本發(fā)明涉及應用化學技術領域，尤其涉及一種富含梓樹酸的甘油二酯油組合物及其制備方法和應用。

背景技術：

甘油二酯(Diacylglycerol)是一類甘油三酯(Triacylglycerol)中一個脂肪酸被羥基取代的結構脂質，是天然植物油脂的微量成分及體內脂肪代謝的內源中間，其具有兩種天然同分異構體，即1,2-甘油二酯和1,3-甘油二酯，如式1所示。

式1甘油二酯結構示意(其中COR、COR’為飽和或不飽和脂肪酰基)

目前，經(jīng)多項安全性評估發(fā)現(xiàn)，甘油二酯對人體無毒無害，被美國FDA認定為“一般公認安全”物質，2009年中國衛(wèi)生部第18號公告批準甘油二酯油等7種物品為新資源食品。盡管甘油二酯和甘油三酯在能值和吸收率上基本相同，但是它們在體內的代謝上存在較大差異，短期及長期的動物和人體試驗表明，與含有相同或相似脂肪酸組成的甘油三酯相比，1,3-甘油二酯具有控制和治療高血甘油三脂癥、肥胖癥及其并發(fā)癥的作用。因此，富含1,3-甘油二酯的食用油不僅可以替代甘油三酯食用油作為健康人群的保健用油，也可以用于肥胖人群以及相關并發(fā)癥人群的營養(yǎng)治療。

目前，甘油二酯的制備方法主要有以下幾種：(1)甘油三酯醇解法：即在脂肪酶的催化下，甘油三酯與低級醇反應，生成甘油二酯和低級醇酯，但該方法使用的脂肪酶Novozyme 435和Lipozyme IM只能特異性分解或合成sn-1位或sn-3位的酯鍵，因此只能得到1,2-甘油二酯。(2)部分水解、酯化法：即先部分水解甘油三酯得到脂肪酸，再加入甘油，在sn-1和sn-3位選擇性脂肪酶的催化下，甘油與部分水解得到的脂肪酸發(fā)生酯化反應生成1,3-甘油二酯，目前的大部分的甘油二酯包括花王公司生產(chǎn)的EnovaTM Oil是基于這一原理開發(fā)的，該方法最大的缺點是工藝流程復雜，需要多步分離，此外原料的利用率低，另外需要使用脂肪酶，而脂肪酶價格較高，對于工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)甘油二酯來說存在成本過高等問題。(3)甘油解法：即將甘油三酯油與甘油以及一種含有一 元羧酸或二元羧酸的堿金屬鹽或堿土金屬鹽或其混合物(作催化劑)混合，通過甘油三酯的甘油醇解，制得商業(yè)的、食品級1,3-甘油二酯油，但常規(guī)甘油解需要在220～260℃的高溫下反應，使得甘油三酯、甘油二酯和脂肪酸特別是不飽和脂肪酸的氧化作用加大。目前，制備甘油二酯油主要是通過大豆油、菜籽油、花生油和玉米油等甘油三酯型油脂制備，以魚油等為原料制備甘油二酯最近也有少量報導，如Feltes等(2010)以脂肪酶Novozyme 435通過甘油三酯醇解法來制備富含n-3PUFA的甘油二酯；Eoma等(2010)以脂肪酶RMIM和Novozyme 435通過水解、酯化法合成富含n-3PUFA的甘油二酯。

共軛脂肪酸是一類含有兩個以上共軛雙鍵體系的脂肪酸，最常見的共軛脂肪酸是十八碳二烯酸和十八碳三烯酸，即共軛亞油酸(CLA)和共軛亞麻酸(CLNA)，其中CLA是亞油酸的共軛形式，而CLNA是α-亞麻酸的共軛形式。CLA和CLNA因雙鍵的位置和構型不同而有多種不同的異構體，9順,11反-共軛亞油酸(cis9,tras11-18:2)、10反,12順-共軛亞油酸(tras10,cis12-18:2)和石榴酸(cis 9,tras11,cis13-18:3)、α-酮酸(c9,tras11,tras 13-18:3)、梓樹酸(tras9,tras11,cis13-18:3)分別是研究最為廣泛的CLA和CLNA異構體。

梓樹酸(Catalpic acid，trans9,trans11,cis13-18:3)為天然存在于梓樹籽中的一種重要共軛亞麻酸，梓樹酸為9，11，13位雙鍵共軛，9位和11位雙鍵構型為反式，13位雙鍵構型為順式的共軛亞麻酸(trans9,trans11,cis13-CLNA)。梓樹酸與cis9,trans11-CLA(9,11位雙鍵共軛)的相似之處在于他們的脂肪酸鏈第9位和第11位都是不飽和的雙鍵。cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA為CLA最主要的兩種異構體，天然存在的CLA主要為cis9,trans11-CLA，占CLA 90％以上，也是目前在歐美國家應用最為廣泛的CLA的活性形式。

梓樹酸與cis9,trans11-CLA的關鍵不同之處在于梓樹酸的第三個不飽和的雙鍵，梓樹酸在脂肪酸鏈的第13位有一個反式的雙鍵，所以，梓樹酸具有“多不飽和脂肪酸”的特征。多不飽和脂肪酸具有重要的營養(yǎng)價值，對人和動物體內甘油三酯和膽固醇具有有益的作用，能降低心腦血管疾病的危險，促進生長和發(fā)育。目前，多不飽和脂肪酸廣泛用于添加到嬰兒食品中來促進嬰兒的生長發(fā)育和智力的發(fā)展。

共軛脂肪酸具有與常規(guī)的多不飽和脂肪酸不同的特殊生理功能。據(jù)報道，CLNA具有抗癌，抗動脈粥樣硬化、改善血脂、提高免疫力、降低體脂含量、提高瘦體質和提高胰島素抵抗等很多有利的生理功能，如美國專利NO7,834,058公開了利用梓樹酸治療高胰島素血癥，美國專利NO7,687,544公開了利用梓樹酸治療2型糖尿病以及其相關綜合癥。另一方面，CLA已經(jīng)在全世界，尤其是歐美國家作為減肥、降血脂等功能食品和保健品而得到廣泛應用。研究發(fā)現(xiàn)CLA天然存在于反芻動物食物制品如牛肉、羊肉及其奶制品中，然而CLA在這些食物中含量只有約1％(Sehat等，1998)，使得不可能用天然存在的CLA來作為含CLA的、促進健康的食品或藥品的來源。因此商業(yè)上應用的 CLA主要是通過把富含亞油酸的油脂進一步異構化而得到的，這種異構化產(chǎn)物通常包含等摩爾的cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA(Pariza等，2001)以及其他異構體。不僅消費者對工業(yè)化制備的CLA存在安全等方面的考慮，而且CLA的工業(yè)化本身也存在很多問題，如：CLA工業(yè)化生產(chǎn)價格成本較高；工業(yè)化制備的CLA有多種異構體形式，而并不是每種異構體都具有對人體有益的功能，其中cis9,trans11-CLA為安全性較高的活性異構體。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是針對現(xiàn)有技術而提供一種富含梓樹酸的甘油二酯油組合物。

本發(fā)明所要解決的第二個技術問題是針對現(xiàn)有技術而提供一種上述富含梓樹酸的甘油二酯油組合物的制備方法。

本發(fā)明所要解決的第三個技術問題是針對現(xiàn)有技術而提供一種上述富含梓樹酸的甘油二酯油組合物的應用。

本發(fā)明解決第一個技術問題所采用的技術方案為：一種富含梓樹酸的甘油二酯油組合物，其特征在于，該甘油二酯油組合物按質量百分數(shù)計由以下組分構成：50～90％的甘油二酯、9～45％的甘油三酯、0.1～10％的甘油一酯和0.02～10％的殘留物，由上述甘油一酯、甘油二酯及甘油三酯組成的全部甘油酯中梓樹酸與脂肪酸的質量比為0.2～0.8:1，所述殘留物為游離脂肪酸和甘油。

本發(fā)明解決第二個技術問題所采用的技術方案為：上述方案中的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物的制備方法包括以下步驟：

第一步，梓樹酸的提?。?/p>

(1)預處理：將梓樹籽清洗、瀝干，40～60℃下干燥；

(2)梓樹酸甘油三酯提取：干燥后的梓樹籽粉碎后得干粉，干粉經(jīng)溶劑萃取超臨界萃取或直接冷壓壓榨得梓樹酸甘油三酯粗提物，梓樹酸甘油三酯粗提物經(jīng)脫膠、脫酸、脫色、脫臭、脫臘后精煉制得梓樹酸甘油三酯；

(3)梓樹酸的制備：將所述步驟(2)中制得的梓樹酸甘油三酯經(jīng)皂化、酸化后得到梓樹酸；

(4)純化：將步驟(3)獲得的梓樹酸和梓樹酸酯溶解在有機溶劑中，由兩步冷凍結晶法分離得到純度分別為95～98％的梓樹酸；

第二步，將上述提取的梓樹酸與甘油以2～10:1的比例混合形成混合物，在該混合物中加入lipozyme RMIM在真空下進行酶催化反應制得富含梓樹酸的甘油二酯油組合物粗品，反應溫度為30～60℃，反應時間8-12h，所述混合物與lipozyme RMIM的質量比為100～500:1；

第三步，對上述制得的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物粗品通過分子蒸餾分離脂肪酸和甘油一酯，然后再采用脫色、脫臭和過濾的方法精制獲得所需的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物。

作為優(yōu)選，所述步驟(2)中的萃取溶劑為正己烷、石油醚、乙醚、乙醇、甲醇、氯仿、正丁醇、丙酮、環(huán)己烷中的一種或幾種混合物。

作為優(yōu)選，所述兩步結晶法包括第一步結晶和第二步結晶，該第一步結晶的結晶溫度為4℃，結晶時間為8～16h，結晶壓力為常壓；第二步結晶的結晶溫度為-20℃～-70℃，結晶次數(shù)為3-5次，每次結晶時間為8～16h，結晶壓力為常壓。

本發(fā)明解決第三個技術問題所采用的技術方案為：該富含梓樹酸的甘油二酯油組合物在功能食品和藥物中的應用，所述功能食品和藥物至少用于控制體重、改善血脂或提高免疫力中的其中一方面。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明中的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物以甘油二酯形式與梓樹酸組合，與常規(guī)的甘油二酯產(chǎn)品相比，可增強對脂肪積聚的預防效果，從而達到控制體重的目的，并且該組合物除具有油的結構穩(wěn)定性外還具有梓樹酸的各種營養(yǎng)成分和生理學優(yōu)點，因此使得以該組合物為活性成分制備的產(chǎn)品與常規(guī)產(chǎn)品相比更具優(yōu)越性，尤其是既具有甘油二酯的減肥功效，同時也具有梓樹酸的抗炎、減肥等功效，因而使得該組合物可大量應用于具有控制體重、改善血脂以及提高免疫力等功效的功能食品和藥物中。同時，該組合物的制備過程中，以梓樹籽為原料制備梓樹酸，梓樹籽來源豐富，食用安全性高，且制得的梓樹酸純度高達95～98％，總之，該組合物的制備工藝簡單，成本低，具有廣闊的應用前景。

具體實施方式

以下結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。

實施例1：

收集梓樹籽，在40℃烘箱烘干后粉碎得干粉1000g，以5倍體積的石油醚在低于60℃下回流提取6h后得到綠色的甘油三酯粗提物，出油率為28.2％。取甘油三酯粗提物50mL加入2M 90％的氫氧化鉀乙醇溶液200mL于氮氣保護下60℃下皂化2h，加入50mL水后再加入50mL石油醚三次抽提除去不皂化合物，再加入6M鹽酸100mL中和酸化后用石油醚抽提去上層得到石油醚溶液，再經(jīng)過真空旋轉蒸發(fā)后得到梓樹酸粗提物。梓樹酸粗提物溶解在乙醇中，常壓下4℃結晶8h除去飽和脂肪酸，得到的乙醇溶液進一步在常壓下于零下20℃結晶16h，重復3次冷凍結晶分離得到高純度的梓樹酸。本實施例中采用上述工藝制得的梓樹酸經(jīng)氣相色譜分析純度達97％。

將上述提取的梓樹酸與甘油以2:1的比例混合形成混合物，在該混合物中加入 lipozyme RMIM(丹麥諾維信公司)在真空下進行酶催化反應制得富含梓樹酸的甘油二酯油組合物粗品，反應溫度為30℃，反應時間12h，上述混合物與lipozyme RMIM的質量比為100:1。對上述制得的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物粗品通過分子蒸餾分離脂肪酸和甘油一酯，然后再采用脫色、脫臭和過濾的方法精制獲得所需的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物。

經(jīng)檢測，本實施例制備的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物按質量分數(shù)計由以下組分構成：50％的甘油二酯、30％的甘油三酯、10％的甘油一酯和10％的殘留物，由上述甘油一酯、甘油二酯及甘油三酯組成的全部甘油酯中梓樹酸與脂肪酸的質量比為0.2:1，上述殘留物為游離脂肪酸和甘油。

實施例2：

收集梓樹籽，太陽光下自然風干后粉碎得粒徑0.4～0.5mm的干粉1000g，在30MPa、40℃條件下采用超臨界CO2萃取(江蘇南通市華安超臨界萃取裝置生產(chǎn)的HA221-50-06型超臨界萃取裝置)2h，在分離壓力15MPa、分離溫度50℃下得到綠色的甘油三酯粗提物(毛油)，出油率為30.2％；毛油經(jīng)脫膠、脫酸、脫色、脫臭、脫臘后精煉制得甘油三酯。取甘油三酯粗提物50mL加入2M 90％的氫氧化鉀乙醇溶液200mL于氮氣保護下60℃下皂化2h，加入50mL水后再加入50mL石油醚三次抽提除去不皂化合物，再加入6M鹽酸100mL中和酸化后用石油醚抽提去上層得到石油醚溶液，再經(jīng)過真空旋轉蒸發(fā)后得到梓樹酸粗提物。梓樹酸粗提物溶解在丙酮中，常壓下4℃結晶8h除去飽和脂肪酸，再在常壓下于零下45℃結晶8h，重復5多次冷凍結晶分離得到高純度的梓樹酸。本實施例中采用上述工藝制得的梓樹酸經(jīng)氣相色譜分析純度達95％。

將上述提取的梓樹酸與甘油以10:1的比例混合形成混合物，在該混合物中加入lipozyme RMIM(丹麥諾維信公司)在真空下進行酶催化反應制得富含梓樹酸的甘油二酯油組合物粗品，反應溫度為60℃，反應時間8h，上述混合物與lipozyme RMIM的質量比為500:1。對上述制得的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物粗品通過分子蒸餾分離脂肪酸和甘油一酯，然后再采用脫色、脫臭和過濾的方法精制獲得所需的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物。

經(jīng)檢測，本實施例制備的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物按質量分數(shù)計由以下組分構成：70％的甘油二酯、19％的甘油三酯、5％的甘油一酯和6％的殘留物，由上述甘油一酯、甘油二酯及甘油三酯組成的全部甘油酯中梓樹酸與脂肪酸的質量比為0.8:1，上述殘留物為游離脂肪酸和甘油。

實施例3：

收集梓樹籽，在40℃烘箱烘干后粉碎得干粉1000g，以5倍體積的氯仿和甲醇混合 溶液(體積比為1：1)在室溫下浸提24h后得到綠色的梓樹酸甘油三酯粗提物，出油率為29.7％。取甘油三酯粗提物100mL加入2M 90％的氫氧化鈉乙醇溶液400mL于氮氣保護下60℃下皂化2h，加入1000mL水后再加入100mL石油醚三次抽提除去不皂化合物，再加入6M鹽酸200mL中和酸化后用石油醚抽提去上層得到石油醚溶液，梓樹酸粗提物在常壓下4℃結晶10h除去飽和脂肪酸，然后再在常壓下于零下40℃結晶12h，重復4次冷凍結晶分離得到高純度的梓樹酸。本實施例中采用上述工藝制得的梓樹酸經(jīng)氣相色譜分析純度達96％。

將上述提取的梓樹酸與甘油以6:1的比例混合形成混合物，在該混合物中加入lipozyme RMIM(丹麥諾維信公司)在真空下進行酶催化反應制得富含梓樹酸的甘油二酯油組合物粗品，反應溫度為45℃，反應時間12h，上述混合物與lipozyme RMIM的質量比為300:1。對上述制得的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物粗品通過分子蒸餾分離脂肪酸和甘油一酯，然后再采用脫色、脫臭和過濾的方法精制獲得所需的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物。

經(jīng)檢測，本實施例制備的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物按質量分數(shù)計由以下組分構成：90％的甘油二酯、9％的甘油三酯、0.1％的甘油一酯和0.9％的殘留物，由上述甘油一酯、甘油二酯及甘油三酯組成的全部甘油酯中梓樹酸與脂肪酸的質量比為0.5:1，上述殘留物為游離脂肪酸和甘油。

實施例4：

收集梓樹籽，太陽光下自然風干后粉碎得粒徑0.4～0.5mm的干粉1000g，以5倍體積的石油醚在低于80℃下回流提取6h后得到梓樹酸甘油三酯粗提物，出油率為28.8％。梓樹酸甘油三酯粗提物經(jīng)脫膠、脫酸、脫色、脫臭、脫臘后精煉制得甘油三酯。取甘油三酯粗提物50mL加入2M 90％的氫氧化鉀乙醇溶液200mL于氮氣保護下60℃下皂化2h，加入50mL水后再加入50mL石油醚三次抽提除去不皂化合物，再加入6M鹽酸100mL中和酸化后用石油醚抽提去上層得到石油醚溶液，再經(jīng)過真空旋轉蒸發(fā)后得到梓樹酸粗提物。梓樹酸粗提物溶解在丙酮中，常壓下4℃結晶8h除去飽和脂肪酸，再在常壓下于零下45℃結晶8h，重復5多次冷凍結晶分離得到高純度的梓樹酸。本實施例中采用上述工藝制得的梓樹酸經(jīng)氣相色譜分析純度達95％。

將上述提取的梓樹酸與甘油以4:1的比例混合形成混合物，在該混合物中加入lipozyme RMIM(丹麥諾維信公司)在真空下進行酶催化反應制得富含梓樹酸的甘油二酯油組合物粗品，反應溫度為40℃，反應時間10h，上述混合物與lipozyme RMIM的質量比為200:1。對上述制得的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物粗品通過分子蒸餾分離脂肪酸和甘油一酯，然后再采用脫色、脫臭和過濾的方法精制獲得所需的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物。

經(jīng)檢測，本實施例制備的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物按質量分數(shù)計由以下組分構成：53.98％的甘油二酯、45％的甘油三酯、1％的甘油一酯和0.02％的殘留物，由上述甘油一酯、甘油二酯及甘油三酯組成的全部甘油酯中梓樹酸與脂肪酸的質量比為0.4:1，上述殘留物為游離脂肪酸和甘油。

實施例5：

5.1、富含梓樹酸(Catalpic acid)的甘油二酯油組合物對體重的控制作用

任取由上述實施例1～4中所制備的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物進行動物實驗，研究該組合物對體重和體脂的增加是否具有抑制作用。

6周齡的雄性ICR小鼠由浙江省實驗動物中心提供，ICR小鼠適應7天后隨機分為2組，每組10只。接下來6個星期中，2組小鼠除給喂飼料外，分別以富含梓樹酸的甘油二酯油組合物和梓樹酸甘油三酯油(梓樹酸含量為42％)每天50mg/kg體重的用量一次經(jīng)口灌胃給各小鼠，每兩周測定各小鼠的體重，所測體重的平均值如表1所示。從表1可以看出，與梓樹酸甘油三酯油組相比，富含梓樹酸的甘油二酯油組合物能顯著抑制小鼠體重增加速度，控制體重的增長。

表1富含梓樹酸的甘油二酯油組合物對小鼠體重的影響

5.2、對血脂的影響

任取由上述實施例1～4中所制備的富含梓樹酸的甘油二酯油組合物進行動物實驗，研究該組合物對血脂是否有改善作用。

6周齡的雄性ICR小鼠由浙江省實驗動物中心提供，ICR小鼠適應7天后隨機分為2組，每組10只。接下來6個星期中，2組小鼠除給喂飼料外，分別以富含梓樹酸的甘油二酯油組合物和梓樹酸甘油三酯油(梓樹酸含量為42％)每天50mg/kg體重的用量一次經(jīng)口灌胃給各小鼠，實驗結束后取雪測定測定小鼠血脂。所測血脂的平均值如表2所示。從表2可以看出，與梓樹酸甘油三酯油組相比，富含梓樹酸的甘油二酯油組合物能 顯著提高小鼠高密度脂蛋白膽固醇含量(HDL-C)，降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量，提高LDL-C與HDL-C的比值，這表明富含梓樹酸的甘油二酯油組合物能顯著改善小鼠血脂。

表2富含梓樹酸的甘油二酯油組合物對小鼠血脂的影響