表達9家族糖苷水解酶基因CtAA9d的畢赤酵母工程菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種表達嗜熱毛殼菌Chaetomium?thermophilum熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定9家族糖苷水解酶基因CtAA9d的畢赤酵母工程菌Pichia?pastoris?GS-CT-9D。通過RT-PCR方法從嗜熱毛殼菌Chaetomium?thermophilum獲得糖苷水解酶基因CtAA9d，將其克隆并插入到畢赤酵母整合表達載體pPIC9K中，然后將得到的糖苷水解酶基因CtAA9d表達載體pPIC9K/CtAA9d導入到畢赤酵母GS115中，再從中篩選出一種表達糖苷水解酶基因CtAA9d的酵母工程菌GS-CT-9D。該工程菌表達的糖苷水解酶CtAA9D對內(nèi)切纖維素酶的活性具有明顯的促進作用，混合酶比原始內(nèi)切酶N24的降解纖維素的活性提高1.6倍。在Mn2+條件下，CtAA9D和CtAA9D+N24的纖維素酶活性可分別提高15倍和2.5倍。CtAA9D具有良好的熱穩(wěn)定性和提高纖維素酶活力的能力，可廣泛用于纖維廢料及其它工業(yè)領域，具有重大經(jīng)濟價值和社會價值。
【專利說明】表達9家族糖苷水解酶基因CtAA9d的畢赤酵母工程菌株 (-)【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程，具體地說是一種表達具體地說是以嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9d的畢赤酵母工程菌株Pichia pastor is GS-CT-9D。
(二)【背景技術】
[0002]糖苷水解酶(英語:Glycoside hydrolases,又稱糖苷酶)是一種專門水解配糖鍵 (glycosidic bond)，并產(chǎn)生兩個較小的糖分子的酵素，也是自然界中的常見酵素之一。這類蛋白質(zhì)在人類的產(chǎn)業(yè)上也有所應用，例如用來將纖維素與半纖維素等生物質(zhì)能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多個家族。
[0003]嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum是一種廣泛分布于土壤中的嗜熱真菌。該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中50°C條件下可以產(chǎn)生熱穩(wěn)定的纖維素酶和9家族糖苷水解酶。
[0004]嗜熱毛殼菌產(chǎn)生的9家族糖苷水解酶CtAA9D具有微弱的纖維素酶活性，但對該菌株產(chǎn)生的內(nèi)切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進作用，可使其活性提高1.6倍。在不同金屬離子如Mn2+的作用下，CtAA9D和CtAA9D+N24的活性可分別提高15倍和2.5倍。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明從嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum獲得內(nèi)切(6-1, 4-葡聚糖酶基因的cDNA序列全長，命名為CtAA9d，CtAA9d基因DNA全長870bp，包括信號肽序列，起始密碼子和終止密碼子，無內(nèi)含子，編碼224個氨基酸，具有信號肽序列(l-22aa MKLSLASLLTAALSVQGHAIFQ)。將CtAA9d編碼的氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發(fā)現(xiàn)屬于糖苷水解酶第9家族。
[0006]構建重組表達 質(zhì)粒載體pPIC9K/CtAA9d，利用電轉(zhuǎn)儀進行電擊轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GSl 15，在MD和麗培養(yǎng)基上篩選，經(jīng)PCR鑒定篩選陽性轉(zhuǎn)化子，G418篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，然后進行甲醇誘導表達，獲得畢赤酵母工程菌株GS-CT-9D。該工程菌株接種于含 BMGY培養(yǎng)基中，在28°C 200rpm/min搖床培養(yǎng)6d后，糖苷水解酶的表達量為2.51mg/ml，分子量為25KDa，酶活力為0.0862U/ml, CtAA9D在65°C下是穩(wěn)定的，處理60min后仍有95%以上的酶活性；70°C處理30min后仍保持72.8%的活性；80°C處理30min后保持20.4%的活性；90°C處理30min活性幾乎完全喪失。
[0007]9家族糖苷水解酶CtAA9D對嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum內(nèi)切纖維素酶 N24的酶活性具有明顯的促進作用，混合酶比原始酶N24的降解纖維素的能力提高1.1倍。 不同金屬離子對CtAA9D和CtAA9D+N24混合酶活性具有促進或抑制作用，其中在Mn2+條件下，CtAA9D和CtAA9D+N24的纖維素酶活性可分別提高33倍和2.5倍。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】:[0008]圖19家族糖苷水解酶CtAA9D的SDS-PAGE分析
[0009]泳道1:低分子量蛋白標準
[0010]泳道2:純化的9家族糖苷水解酶CtAA9D
[0011]圖2 A: 9家族糖苷水解酶CtAA9D的最適溫度
[0012]B: 9家族糖苷水解酶CtAA9D的熱穩(wěn)定性測定
[0013]圖3 9家族糖苷水解酶CtAA9D對內(nèi)切纖維素酶N24活性的促進作用
[0014]圖4金屬離子Mn2+對CtAA9D纖維素酶及混合酶活性的影響
(五)【具體實施方式】
[0015]實施例1:嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum的分離鑒定
[0016](1)標本采集:從堆肥中采集。
[0017](2)分離培養(yǎng):將采集標本取0.5克放置在PDA平板上50°C培養(yǎng)3天后，進行分離純化。操作步驟參考Cooney and Emerson (1964)文獻。
[0018](3)鑒定:參考 Cooney and Emerson (1964)和 LaTouche (1950)文獻。
[0019]實施例2:糖苷水解酶基因CtAA9d的克隆
[0020](I)嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum總RNA的提取:參照Trizol試劑盒說明。
[0021](2)cDNA 第一條鏈的合成:按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3.0 試劑盒說明書進行:取I~2 ii g總RNA，加RNase Free ddH20至9.5 y L，將RNA樣品在 75°C變性5min，立即在冰浴中冷卻5min，然后稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各種成分:10mmol/L dNTP Mixture2 u L, IOXRT Buffer (Mg2+) 2 y L，25mmol/L MgCl24 u L, Oligo d(T)-Adaptor PrimerlU L, RNase Inhibiter0.5 U L, AMV Reverse TranscriptaselU L (Final Volume20 u L),將反應液混合后，室溫下放IOmin,然后42°C溫育60min,再煮沸 5min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。加入180 ii L DEPC處理的ddH20，稀釋至200 y L，混勻，稍微離心，保存于-20°C，備用。
[0022](3光0?反應(251^):。0嫩2111，10XBuffer2.5 u L, IOmmoI/L dNTP2 u L, 25mmol/ LMgCl2 L，上、下游引物各 L，Taq DNA 聚合酶 0.5 y L (5U/y L)，ddH2012 y L。反應條件為 94°C 5min 預變性；94°C 40s, 57°C 40s, 72°C lmin,共 32 個循環(huán)，72°C延伸 10min,4°C保存。
[0023]上游引物:5’ -ATGAAACTTTCCTTGGCGTCAC-3 ’
[0024]下游引物:5’ -TTAGCACGTGATGGGAGCCG-3 ’
[0025](4)基因克隆:取0.5iil PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接，操作步驟按照TAKARA 公司產(chǎn)品說明書進行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a菌株，在表面涂有氨卞青霉素 (100 u g/mL)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。
[0026](5)質(zhì)粒DNA的提取:堿法提取質(zhì)粒DNA。'
[0027](6)序列測定:DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司進行。序列引物為M13啟動子引物。嗜熱毛殼菌CtAA9d基因cDNA全長869bp，包含起始密碼子和終止密碼子，無內(nèi)含子，編碼175個氨基酸。將此氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發(fā)現(xiàn)屬于糖苷水解酶第9家族。該序列如下:[0028](A) SEQ ID NO I 的信息
[0029](a)序列特征:*長度:870堿基對；*類型:核酸；*鏈型:雙鏈；*拓撲結構:線性
[0030](b)分子類型:DNA
[0031](C)假設:否
[0032](d)反義:否
[0033](e)最初來源:嗜熱毛殼菌 Chaetomium thermophilum
[0034](f)序列描述:
[0035]
【權利要求】
1.一種表達嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9d的酵母工程菌株，其特征在于該菌為一種畢赤酵母，通過RT-PCR方法從嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum獲得熱穩(wěn)定9家族糖苷水解酶基因CtAA9d,將該基因克隆到畢赤酵母分泌型表達載體PPIC9K，獲得表達重組質(zhì)粒pPIC9K/CtAA9d，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15，從中篩選出表達熱穩(wěn)定糖苷水 解酶基因CtAA9d的畢赤酵母工程菌株GS-CT-9D，該糖苷水解酶CtAA9D對內(nèi)切纖維素酶的活性具有明顯的促進作用。
【文檔編號】C12N15/81GK103602604SQ201310422852
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年9月17日 優(yōu)先權日:2013年9月17日
【發(fā)明者】李多川, 韓超 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學