專利名稱：人血紅蛋白(珠蛋白)α的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬遺傳檢測領域，是用DNA聚合酶鏈反應(PCR)方法對人血紅蛋白(珠蛋白)α1基因和α2基因檢測的技術。
編碼血紅蛋白(珠蛋白)的α1基因或α2基因的缺失會引起α-地中海貧血癥(簡稱地貧)。它在我國是一種常見病，發(fā)病率為2.64%，廣西的一些地區(qū)竟高達14.95%以上，目前尚無有效的根治方法，重癥患者需常年輸血，不僅本人十分痛苦，對家庭和社會也帶來沉重的負擔。
α-地貧除少數是由α-基因的點突變引起外，多數是由α-基因的缺失所引起的。α-基因族有2個序列極為相似的α1和α2基因，二者之間只有7個核苷酸序列上的差異，它們在功能上是相同的，都編碼α-珠蛋白分子，這二個基因的缺失或部分缺失，都會減少α-珠蛋白的合成。在正常人基因組中存在2個α1等位基因和2個α2等位基因。一般缺失一個α基因的患者表現為α-地貧2，貧血癥狀很輕或看不出癥狀;缺失2個α基因的患者表現為α-地貧1，貧血癥狀較重;缺失3個α基因的患者表現為HbH病，貧血癥狀嚴重，需常年輸血;缺4個α基因的胎兒表現為Bart′s水腫，不能成活。
目前應用紅細胞形態(tài)觀察、血紅蛋白電泳分析對人血紅蛋白(珠蛋白)α1基因和α2基因的缺失進行分型檢測，也可用限制性內切酶和α基因探針雜交等方法對α基因缺失情況進行研究，這些方法或則操作技術復雜，或則難于掌握客觀標準。1987年以來，普遍采用設計在α基因族ψα1(α1假基因)基因內的一對引物對人血紅蛋白(珠蛋白)α1基因或α2基因的缺失進行PCR(多聚酶鏈式反應Polymerase chain Reaction)擴增，如果α基因族包括α1和α2基因在內的大片段缺失時，可獲得正確的檢測結果;如果缺失僅為α1和α2基因或者是α1或α2基因而不包括ψα1時，則獲得假陰性結果;如果缺失的僅為ψα1基因而α1和α2基因或者α1或α2基因并不缺失，則獲得假陽性結果。所以這種PCR檢測方法具有很大的局限性，況且中國的α-地貧患者多為α1和α2基因或者是α1或α2基因缺失，應用此法易于導致檢測錯誤。
本發(fā)明的目的是建立一種操作簡單、方法簡便、檢測標準明確無誤的人血紅蛋白(珠蛋白)α1基因和α2基因的PCR基因分型檢測技術。
本發(fā)明用PCR擴增技術，主要有引物合成、基因擴增、顯示檢測主要步驟。發(fā)明設計了五種核苷酸引物，它們是αp15′d(CGG CTC TGC CCA GGT TAA GG)αp25′d(CCT TGG TCT GAG ACA GGT AAA CA)αp35′d(AGT GGG GCC GAG GGC CCA G)βp15′d(AAG GAG ACC AAT AGA AAC TGG GC)βp25′d(TCT CCC CTT CCT ATG ACA TGA AC)其中αp1和αp2引物擴增Hbα1基因片斷278bP，αp1和αp2擴增Hbα2基因片段603bp，βp1和βp2擴增Hbβ基因片段400bP。五種引物分別形成三對，擴增的片段具有明顯的特征。
引物αp1、αp2、αp1、βp1、βp2按上述的核苷酸排列順序，可以用化學方法合成。278bp、603bp、400bp的DNA片段可以用電泳法檢測。如用普通的瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段后用溴乙錠染色，在紫外光照射下的紅色熒光來檢測。
基因擴增的試劑體系是可以在30-100μl的反應體系中有10-50mM/L的Tris-HCl(PH＝8.1-8.5)，50mM/L的KCl，0.5-3.0mM/L的MgCl2，10-25mM/L的(NH4)2SO4，明膠200ug/ml，4-8%的甲酰胺，dNTP(A·G·C·T)各200-300μM/L，1-1.5U的耐熱DNA聚合酶，0.25-0.5μM/L的αp1，0.125-0.25μM/L，的αp2，0.125-0.25μM/L的αp1，0.125-0.25μM/L的βp1，0.125-0.25μM/L的βp2。
將上述試劑，除了耐熱DNA聚合酶以外，濃縮10倍，將引物按所需濃度配好，組成試劑盒，則使用更方便。
采用上述PCR反應試劑體系，則PCR擴增產物的電泳帶清晰明亮，沒有雜帶，易于鑒別。
擴增反應時，先將反應體系混合打勻，可以高速離心30秒鐘，然后在90-93℃溫度下變性3-10分鐘，加酶，打勻，再離心;按90-93℃ 0.5-1分鐘、50-60℃ 0.5-1分鐘、68-72℃ 1-2分鐘作30-35個循環(huán);再在68-72℃溫度下保溫數分鐘，取反應產物在瓊脂糖凝膠板上電泳，紫外光照射下觀察電泳帶。使用Hybaid或FR-300PCR擴增儀或恒溫水浴擴增，采用的溫度和保溫時間在上述范圍內適當調整。
在該擴增程序下擴增產物在電泳顯示檢測時泳帶清晰，靈敏度高，以正常人的血紅蛋白(珠蛋白)α1基因和α2基因進行PCR擴增的產物中，278bp、603bp、400bp三個基因片段的電泳帶之間的距離相等，很易識別。配上本發(fā)明的擴增試劑體系和擴增程序，這三條電泳帶清晰明亮，而且條帶的亮度相近。
參照βp1、βp2基因片段400bp的標準，如果受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因為α1基因或α2基因缺失的雜合子，則它們α1基因或α2基因片段的擴增產物電泳帶的亮度僅為β基因擴增產物400bp帶亮度的一半以下。
如受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因為α1基因和α2基因缺失的純合子，則僅有β基因擴增的產物400bp帶，而沒有αp1和αp3、αp1和αp2擴增的278bp、603bp電泳帶。α基因族的兩個序列相似的α1基因和α2基因中若缺失1個α1基因或α2基因，則為雜合子，缺兩個等位α基因的為純合子。
若受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因缺失3個α基因，則α1基因或α2基因片斷擴增產物電泳帶只有一條帶，其亮度為β帶亮度的一半以下;
若受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因缺失4個α基因，那么沒有α1基因和α2基因片段擴增產物電泳帶。


圖1是顯示檢測的電泳圖，1是αp1和αp2擴增的Hbα1基因片段278bp，2是αp1和αp2擴增的Hbα2基因片段603bp，3是βp1和βp2擴增的Hbβ基因片段400bp。圖中黑度表示電泳帶的亮度，行4是φX174(RF)-HaeⅢ的電泳帶，行5是血紅蛋白(珠蛋白)α基因無缺失的電泳帶，即正常人血紅蛋白(珠蛋白)α基因檢測的結果，行6是缺失一個α2基因的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因擴增后的電泳帶，是α地貧2患者的檢測結果，行7是缺失兩個α基因(α1和α2)的DNA基因組擴增后的電泳帶，這是α地貧1患者的檢測結果，行8是缺失3個α基因的DNA基因組擴增后的電泳帶，這是HbH病人的檢測結果，行9是4個α基因都缺失的DNA基因組擴增后的電泳帶，這是Bart′s水腫患者的檢測結果。
本發(fā)明的引物順序明確，可用DNA合成儀自動合成，在本研究領域中常規(guī)易行，引物擴增的基因明確，配上本發(fā)明的擴增試劑體系、擴增程序和電泳檢測，使得顯示結果清晰無疑。
本發(fā)明不僅可以分別檢測α1基因和α2基因是否缺失，還可以對照比較正常人的內參照標準，準確地判斷受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因缺失是屬于α1基因和α2基因還是α1基因或α2基因缺失的純合子或雜合子?？煽康貙θ搜t蛋白(珠蛋白)α基因缺失進行分型檢測，不會發(fā)生假陽性或假陰性的失誤檢測。
本發(fā)明技術配上用本技術制成的檢測試劑盒，操作方便，檢測結果明確，無論是科學研究還是α基因缺失分型檢測都方便可靠。
圖1是人血紅蛋白(珠蛋白)α1基因和α2基因的PCR分型檢測電泳圖。
圖2是HbH病先征者家系的PCR基因分型檢測圖。
實施例在50ul體系中，含有10mM/L Tris-HCl(PH＝8.5)，50mM/L KCl，2mM/L MgCl2，10mM(NH4)2SO4，明膠200μg/ml，甲酰胺8%，dNTP各200μM/L，0.25μM/L的αp1，0.125μM/L的αp2，0.125μM/L的αp1，0.125μM/L的βp1，0.125μM/L的βp2，人染色體DNA約0.5μg，用30μl液蠟復蓋液面。將反應體系混合打勻，高速離心30秒，恒溫水浴93℃1分鐘，加入DNA聚合酶1U，打勻，離心，然后恒溫水浴93℃1分鐘、55℃1分鐘、68℃2分鐘，依次進行35個循環(huán)，循環(huán)結束后再72℃保溫5分鐘，取20μl反應產物在1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5μg/ml EB)板上電泳，紫外光下觀察電泳帶。
該受檢者為HbH病先征者家系的PCR基因分型檢測例，觀察到的電泳帶結果如圖2。該圖中第6行(先征者的父親)中第2條電泳帶即αp1和αp2擴增Hbα2基因片斷603bp帶的亮度僅為第3條β帶的亮度的一半以下，可以斷定父親是α2基因缺失的雜合子，父親患的是α地2癥。第7行是先征者母親的受檢結果，可以看到第1和第2電泳帶的亮度都為第3條β帶的亮度的一半以下，可以斷定母親缺失α1和α2兩個α基因(α1和α2均為雜合子)，因而患α地1癥。先征者本人的電泳條帶見第8行，其α2(603bp)電泳帶全無，α1(278bp)電泳帶的亮度僅為β(400bp)電泳帶亮度的一半以下，可斷定其缺失三個α基因，患HbH癥。
權利要求
1.一種用DNA聚合酶鏈式反應對人血紅蛋白(珠蛋白)α基因的擴增技術，它的內容由引物合成、基因擴增、顯示檢測三部分組成，其特征在于(1)基因擴增的核苷酸引物及其順序為αP15′d(CGG CTC TGC CCA GGT TAA GG)αP25′d(CCT TGG TCT GAG ACA GGT AAA CA)αP15′d(AGT GGG GCC GAG GGC CCA G)βP15′d(AAG GAG ACC AAT AGA AAC TGG GC)βP25′d(TCT CCC CTT CCT ATG ACA TGA AC)(2)引物αP1和αP2擴增Hbα1基因278bP，αP1和αP2擴增Hbα2基因片段603bP，βP1和βP2擴增Hbβ基因片段400bP。
2.根據權利要求1所述的用DNA聚合酶鏈式反應對人血紅蛋白(珠蛋白)α基因的擴增技術，其特征在于基因擴增試劑體系是在30-100μl反應體系中含有Tris-Hcl10-50mM/L(PH＝8.1-8.5);KCl50mM/L;Mgcl20.5-3.0mM/L;(NH4)2SO410-25mM/L;明膠200ug/ml;甲酰胺4-8%;dNTP(A·G·C·T)各200-300mM/L;耐熱DNA聚合酶1-1.5U;αp10.25-0.50mM/L;αp20.125-0.25mM/L;αp10.125-0.25mM/L;βp10.125-0.25mM/L;βp10.125-0.25mM/L。
3.根據權利要求1所述的用DNA聚合酶鏈式反應對人血紅蛋白(珠蛋白)α基因的擴增技術，其特征在于擴增反應的程序是(1)90-93℃變性3-10分鐘，加酶打勻，離心;(2)按90-93℃ 0.5-1分鐘，50-60℃ 0.5-1分鐘，68-72℃ 1-2分鐘，作30-35個循環(huán);(3)68-72℃保溫數分鐘后，取反應產物在含有EB的瓊脂糖凝膠板上電泳，紫外光下觀察電泳帶。
4.根據權利要求1所述的用DNA聚合酶鏈式反應對人血紅蛋白(珠蛋白)α基因的擴增技術、其特征在于(1)若受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因為α1基因或α2基因缺失的雜合子，則其α1基因或α2基因片段的擴增產物電泳帶的亮度僅為血紅蛋白β基因電泳帶的亮度一半以下;(2)若受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因為α1基因或α2基因缺失的純合子，則擴增產物電泳時僅有β基因帶，沒有α1基因帶或α2基因帶;(3)若受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因中缺失3個α基因、則α1基因或α2基因片斷擴增產物電泳帶只有一條，而且其亮度只有β電泳帶亮度的一半以下;(4)若受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因中缺失4個α基因，則沒有α1基因或α2基因片斷擴增產物的電泳帶。
全文摘要
一種遺傳檢測方法，利用DNA聚合酶鏈反應(PCR)技術，對人血紅蛋白(珠蛋白)α
文檔編號C12Q1/68GK1065094SQ92108379
公開日1992年10月7日 申請日期1992年4月14日 優(yōu)先權日1992年4月14日
發(fā)明者毛裕民, 楊樹青, 王先敏 申請人:復旦大學