專利名稱：細胞培養(yǎng)生產紫杉醇的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種通過細胞培養(yǎng)而生產紫杉醇的方法，具體講是以植物細胞培養(yǎng)技術為手段，通過在細胞生物反應器內進行的東北紅豆杉大規(guī)模細胞培養(yǎng)生產紫杉醇的方法。本發(fā)明屬于生物制藥領域。
紫杉醇(Taxol)作為治療腫瘤的有效藥物之一，其巨大的市場需求與其原料來源的匱乏，使得運用植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術分離提取藥用成份紫杉醇的產業(yè)化生產研究，成為近些年來新藥研究的重要課題之一。自1971年國際上首次出現(xiàn)從紅豆杉樹皮中分離出紫杉醇至今，由于其天然含量極低，紫杉醇的原料保障就成為該藥能否成功走向市場的關鍵所在。為此，除天然提取方法外，化學半合成和全合成研究亦取得進展，而運用植物組織細胞培養(yǎng)技術研究開發(fā)紫杉醇一直是現(xiàn)代高技術醫(yī)藥領域研究的核心問題。
與其它化合物不同，紫杉醇及其紫杉烷類化合物是迄今為止僅見于裸子植物紅豆杉科(Taxaceae)的紅豆杉屬(Taxus)中。紅豆杉是一種生長極其緩慢的古老木本植物，在我國屬一類保護植物，是優(yōu)良樹種之一，同時也是園林綠化及觀賞樹種。紅豆杉屬植物在世界上有11種1變種，在我國分布有4種1變種，即西藏紅豆杉(Taxus Wallichiana zucc)，云南紅豆杉(T.yunnanensis cheng et L.K.Fu)，東北紅豆杉(T.cuspidate sieb et zucc，又稱日本紫杉，Japanese yew)、紅豆杉(T.Chinensis(pilger)Reid)和南方紅豆杉(T.Chinensis uar mairei(Lem’ee et ievel)Cheng et L.K.Fu)。樹皮提取紫杉醇是唯一商業(yè)來源。從干樹皮中提取1g紫杉醇需3-6棵60齡大樹，而要提取1kg紫杉醇則要砍伐1000-2000棵樹。要滿足治療一個患者，則需要1-2g的紫杉醇?，F(xiàn)今國際市場對紫杉醇年需求量為500kg，并且這一需求正日益增加。紫杉醇市場需求量大，靠剝取樹皮或砍伐樹木提取已相當困難。即使將全部天然資源采伐，也只能滿足短期臨床需要，且會造成對森林和人類自下而上環(huán)境及生物多樣性不可彌補損失。由于天然樹皮中紫杉醇含量極低，約占干重的0.01～0.02％，因此紫杉醇的原料保障就成為該藥能否成功走向市場的最為關鍵因素。圍繞這一問題，國內外在下述幾方面開展了研究工作化學合成或半合成，天然種植和組織與細胞培養(yǎng)等方面。
化學全合成是另一個獲得紫杉醇的途徑，但全合成需20-25步，紫杉醇化學合成方法已取得初步成果，年總產率僅4-5％，成本高。
此外，隨著10-脫乙酰漿果赤霉素III(BaccatinIII)和15-羥基-10-脫乙酰漿果赤霉素III的發(fā)現(xiàn)，為紫杉醇的半合成和在此基礎上進行改造生產紫杉醇類似物的研究提供了可能并取得了階段性成果。由于紫杉醇和半合成前體均需從天然植物中取得，所以天然資源(栽植)和組織培養(yǎng)等研究特別是組織細胞培養(yǎng)研究仍然處于紫杉醇資源研究的核心位置，而后者則是重中之重。
我們經多年的時間，在分析、研究國內外紫杉醇研究成果的基礎上，系統(tǒng)地研究了植物組織細胞培養(yǎng)技術應用到東北紅豆杉有效藥物紫杉醇生產的理論、工藝及可行性，包括從材料選擇、外植體誘導、高頻細胞株的保存、懸浮培養(yǎng)系的建立到分離、純化等過程，完成了實驗室和中試研究，實現(xiàn)了一個培養(yǎng)周期可收獲紫杉醇80.3％mg/L的結果，使下一步產業(yè)化具有實際意義并為此提供了可能與保障。
本發(fā)明的目的，在于提供一種提高東北紅豆杉細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產紫杉醇的方法，該方法不僅能明顯提高東北紅豆杉細胞培養(yǎng)液中紫杉醇的含量，而且更有利于達到產業(yè)化水平。
本項目經多年研究，依東北紅豆杉培養(yǎng)細胞產生紫杉醇的特殊機理首創(chuàng)了采用看護培養(yǎng)和細胞懸浮培養(yǎng)相結合的半連續(xù)細胞培養(yǎng)方式，同時在培養(yǎng)液中附加了有機成分，合理組配很好地控制了細胞的生長過程，縮短了緩慢生長期，延長了平穩(wěn)生長期，進而縮短了培養(yǎng)周期，降低了成本，提高紫杉醇產量。此外，對細胞培養(yǎng)液的預處理采用有機溶劑分段處理法進行萃取、濃縮培養(yǎng)液到最后柱層大大減少了紫杉醇的損失量。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術路線如下將東北紅豆杉的外植體進行離體培養(yǎng)，篩選高產細胞株，轉入細胞種子培養(yǎng)，爾后進行細胞大規(guī)模培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)液經過分離，萃取純化等處理，得到紫杉醇晶體。
具體來說，在MB培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導和高產細胞株的篩選，在1/2MB培養(yǎng)基上進行細胞種子培養(yǎng)和細胞反應器內的大規(guī)模細胞培養(yǎng)。特別是，在MB培養(yǎng)基上附加NAA、IAA、KT條件下進行東北紅豆杉高產細胞株的篩選，在1/2MB培養(yǎng)基上附加NAA、IAA、KT條件下進行東北紅豆杉細胞種子培養(yǎng)和細胞反應器的大規(guī)模培養(yǎng)。
在上述基礎上的東北紅豆杉愈傷組織繼代保存20天為一周期，細胞種子培養(yǎng)10天為一繼代周期，細胞反應器培養(yǎng)20-25天為一周期。
上述所說的MB培養(yǎng)基組成為MS培養(yǎng)基大量元素+B5培養(yǎng)基微量元素；1/2MB培養(yǎng)基組成為MS培養(yǎng)基大量元素減半+B5培養(yǎng)基微量元素。
所添加的NAA、IAA、KT用量為NAA 0.5-5.0mg/L、IAA 0-3.0mg/L、KT 0-1.5mg/L。
上述的培養(yǎng)基中需添加蔗糖1.5-2.5％，并調PH值4.5-7.5。
上述的培養(yǎng)條件為8h/d光照，2000Lx光照強度，溫度24℃±1。
培養(yǎng)結束后采用`H-NMR，13C-NMR，HMQC，HMBC以及CD譜對紫杉醇平面和立體結構進行測定。
本發(fā)明的最佳離體培養(yǎng)條件是MB培養(yǎng)基附加NAA1.Omg/L+IAA 2.5mg/L+KT1.0mg/L+2％糖本發(fā)明的最佳細胞培養(yǎng)條件是1/2MB培養(yǎng)基，其它組成同上。
本發(fā)明提出的東北紅豆杉大規(guī)模培養(yǎng)的方法是采用5L氣升式細胞反應器(中國科學院生化中心有售)作種子罐，培養(yǎng)10-15天，培養(yǎng)條件為溫度24±1℃-28±1℃，最佳為26±1℃，光照最佳時間為8小時/天，光照強度800-1500LX，最佳為1000LX。以20L氣升式細胞反應器作生產罐。培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為24℃±1，光照8h/d。光照強度2000LX，培養(yǎng)時間20-25天，每隔8-10天進行補加營養(yǎng)，每次添加1/2MB 100-500ml。
本發(fā)明的分離和純化過程如下細胞培養(yǎng)液下罐后，經過旋轉蒸發(fā)，濃縮至1/2-1/4體積，加入萃取液三氯甲烷或四氯甲烷，加入量為按1∶1體積比加入，每天搖動2-5次，于30℃以下靜置20-40小時，隔2天水洗一次脂相，去掉水相，重復5次，在30℃以下烘干，得干燥物，通過HPLC過柱，獲得紫杉醇晶體。
本發(fā)明運用植物細胞培養(yǎng)技術分離提取紫杉醇意義十分重大(1)解決了紫杉醇的原料來源，保護了東北紅豆杉自然資源，無任何環(huán)境污染；(2)滿足日益增長的臨床試驗和醫(yī)療用藥，為廣大患者提供大量的具顯著療效的新型抗癌藥物；(3)紫杉醇生產是在傳統(tǒng)的提取及化學合合成和半合成以外的一種運用植物細胞培養(yǎng)技術開發(fā)現(xiàn)代中藥的一次革命；(4)在生物反應器內生產、調控，從細胞培養(yǎng)液中分離產物，節(jié)省了場地、節(jié)約了時間、降低了生產成本、提高了產量。最終實現(xiàn)讓中國普通老百姓都能享用到運用現(xiàn)代高新技術生產抗癌藥物紫杉醇的目的。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的技術路線所達到的先進結果分析如下
實施例以MS培養(yǎng)基大量元素+B5培養(yǎng)基微量元素組成配制MB培養(yǎng)基，并按NAA 0.5-5.0mg/L、IAA 0-3.0mg/L、KT 0-1.5mg/L的添加量添加NAA、IAA、KT。在此條件下進行東北紅豆杉高產細胞株的篩選，將篩選出的高產細胞株在1/2MB培養(yǎng)基上進行細胞種子培養(yǎng)，該1/2MB培養(yǎng)基組成為MS培養(yǎng)基大量元素減半+B5培養(yǎng)基微量元素，并按NAA 0.5-5.0mg/L、IAA 0-3.0mg/L、KT 0-1.5mg/L的添加量添加NAA、IAA、KT。將培養(yǎng)的種子在細胞反應器內進行大規(guī)模細胞培養(yǎng)。培養(yǎng)基是1/2MB，該1/2MB培養(yǎng)基組成為MS培養(yǎng)基大量元素減半+B5培養(yǎng)基微量元素，并按NAA 0.5-5.0mg/L、IAA 0-3.0mg/L、KT 0-1.5mg/L的添加量添加NAA、IAA、KT。還需添加蔗糖1.5-2.5％，并調PH值4.5-7.5。附加NAA、IAA、KT條件下進行東北紅豆杉細胞種子培養(yǎng)和細胞反應器的大規(guī)模培養(yǎng)。大規(guī)模培養(yǎng)的方法是采用5L氣升式細胞反應器(中國科學院生化中心有售)作種子罐，培養(yǎng)10-15天，培養(yǎng)條件為溫度24±1℃-28±1℃，最佳為26±1℃，光照最佳時間為8小時/天，光照強度800-1500LX，最佳為1000LX。以20L氣升式細胞反應器作生產罐。培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為24℃±1，光照8h/d。光照強度2000LX，培養(yǎng)時間20-25天，每隔8-10天進行補加營養(yǎng)，每次添加1/2MB 100-500ml。
細胞培養(yǎng)液下罐后，經過旋轉蒸發(fā)，濃縮至1/2-1/4體積，加入萃取液三氯甲烷或四氯甲烷，加入量為按1∶1體積比加入，每天搖動2-5次，于30℃以下靜置20-40小時，隔2天水洗一次脂相，去掉水相，重復5次，在30℃以下烘干，得干燥物，通過HPLC過柱，獲得紫杉醇晶體。
權利要求
1.一種通過細胞培養(yǎng)生產紫杉醇的方法，其特征在于該方法包括在MB培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導和高產細胞株的篩選，在1/2MB培養(yǎng)基上進行細胞種子培養(yǎng)和細胞反應器內的大規(guī)模細胞培養(yǎng)，其中在MB培養(yǎng)基和1/2MB培養(yǎng)基上添加NAA、IAA、KT。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于其中的東北紅豆杉愈傷組織繼代保存20天為一周期，細胞種子培養(yǎng)10天為一繼代周期，細胞反應器培養(yǎng)20-25天為一周期。
3.根據權利要求1的方法，其特征在于其所說的MB培養(yǎng)基組成為MS培養(yǎng)基大量元素+B5培養(yǎng)基微量元素。
4.根據權利要求1的方法，其特征在于所說的1/2MB培養(yǎng)基組成為MS培養(yǎng)基大量元素減半+B5培養(yǎng)基微量元素。
5.據權利要求1的方法，其特征在于所說的MB培養(yǎng)基和1/2MB培養(yǎng)基當中還添加NAA 0.5-5.0mg/L、IAA 0-3.0mg/L、KT 0-1.5mg/L，蔗糖1.5-2.5％，并調PH值4.5-7.5。
6.根據權利要求1的方法，其特征在于所說的培養(yǎng)條件為8h/d光照，2000Lx光照強度，溫度24℃±1。
7.根據權利要求1的方法，其特征在于所說的大規(guī)模細胞培養(yǎng)采用20L氣升式細胞反應器進行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種運用植物細胞培養(yǎng)手段,從東北紅豆杉細胞大規(guī)模培養(yǎng)中生產紫杉醇的方法。該方法是在MB培養(yǎng)基上由東北紅豆杉愈傷組織中篩選出高產細胞株,接種到1/2MB培養(yǎng)基上進行細胞種子培養(yǎng)和細胞反應器大規(guī)模培養(yǎng)。在MB和1/2MB培養(yǎng)基中附加IAA、KT和NAA條件下進行細胞培養(yǎng)。然后對細胞反應器中的細胞培養(yǎng)液進行分離純化,獲取紫杉醇含量達0.9%。純度98%。解決了紫杉醇生產的原料問題。易操作,生產成本低,不污染環(huán)境,達到了產業(yè)化水平。
文檔編號C12N5/04GK1367254SQ01102278
公開日2002年9月4日 申請日期2001年1月21日 優(yōu)先權日2001年1月21日
發(fā)明者賈景明, 張劍俠 申請人:沈陽泰澤植物細胞培養(yǎng)有限公司