水加到每管中，混旋，使混合完全，再將試管內(nèi)容物離心。借助產(chǎn)物的疏水基團(tuán)，用C-18層析法將放射標(biāo)記的產(chǎn)物從未摻入的底物中分離出來(lái)。然后，將每份上清液加到用甲醇事先活化并用水預(yù)平衡的薄膜C-18Sep Pak柱上。用200ml水洗柱以除去來(lái)自未反應(yīng)底物和降解產(chǎn)物的水溶性放射活性物質(zhì)。用100%甲醇洗脫放射標(biāo)記產(chǎn)物，用液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定放射活性。所有試驗(yàn)至少就兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)作雙管試驗(yàn)，將結(jié)果平均。雙管試驗(yàn)的數(shù)值之差不超過(guò)±5%，典型地為小于平均值的±2%。
GlcNAc T-V活性的ELISA試驗(yàn)可檢出fmol量的受試產(chǎn)物，測(cè)定范圍復(fù)蓋GlcNAc T-V活性的106倍范圍。該試驗(yàn)利用未標(biāo)記的糖核苷酸、連于牛血清的蛋白(BSA)的三糖受體和對(duì)本反應(yīng)的四糖-BSA產(chǎn)物特異的家兔多克隆抗體。為了測(cè)定GlcNAc T-V活性，每次試驗(yàn)必須用放射化學(xué)試驗(yàn)中測(cè)得的已知量的GlcNAc T-V作標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，然后通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，將受試樣品的吸光率與特定的比活性關(guān)聯(lián)。
證明所分離出的全長(zhǎng)cDNA克隆的確編碼GlcNAc T-V的另一個(gè)方法是按Larsen et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA868227-8231所述，將編碼序列融合到N-未端蛋白質(zhì)A編碼序列上。然后，將得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使摻入cDNA序列的細(xì)胞在培養(yǎng)物中存活。因?yàn)槿诤系鞍踪|(zhì)含有蛋白質(zhì)A的N-末端序列，因此融合蛋白質(zhì)的質(zhì)被導(dǎo)向分泌途徑并從細(xì)胞中釋放出來(lái)。離心除去細(xì)胞后，如上所述，測(cè)試培養(yǎng)基的GlcNAc T-V活性。將一部分無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基加到IgG柱上作層析，N-末端蛋白質(zhì)A序列結(jié)合到柱上，使GlcNAc T-V活性被保留在柱上。
確證分離出的cDNA編碼GlcNAc T-V的第二個(gè)方法是將完整cDNA插入載體中，該載體在調(diào)控序列的控制下，從而可在選擇的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。所選擇的宿主細(xì)胞是小鼠淋巴瘤BW5147細(xì)胞系的缺GlcNAc T-V變異株，PHA2.1;該變異細(xì)胞在Cummings et al.(1982)J.Biol.Chem.25713421-13427中有描述。另一缺GlcNAc T-V細(xì)胞株為CHO細(xì)胞的Lec 4變異株，在Stanley，P.(1983)Methods Enzymol.96157-184中有描述。這兩株變異細(xì)胞株均在細(xì)胞毒外源凝集素L-植物血球凝集素的存在下進(jìn)行選擇生長(zhǎng)，該凝集素結(jié)合于GlcNAc T-V半乳糖基化產(chǎn)物。編碼GlcNAc T-V的cDNA序列的表達(dá)回復(fù)GlcNAc T-V活性和這些變異細(xì)胞株的外源凝集素敏感性。
上述一種或一種以上方法的使用確認(rèn)了GlcNAc T-V被克隆作為cDNA形式存在。
序列表(1)一般信息(ⅰ)發(fā)明人皮爾斯，J.M.
肖雷勃，M.G.
阿德勒，B.
弗雷琴，N.L.
(ⅱ)發(fā)明名稱N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶Ⅴ編碼序列(ⅲ)序列數(shù)19(ⅳ)通信地址(A)收件人格林利和溫納，P.C.
(B)街5370 Manhattan Circle Suite 201(C)城市博爾德(D)州科羅拉多(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼80303(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式
(A)中型松盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容制(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release ＃1.0，Version ＃1.25(ⅵ)本申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(ⅶ)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S07/905，795(B)申請(qǐng)日1992.6.29(ⅶ)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/016，863(B)申請(qǐng)日1993.2.10(ⅷ)代理人信息(A)姓名費(fèi)伯，D.M.
(B)注冊(cè)號(hào)33，878(C)案子編號(hào)34-92B(ⅸ)電信信息(A)電話(303)499-8080(B)電傳(303)499-8089(2)SEQ ID NO1信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽
(ⅲ)假設(shè)的非(ⅳ)反意義非(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO1Asn Thr Asp Phe Ile Gly Lys Pro Thr Leu Arg1 5 10(2)SEQ ID NO2信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)的非(Ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO2Ala Ile Leu Asn Gln Lys Ile Glu Pro Tyr Met Pro Tyr Glu Phe Thr1 5 10 15(2)SEQ ID NO3信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)的非(Ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO3Val Leu Asp Ser Phe Gly Thr Glu Pro Glu Phe Asn
1 5 10(2)SEQ ID NO4信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)的非(Ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅸ)特征(A)名稱/鏈區(qū)域(B)定位1..10(D)其他信息/標(biāo)記＝不確定/注＝4，7和9位上氨基酸的鑒定是不確定的(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO4Ser Asp Pro Cys Tyr Ala Asp Tyr Glu Val1 5 10(2)SEQ ID NO5信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(其他核酸)(ⅲ)假設(shè)的非(ⅸ)特征
(A)名稱/鍵混合物-差異(B)定位6位和21位(D)其他信息/標(biāo)準(zhǔn)名稱＝“N是6位和21位上的次黃嘌呤核苷”(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO5AAYACNGAYT TYTTYATHGG NAARCCNAC 29(2)SEQ ID NO6信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(其他核酸)(ⅲ)假設(shè)的非(ⅸ)特征(A)名稱/鍵混合物-差異(B)定位3位、9位和24位(D)其他信息/標(biāo)準(zhǔn)名稱＝“N是3位、9位和24位上的次黃嘌呤核苷”(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO6GTNGGYTTNC CDATRAARAA RTCNGTRTT 29(2)SEQ ID NO7信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ⅱ)分子類型DNA(其他核酸)(ⅲ)假設(shè)的非(ⅸ)特征(A)名稱/鍵混合物-差異(B)定位9位和18位(D)其他信息/標(biāo)準(zhǔn)名稱＝“N是9位和18位上的次黃嘌呤核苷”(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO7ATHGARCCNT AYATGCCNTA YGARTTYAC 29(2)SEQ ID NO8信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基材(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(其他核酸)(ⅲ)假設(shè)的非(ⅸ)特征(A)名稱/鍵混合物-差異(B)定位3位和15位(D)其他信息/標(biāo)準(zhǔn)名稱＝“N是3位和15位上的次黃嘌呤核苷”(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO8TCRTANGGCA TRTANGGYTC DATYTTYTG 29(2)SEQ ID NO9信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(其他核酸)(ⅲ)假設(shè)的非(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO9GGGCCGATGA AGACTTCTGCG 21(2)SEQ ID NO10信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(其他核酸)(ⅲ)假設(shè)的非(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO10GGGCTACTTC CTCTCGGTTA TTGAG 25(2)SEQ ID NO11信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(其他核酸)(ⅲ)假設(shè)的非(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO11GCTCTAATAC GACTCACTAT AGG 23
(2)SEQ ID NO12信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(其他核酸)(ⅲ)假設(shè)的非(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO12GGGTACGTGT GAATGATATC CAGGTAG 27(2)SEQ ID NO13信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(其他核酸)(ⅲ)假設(shè)的不(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO13CCCGTCGACG AGAGCCAAG GGAATGGTAC 30(2)SEQ ID NO14信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(其他核酸)
(ⅲ)假設(shè)的非(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO14CCCAGCAGGT ACAGAGATGTG 20(2)SEQ ID NO15信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度2624個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型mRNA之cDNA(ⅲ)假設(shè)的非(ⅳ)反意義非(ⅸ)特征(A)名稱/鍵CDS(B)定位299..2521(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO15




(2)SEQ ID NO16信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度740個(gè)氨基對(duì)(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO16



(2)SEQ ID NO17信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度178個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈雙股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(其他核酸)(ⅲ)假設(shè)的非(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO17

(2)SEQ ID NO18信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度179個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈雙股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(其他核酸)(ⅲ)假設(shè)的非(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO18

(2)SEQ ID NO19信息
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度166個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈雙股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(其他核酸)(ⅲ)假設(shè)的非(ⅹⅰ)序列圖說(shuō)SEQ ID NO19

權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，主要包括編碼具N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶V活性的多肽的核苷酸順序，所述的核苷酸順序與SEQ ID NO∶15中給出，從核苷酸299至核苷酸2521的核苷酸順序有不少于70%的同源性。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的順序編碼哺乳動(dòng)物的Glc NAc T-V。
3.如權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于，所述的核苷酸順序編碼大鼠的Glc NAc T-V。
4.如權(quán)利要求3所述的DNA分子，其特征在于，所述的核苷酸順序編碼多肽，該多肽具有SEQ ID NO16給出的氨基酸順序。
5.如權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于，所述的核苷酸順序如SEQ ID NO15給出的那樣，從核苷酸299至核苷酸2521。
6.一種含有如權(quán)利要求1所述的DNA順序的DNA分子，其特征在于，還包括外源核苷酸順序。
7.如權(quán)利要求6所述的DNA分子，其特征在于，所述的外源核苷酸順序是表達(dá)載體。
8.一種重組宿主細(xì)胞，其特征在于，含有如權(quán)利要求1所述的DNA順序。
9.如權(quán)利要求8所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)菌細(xì)胞是大腸桿菌(Escherichia coli)。
11.如權(quán)利要求8所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求8所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述的核苷酸編碼大鼠Glc NAc T-V。
13.如權(quán)利要求12所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述的核苷酸順序編碼在SEQ ID NO16中給出的氨基酸順序。
14.如權(quán)利要求13所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述的核苷酸順序?yàn)樵赟EQ ID NO15中給出，從核苷酸299至核苷酸2521之間的順序。
15.如權(quán)利要求14所述的重組細(xì)胞，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞從COS-7細(xì)胞系衍變而來(lái)。
16.一種具N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶V活性的多肽，其特征在于，是如權(quán)利要求1所述的核苷酸順序的表達(dá)產(chǎn)物。
17.如權(quán)利要求16所述的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸順序如SEQ ID NO1，2，3或16所示。
18.如權(quán)利要求16所述的多肽，其特征在于，所述的多肽由如權(quán)利要求12所述的DNA順序產(chǎn)生。
19.如權(quán)利要求18所述的多肽，其特征在于，該多肽的氨基酸順序如SEQ ID NO16給出的那樣。
20.如權(quán)利要求19所述的多肽，其特征在于，所述的氨基酸順序由SEQ ID NO15中從核苷酸299至核苷酸2521給出的核苷酸順序編碼。
21.一種產(chǎn)生具N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶V活性的多肽的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟(a)將編碼具Glc NAc T-V活性的多肽的核苷酸與表達(dá)控制順序操作性連鎖，形成Glc NAc T-V表達(dá)盒(cassette)，所述的核苷酸順序與SEQ ID NO15中，從核苷酸299至核苷酸2521給出的順序具有不少于70%的順序同源性;(b)通過(guò)遺傳工程使細(xì)胞含有步驟(a)的Glc NAc T-V表達(dá)盒，從而形成Glc NAc T-V重組細(xì)胞;(c)在適合表達(dá)所述的Glc NAc T-V表達(dá)盒的條件下，培養(yǎng)步驟(b)的Glc NAc T-V重組細(xì)胞，由所述的核苷酸順序指導(dǎo)具有Glc NAc T-V活性的多肽的表達(dá)。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述的核苷酸順序編碼哺乳動(dòng)物的Glc NAc T-V。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述的核苷酸順序編碼大鼠的Glc NAc T-V。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述的核苷酸順序編碼多肽，該多肽具Glc NAc T-V活性并有SEQ ID NO16所示的氨基酸順序。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述的核苷酸順序如SED ID NO15中給出的那樣，從核苷酸299至核苷酸2521。
26.一種用于產(chǎn)生具Glc NAc T-V活性的多肽的DNA順序，其特征在于，所述的順序主要含有(a)編碼如SEQ ID NO1，2，3或16所示的氨基酸的多肽的DNA順序;(b)能與(a)中的DNA順序雜交的DNA順序，該DNA順序編碼具Glc NAc T-V活性的多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了基本純化的UDP-N-乙酰葡萄糖胺α-6-D-甘露糖苷β-1，6-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶(GlcNAcT-V；Ec2.4.1.155)和與GlcNAcT-V特異結(jié)合的抗體。本發(fā)明還提供了能移與編碼GlcNAcT-V的核酸順序特異雜交的多聚核苷酸順序和寡核苷酸探針，編碼Glc NAcT-V的cDNA克隆和基因組克隆，以及編碼Glc NAcT-V的核苷酸順序，特以大鼠的Glc NAcT-V編碼順序?yàn)槔?br> 文檔編號(hào)C12N15/54GK1081205SQ9310756
公開日1994年1月26日 申請(qǐng)日期1993年6月29日 優(yōu)先權(quán)日1992年6月29日
發(fā)明者J·邁克爾·皮爾斯, 貝弗利·阿德勒, 穆罕默德·G·肖雷勒, 岡維斯·李·弗雷琴 申請(qǐng)人:佐治亞大學(xué)研究基金會(huì)股份有限公司, 埃姆艮股份有限公司