專利名稱：過濾培養(yǎng)技術生產(chǎn)高含多核苷酸磷酸化酶大腸桿菌的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種酶的生產(chǎn)方法。
多核苷酸磷酸化酶是一種很重要的酶，自從1955年被發(fā)現(xiàn)以來，廣泛地應用于生化、醫(yī)藥等方面。該酶普遍存在于細菌、酵母真核細胞以及高等動植物細胞中。目前，工業(yè)上多以大腸桿菌作為菌種，采取分批培養(yǎng)法進行大規(guī)模生產(chǎn)。具體方法是先把大腸桿菌接種于牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基上加以活化，在盛有培養(yǎng)基的容器內(nèi)，用斜面種子接種后于37℃溫度下振蕩培養(yǎng)12小時，作為一級種子，再按10%(V種子/V培養(yǎng)基)接種量將一級種子接入種子罐，于37℃溫度，1∶0.5-1∶1通風量，0.05Mpa氣壓的條件下，攪拌培養(yǎng)10小時作為二級種子，按10%接種量將二級種子接入發(fā)酵罐，按一級種子的培養(yǎng)條件攪拌培養(yǎng)12-16小時后，經(jīng)過分離得到含多核苷酸磷化酶的大腸桿菌，于-20℃溫度下冷凍貯存。所述的培養(yǎng)基是K2HPO42.18%，KH2PO41.7%，酵母浸汁1%，葡萄糖1%其余為蒸餾水的混合液，或者是蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，酵母膏0.5%，Nacl 0.5%其余為蒸餾水的混合液。
現(xiàn)有生產(chǎn)方法的缺點是在大腸桿菌發(fā)酵過程中細胞代謝產(chǎn)物對細胞生長有很嚴重的抑制作用，而且發(fā)酵后期營養(yǎng)損耗不能補充，不利于細菌生長，以致到收獲期時大腸桿菌濃度較低，酶的活性不高。因而發(fā)酵設備產(chǎn)率低，細胞分離工藝比較復雜，分離時間過長，酶的活性也受到影響。
本發(fā)明的目的是要提供一種克服了上述分批培養(yǎng)方法缺點的過濾培養(yǎng)技術生產(chǎn)高含多核苷酸磷酸化酶的大腸桿菌的方法。
本發(fā)明是在傳統(tǒng)發(fā)酵裝置上附加一套過濾系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括培養(yǎng)基貯液罐、中空纖維超濾膜如聚砜超濾膜、濾出液罐及輸送設備。大腸桿菌按分批培養(yǎng)方法接種后進行過濾循環(huán)培養(yǎng)，在循環(huán)過程中不斷加入營養(yǎng)物質，排出代謝產(chǎn)物以保持很長的細胞旺盛繁殖期，從而克服了發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物抑制生長，發(fā)酵后期營養(yǎng)缺失的缺點。具體方法是由葡萄糖20g/l，酵母酶解粉10g/l，NaHPO45g/l，K2HPO48g/l和蒸餾水組成培養(yǎng)基，在120℃溫度下滅菌15分鐘，將大腸桿菌接種于盛有培養(yǎng)基的容器內(nèi)，于37℃溫度下振蕩培養(yǎng)16小時，按10%(V種子/V培養(yǎng)基)的接種量接種于發(fā)酵設備中，在溫度為37℃，攪拌轉速為400rpm，PH值控制在7.0，氧飽和度控制在5%的條件下培養(yǎng)2小時，然后開始過濾培養(yǎng)由供氣系統(tǒng)控制發(fā)酵罐氧飽和度不低于2.5%，最好為5%，在溫度為32-40℃最好為37℃的條件下培養(yǎng)8-16小時，最好為8小時，在培養(yǎng)過程中按稀釋率為0.5-1.5hr-1補加培養(yǎng)基，發(fā)酵液通過超濾膜濾除代謝產(chǎn)物，菌體回到發(fā)酵罐內(nèi)，如此往復，當菌體濃度到達規(guī)定值后，經(jīng)分離得到高含多核苷酸磷酸化酶大腸桿菌，于-20℃溫度下冷凍貯存，再經(jīng)提取可得多核苷酸磷酸化酶。
本發(fā)明利用過濾培養(yǎng)技術連續(xù)生產(chǎn)多核苷酸磷化酶大腸桿菌，由于營養(yǎng)物質的不斷加入，代謝產(chǎn)物不斷排除，系統(tǒng)中細胞可以保持很長時間的旺盛生長狀態(tài)，從而在短時間內(nèi)達到很高的細胞濃度，發(fā)酵設備產(chǎn)率大幅度提高，后處理工藝大大簡化。
下面結合


其實施例。
圖(1)是過濾培養(yǎng)技術生產(chǎn)高含多核苷酸磷酸化酶的大腸桿菌的工藝流程示意圖。
圖中1-培養(yǎng)基貯罐2-加料泵3-供氣系統(tǒng)4-發(fā)酵罐5-循環(huán)泵6-超濾膜7-排料泵8-濾出液罐實施例1菌種大腸桿菌(EschevichiacColi)AS.1.183;
培養(yǎng)基由葡萄糖20g，酵母酶解粉10g，NaHPO45g，K2HPO48g，蒸餾水1L組成;
培養(yǎng)方法培養(yǎng)基經(jīng)121℃溫度滅菌15分鐘后，裝于培養(yǎng)基貯罐1中，用加料泵2送入帶攪拌裝置的發(fā)酵罐4，將預先準備的種子接種發(fā)酵罐內(nèi)，由供氣系統(tǒng)3維持發(fā)酵罐氧飽和度達到5%，在溫度為37℃，攪拌轉速為400rpm的條件下培養(yǎng)2小時后，開始過濾培養(yǎng)用循環(huán)泵5以2L/min速度循環(huán)培養(yǎng)8小時，在循環(huán)過程中按稀釋率為1.5hr-1補加培養(yǎng)基，發(fā)酵液通過超濾膜6濾除代謝產(chǎn)物，由排料泵7排入濾出液罐8，發(fā)酵液經(jīng)轉速為3000rpm的離心分離機分離，得到高含多核苷酸磷酸化酶的大腸桿菌泥，貯于-20℃冰箱內(nèi)。
所述的超濾膜6的性能見表1
試驗結果見表2
注第2、3項的測定方法見附錄1實施例2用過濾培養(yǎng)技術生產(chǎn)高含多核苷酸磷酸化酶大腸桿菌的方法同實施例1，不同之處在于所述的稀釋速率為0.5hr-1，試驗結果與實施例1的結果基本相同。
實施例3用過濾培養(yǎng)技術生產(chǎn)高含多核苷酸磷酸化酶大腸桿菌的方法同實施例1，不同之處在于大腸桿菌菌種在使用前接種到含有蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，酵母膏0.5%，Nacl0.5%的培養(yǎng)基上加以活化。
試驗結果見表3
注第2、3項的測定方法見附錄1實施例4用過濾培養(yǎng)技術生產(chǎn)高含多核苷酸磷酸化酶的大腸桿菌的方法同實施例1，不同之處在于發(fā)酵溫度為32℃或40℃，發(fā)酵時間為12小時，其結果同實施例3。
權利要求
1.一種過濾培養(yǎng)技術生產(chǎn)高含多核苷酸磷酸化酶大腸桿菌的方法，其特征是大腸桿菌采用傳統(tǒng)的分批培養(yǎng)方法接種后，再接種于帶攪拌裝置的發(fā)酵罐內(nèi)，由供氣系統(tǒng)控制發(fā)酵罐內(nèi)氧飽合度不低于2.5%，在溫度為32-40℃的條件下，循環(huán)培養(yǎng)8-16小時，在循環(huán)過程中按稀釋率為0.5-1.5hr-1補加培養(yǎng)基，發(fā)酵液通過超濾膜濾除代謝產(chǎn)物，菌體回到發(fā)酵罐內(nèi)，當菌體濃度達到規(guī)定值后，經(jīng)分離得到高含多核苷酸磷酸化酶的大腸桿菌菌泥，于-20℃溫度下貯存。
2.根據(jù)權利要求1所述的過濾培養(yǎng)技術生產(chǎn)高含多核苷酸磷酸化酶的大腸桿菌的方法，其特征是發(fā)酵工藝條件最好為氧飽和度為5%、溫度為37℃，發(fā)酵時間8小時。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的過濾培養(yǎng)技術生產(chǎn)高含多核苷酸磷酸化酶的大腸桿菌的方法，其特征是培養(yǎng)基為1升蒸餾水中含有葡萄糖20g，酵母酶解粉10g、NaHPO45g、K2HPO48g。
全文摘要
本發(fā)明提供的過濾培養(yǎng)技術生產(chǎn)高含多核苷酸磷酸化酶的大腸桿菌的方法，是在傳統(tǒng)的發(fā)酵裝置上附加一套過濾系統(tǒng)，大腸桿菌按傳統(tǒng)的分批培養(yǎng)方法培養(yǎng)后，接種于發(fā)酵罐內(nèi)，在32～40℃溫度下，循環(huán)培養(yǎng)8～16小時，在循環(huán)過程中補加培養(yǎng)基，發(fā)酵液通過超濾膜濾除代謝產(chǎn)物后，經(jīng)分離得到的菌泥于-20℃溫度下貯存。本方法與傳統(tǒng)的分批培養(yǎng)方法相比，大幅度提高了設備的產(chǎn)率，后處理工藝簡單，并且大腸桿菌細胞內(nèi)酶的活性高。
文檔編號C12N1/20GK1068368SQ92108910
公開日1993年1月27日 申請日期1992年8月3日 優(yōu)先權日1992年8月3日
發(fā)明者聶實踐 申請人:北京市營養(yǎng)源研究所