專利名稱:編碼糖基水解酶家族6的內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel6及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一個編碼糖基水解酶家族6的內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel6,該基因編碼的蛋白質(zhì)可用于降解纖維素。
背景技術(shù):
纖維素類物質(zhì)是自然界中含量最豐富、最廉價卻又未得到充分利用的可再生資源。纖維素是葡萄糖通過β_1,4糖苷鍵結(jié)合而成的高分子聚合物,纖維素是植物細胞壁的主要組分之一,占植物秸桿干重的40 50% (Lin Y, and S. Tanaka, 2006, Ethanolfermentation from biomass resources: current state and prospects.Appl. Microbiol.Biotechnol.,69(3):627-642.)。隨著燃油價格的持續(xù)不斷的增長和石油資源的匱乏,生物資源發(fā)酵生產(chǎn)酒精和寡糖類物質(zhì)越來越成為人類研究的熱點。纖維素通過水解作用生產(chǎn)葡萄糖,然后經(jīng)過生物發(fā)酵生成酒精,前景十分廣闊,不僅能降低二氧化碳的排放,還可以減少對汽油等非再生能源的依賴(于斌,齊魯,2006,木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇的研究現(xiàn)狀,化工進展,25 (3) :244 —249.)。目前降解纖維素的主要手段有酸水解、酶水解、熱水解、機械水解、離子輻射水角軍(John R, Whitaker, 1994, Principles of Enzymology for the FoodScience(SecondEdition). New York:Marcel Dekker :415-416.)。其中利用纖維素酶進行水解的條件溫和,易于控制,產(chǎn)物較為單純等方面的優(yōu)點,在降解纖維素生產(chǎn)糧食和能源方面具有相當巨大的潛力。通常纖維素酶可根據(jù)其不同的催化反應功能分為三種水解酶,分別為內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase,EC 3. 2. I. 4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase 或 exoglucohydrolase,EC3. 2. I. 91)和β -葡聚糖苷酶(β -glucosidase, EC3. 2. I. 21)。纖維素在這三種酶共同作用下可降解為葡萄糖,這三種酶被稱為“完全纖維素酶系”。內(nèi)切葡聚糖酶作用在纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)域,隨機切割纖維素多糖鏈1,4_糖苷鍵,產(chǎn)生不同長度的有非還原末端的小分子纖維素。纖維素酶屬于糖基水解酶類(glycosyl hydrolases),糖基水解酶有一個催化功能域和一個或多個其它的功能域組成,根據(jù)催化功能域的氨基酸序列相似性,糖基水解酶類被劃分成不同的家族(Davies G, Henrissat B. , 1995, Structures andmechanismsof glycosyl hydrolases. Structure 3:853-859·)。根據(jù) Cazy 服務(wù)器(hi:tp ://afmb.cnrs-mrs. fr/CAZY/)上所列糖基水解酶類,糖基水解酶類有108個家族,內(nèi)切葡聚糖酶分屬于糖基水解酶類家族 1,3,5,6,7,8,9,10,12,26,44,45,48,51,61,74。國內(nèi)外對纖維素酶有近40多年的研究,生產(chǎn)纖維素酶的生物也非常廣泛,絕大部分纖維素酶主要是由微生物發(fā)酵而產(chǎn)生,如細菌、真菌(木霉、青霉和曲霉)、放線菌等(Immanuel, R. Dhanusha, P Prema, et al, 2006, Effect of differentgrowthparameters on endoglucanase enzyme activity by bacteria isolated fromcoirretting effluents of estuarine environment.International Journal ofEnvironmentalScience and Technology, 3:25 - 34.),目前研究最清楚的是里氏木霉(Shin CS, LeeJP, Lee JS, et al,2000, Enzyme production of Trichodermaressei Rut C—30 onvarious lignocellulosic substrates. Applied Biochemistryand Biotechnology,84/86:237 - 245.)。除此之外,部分動物體內(nèi)也可以產(chǎn)生纖維素酶,如牛的胃、木蠹蛾的唾液和蝸牛的胃液等都含有豐富的纖維素酶(DuanCJ, Feng JX. , 2010, Miningmetagenomes for novel cellulase genes.BiotechnolLett. 32(12) :1765-75.)。目前,纖維素酶已經(jīng)被廣泛地應用于多個領(lǐng)域,主要有食品、釀酒、環(huán)保、飼料加工、紡織、農(nóng)業(yè)、日化等方面。在水果和蔬菜加工中由于植物細胞壁的主要成分是果膠、纖維素和半纖維素等,因此,在水果與蔬菜加工的過程中適當使用纖維素酶,可將纖維素水解成葡萄糖等有效成分。另一方面,還可使植物細胞壁發(fā)生不同程度變化,如軟化、膨脹、崩潰等,提高果蔬的可消化性,并使其口感更好;在白酒及其酒精生產(chǎn)中以纖維素為原料發(fā)酵生產(chǎn)酒精,使用的是二段法,即先用纖維素酶將纖維素糖化,再經(jīng)酵母發(fā)酵成酒精;在茶葉加工中用酶法低溫抽提,即先用纖維素酶將茶葉的細胞壁裂解抽提其中的有效成分,最后將 含有有效成分的抽提液濃縮干燥便可制成可溶性茶。與傳統(tǒng)的熱浸提法相比,此方法可提高有效成分的得率,同時還可保持茶葉原有的色香味;在活性物質(zhì)的提取中,如淀粉、蛋白質(zhì)、活性多糖等物質(zhì)的提取過程中,加入纖維素酶能大幅提高產(chǎn)品的收率(杜翠嬌,任河,杜建敏等,2011,纖維素酶及其應用,食品工程,2 :6-7.)以內(nèi)切葡聚糖酶為關(guān)鍵詞查找國家知識產(chǎn)權(quán)局專利檢索數(shù)據(jù)庫,共出現(xiàn)69項發(fā)明專利。其中有23項發(fā)明專利是描述編碼內(nèi)切葡聚糖酶的基因及其應用,而其他46項是與內(nèi)切葡聚糖酶在各種領(lǐng)域上的應用有關(guān)。在這23項與編碼內(nèi)切葡聚糖酶的基因及其應用相關(guān)的發(fā)明專利中的內(nèi)切葡聚糖酶基因分別來自于各種細菌、霉菌、未培養(yǎng)微生物或人工合成的,在這23項專利中還沒有一個內(nèi)切葡聚糖酶基因是來自于鏈霉菌的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從廣西南寧篩選到的鏈霉菌GX6的基因組中克隆到一個編碼糖基水解酶家族6的內(nèi)切葡聚糖酶基因,在大腸桿菌宿主細胞中表達該基因生產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶,并能以纖維素為原料降解生成葡萄寡糖。本發(fā)明涉及一個編碼糖基水解酶家族6的內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel6,其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。是從鏈霉菌GX6的基因組中克隆得到。該內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel6的序列是由999個堿基組成,含有完整的內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel6的開放閱讀框(Open ReadingFrame, ORF), Cel6基因的起始密碼子為GTG,終止密碼子為TGA。SEQ ID N0:2的蛋白質(zhì)是基因Cel6編碼的內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)物Cel6,由332個氨基酸組成,和Cel6催化功能域同源性最高的是與Streptomyces sp. el4 (鏈霉菌el4)的secreted endoglucanase (分泌型的內(nèi)切葡聚糖酶),兩者的一致性=255/296(86%),相似性=278/296(94%)?;駽el6在大腸桿菌中表達的重組產(chǎn)物Cel6能夠分解纖維素。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明基因的表達載體,及用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明基因的宿主。
本發(fā)明提供了一個編碼糖基水解酶家族6的內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel6,該基因所編碼糖基水解酶家族6的內(nèi)切葡聚糖酶在分解纖維素的用途。
圖I是篩選含有內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel6重組菌株的CMC選擇平板圖。從圖I 了解到,含有內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel6的重組菌株能夠在CMC選擇平板上形成透明圈。
具體實施例方式下述實施方法是為了更好的解釋本發(fā)明,而不應該被解釋為限制本發(fā)明的目的。在本發(fā)明的實施例中所用到的材料包括大腸桿菌(Escherichia coli)株系XLl-blue,購自TaKaRa公司,表達載體pSE380,購自Invitrogen公司,CMC (carboxylmethylcellulose,羧甲基纖維素鈉,購自Sigma公司,以及購自TaKaRa、MBI的限制性內(nèi)切酶、修飾酶等試劑。下面將通過實施例對本發(fā)明作詳細描述I)鏈霉菌Streptomyces GX6基因組DNA的提取鏈霉菌Sti^ptomyces GX6的基因組DNA是按照BioFlux公司的細菌基因組DNA提取試劑盒 Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit (目錄號 BSC12S1)的使用說明來提取的。將提取好的鏈霉菌Sti^ptomyces GX6的基因組DNA送華大基因公司測定基因組序列。2)鏈霉菌Sti^ptomyces GX6的基因組序列中編碼內(nèi)切葡聚糖基因序列的分析將獲得的鏈霉菌Streptomyces GX6的基因組序列用NCBI (NationalCenterfor Biotechnology Information, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)上的軟件 ORFfinder(http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/Rorf/orfiR. cri)和 Blast(http://blast. ncbi.nlm. nih. gov/Blast. cgi)進行分析。結(jié)果共獲得3個與內(nèi)切葡聚糖酶具有較高同源性的開放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF),本發(fā)明只涉及其中一個0RF。3)編碼糖基水解酶家族6的內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel6的核苷酸序列分析基因Cel6的開放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF)由999個核苷酸組成,序列如SEQ ID NO :1。其中,Cel6基因的起始密碼子為GTG,終止密碼子為TGA。4)編碼糖基水解酶家族6的內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel6編碼的產(chǎn)物Cel6的氨基酸序列分析內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel6編碼一個含332個氨基酸的蛋白質(zhì),用DNAStar軟件預測該蛋白質(zhì)的理論分子量大小為34932. 69道爾頓。用簡單組件結(jié)構(gòu)研究工具(SimpleModular Architecture ResearchTool, SMART, http://smart, embl-heidelberg. de)分析內(nèi)切葡聚糖酶 Cel6 的組件結(jié)構(gòu),結(jié)果是自N端的47 — 322位氨基酸殘基為糖基水解酶家族6 (glycosyl hydrolase)的纖維素酶功能域。5)編碼糖基水解酶家族6的內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel6的克隆和表達
使用上游引物5’ -TCGCCATGGTGCACCACCACCACCACCACGTCGTGGGGACGGCGCTGCTGGCCG-3 ’(含有 Nco I 位點和 6 X Hi s-tag )和下游引物 5 ’ -ACTAAGCTTTCACCCGCCGGCCCGGGCCAGCTGC-3’(含有HindIII位點),通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel6,用限制性內(nèi)切酶NcoI和HindIII酶切內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel6后,與經(jīng)NcoI和HindIII酶切的表達載體PSE380進行連接。再將連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XLl-blue中,涂布到含100 μ g/mL氨芐青霉素的LA平板上。轉(zhuǎn)化得到的單菌落點板至含有100 μ g/mL氨芐青霉素和O. 5% (ff/V) CMC (羧甲基纖維素鈉)的LA平板上,將平板置于37°C恒溫箱培養(yǎng)8小時,對每個轉(zhuǎn)點菌落逐個滴加I μ I 1% (ff/V)的IPTG誘導表達,然后將平板置于37°C恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)7小時。時間到后,進行氯仿熏蒸破胞,再把平板置于37°C恒溫箱使表達的Cel6酶與CMC反應7小時。用O. 1%的剛果紅溶液染色15分鐘后,再用IM的NaCl溶液脫色。觀察選擇平板。然后進一步提取在選擇平板上能形成透明圈的克隆子的質(zhì)粒DNA,并將其命名為pSE-Cel6,用限制性內(nèi)切酶NcoI和HindIII完全酶切pSE_Cel6后,進行O. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果pSE-Cel6除有一個約4. Ikb的DNA片段外,還有一條大小約為Ikb的DNA片段。 將含有質(zhì)粒pSE_Cel6的大腸桿菌單菌落接種到含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,37 °C振蕩培養(yǎng),待OD6tltl為O. 4時,加入終濃度為O. 5mmol/L IPTG、終濃度為100mmol/L山梨醇和終濃度為2. 5mmol/L甜菜喊,20°C誘導20小時。IlOOOrpm離心3min,收集菌體,用4mL 100mmol/L的pH 7. O磷酸緩沖液重懸菌體,超聲波破胞9min。12000rpm離心lOmin,上清即為含有內(nèi)切葡聚糖酶Cel6的粗酶液。6)編碼糖基水解酶家族6的內(nèi)切葡聚糖酶Cel6酶活力的測定取10 μ I內(nèi)切葡聚糖酶Cel6的粗酶液,加入250 μ I IOOmmoI/L的pH 7. O磷酸緩沖液,與250 μ I 2% CMC溶液混合,在37°C作用30分鐘后,加入1000 μ I DNS溶液,放置沸水中反應5分鐘,室溫冷卻,用分光光度計測吸光度OD53tl。吸光度測定值與不同含量的葡萄糖吸光度標準曲線圖作比較計算酶活。所述DNS試劑配制稱取I克NaOH用約40mL ddH20溶解,再稱取I克二硝基水楊酸、0. 2克苯酚、0. 05克無水亞硫酸鈉、20克四水酒石酸鉀鈉,將其溶解于約30mLddH20中,兩種溶液混合,定容到100mL。內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力單位(IU)定義為每分鐘催化產(chǎn)生Iymol還原糖所需的酶量。內(nèi)切葡聚糖酶Cel6的水解CMC活性為16. 78U。
權(quán)利要求
1.一個編碼糖基水解酶家族6的內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel6,其特征在于,其核苷酸序列如 SEQ ID NO 1 所示。
2.權(quán)利要求I的基因所編碼的蛋白質(zhì),其氨基酸序列如SEQID NO 2所示。
3.—種表達載體,其特征在于,它含有權(quán)利要求I所述的基因。
4.一種宿主細胞,其特征在于,它含有權(quán)利要求3所述表達載體轉(zhuǎn)化的原核細胞或真核細胞。
5.權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)在降解纖維素中的應用。
全文摘要
一個編碼糖基水解酶家族6的內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel6及其應用,其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示,上述基因編碼的內(nèi)切葡聚糖酶Cel6,其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示,該酶在分解纖維素中的應用。
文檔編號C12R1/465GK102899340SQ20121041898
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月27日
發(fā)明者黃日波, 杜麗琴, 韋宇拓, 譚慧敏, 韋航, 吳倩倩 申請人:廣西大學