一種脂肪酶催化在線合成6″-o-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脂肪酶催化在線合成6″-O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯的方法，所述方法為：以摩爾比為1∶1～12的新橙皮苷二氫查爾酮與月桂酸乙烯酯為原料，以0.5～1.0g脂肪酶Lipozyme?RMIM為催化劑，以叔戊醇和DMSO的混合溶劑為反應(yīng)溶劑，將脂肪酶Lipozyme?RMIM均勻填充在微流控通道反應(yīng)器的反應(yīng)通道中，所述微流控通道反應(yīng)器的反應(yīng)通道內(nèi)徑為0.8～2.4mm，反應(yīng)通道長(zhǎng)為0.5～1.0m；使原料和反應(yīng)溶劑連續(xù)通入反應(yīng)通道中進(jìn)行?；磻?yīng)，控制?；磻?yīng)溫度為40～55℃，?；磻?yīng)時(shí)間為20～40min，在線收集反應(yīng)液，反應(yīng)液經(jīng)常規(guī)后處理得到6″-O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯。本發(fā)明具有反應(yīng)時(shí)間短、選擇性高及產(chǎn)率高的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種脂肪酶催化在線合成6 " -O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯的方法
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及一種脂肪酶催化在線可控選擇性合成6" -O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯的方法。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]新橙皮苷二氫查爾酮(Neohesperidin dihydrochalcone)是將從天然柑橘類植物中分離提取得到的新橙皮苷經(jīng)過氧化而成的黃酮類衍生物，其甜度為蔗糖的500~700倍，其有高甜度、低熱量、無(wú)毒、安全等特點(diǎn)，具有抗癌、抑菌、抗氧、降膽固醇等多種生物活性，因此應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和日化工業(yè)。除此以外，新橙皮苷二氫查爾酮口感清爽，帶有特別的清香，有著極佳的屏蔽苦味的作用，因此新橙皮苷二氫查爾酮特別適用于蔬菜食品加工、果醬、口香糖、牙膏及口含藥片中。
[0003]據(jù)研究黃酮類化合物的各種生物活性都是以抗氧化活性為基礎(chǔ)的，與抗自由基或抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)。特殊的結(jié)構(gòu)賦予它一系列獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)，如能與多種金屬離子發(fā)生絡(luò)合或靜電作用，具有還原和捕獲自由基的特性以及諸多衍生化反應(yīng)活性等。黃酮類化合物抑制低密度脂蛋白LDL氧化和抑制類胡蘿卜素及不飽和脂肪酸氧化的研究表明，苷元比糖苷具有更優(yōu)秀的抗氧化活性。這是由于苷元親脂性強(qiáng)，能嵌入生物膜疏水層的內(nèi)核中發(fā)揮作用。黃酮苷類化合物的多羥基及糖基結(jié)構(gòu)使其具有一定的親水性，這勢(shì)必會(huì)影響抗氧化活性。黃酮類化合物通過酯化修飾，在分子中引入長(zhǎng)烴鏈可以增加它的脂溶性，從而增加和脂肪的相容性及提高抗氧化性。那么，新橙皮苷二氫查爾酮作為應(yīng)用最多的黃酮類化合物之一，研究開發(fā)其生理活性更強(qiáng)的新橙皮苷二氫查爾酮脂肪酸酯必將具有良好的應(yīng)用前
旦
-5^ O
[0004]目前，新橙皮苷二氫查爾酮脂肪酸酯的合成途徑主要是在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行酶促反應(yīng)，對(duì)糖基上的羥基進(jìn)行?；?，具體包括酰化、酯化和酯交換反應(yīng)三種方法。雖然酶促反應(yīng)有反應(yīng)條件溫和，選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，但是酶催化反應(yīng)也存在一些局限性，比如酶的活性與有機(jī)溶劑的極性之間的制約，有機(jī)溶劑的極性與反應(yīng)底物的溶解性之間的制約，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化率不高等技術(shù)瓶頸。因此，尋找新橙皮苷二氫查爾酮酶促選擇性酯化新技術(shù)對(duì)于發(fā)展新橙皮苷二氫查爾酮脂肪酸酯的生產(chǎn)具有重要意義。
[0005]微流控學(xué)(Microfluidics)是在微米級(jí)結(jié)構(gòu)中操控納升至皮升體積流體的技術(shù)與科學(xué)，是近十年來迅速崛起的新交叉學(xué)科。當(dāng)前，微流控學(xué)的發(fā)展已大大超越了原來的主要為分析化學(xué)服務(wù)的目的，而正在成為整個(gè)化學(xué)學(xué)科、生命科學(xué)、儀器科學(xué)乃至信息科學(xué)新一輪創(chuàng)新研究的重要技術(shù)平臺(tái)。
[0006]自1997年Harrison課題組發(fā)表了首篇在微流控芯片微反應(yīng)器中合成化合物的文獻(xiàn)后，微流控芯片反應(yīng)器已成功地用于多種有機(jī)合成反應(yīng)，并展示了廣泛的應(yīng)用前景。隨著微流控芯片中微混合、微反應(yīng)技術(shù)的發(fā)展，在芯片中進(jìn)行合成反應(yīng)已經(jīng)成為微流控芯片領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。[0007]同常規(guī)化學(xué)反應(yīng)器相比，微通道反應(yīng)器不僅具有使反應(yīng)物間的擴(kuò)散距離大大縮短，而且傳質(zhì)速度快；反應(yīng)物配比、溫度、反應(yīng)時(shí)間和流速等反應(yīng)條件容易控制，副反應(yīng)較少；需要反應(yīng)物用量甚微，不但能減少昂貴、有毒、有害反應(yīng)物的用量，反應(yīng)過程中產(chǎn)生的環(huán)境污染物也極少，是一種環(huán)境友好、合成研究新物質(zhì)的技術(shù)。
[0008]目前，有較多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)有機(jī)介質(zhì)中黃酮類化合物的酶促區(qū)域選擇性酯化進(jìn)行了研究，但是針對(duì)新橙皮苷二氫查爾酮的酶促改性的研究還沒有。并且已報(bào)道的有機(jī)介質(zhì)中黃酮類化合物的酶促區(qū)域選擇性酯化方法往往需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間(24h)，且反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率與選擇性不高，利用微流控技術(shù)探索新的合成反應(yīng)，用以解決現(xiàn)有合成方法的技術(shù)瓶頸是當(dāng)今國(guó)際國(guó)內(nèi)的研究熱點(diǎn)。我們研究小組前期也對(duì)微流控反應(yīng)器中糖類化合物的酶促選擇性合成進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)利用微流控技術(shù)進(jìn)行糖類化合物的酶促選擇性合成具有一定的可行性。而新橙皮苷二氫查爾酮是將從天然柑橘類植物中分離提取得到的新橙皮苷經(jīng)過氧化而成的黃酮類衍生物，具有良好的抗癌、抑菌、抗氧化、降膽固醇、降低毛細(xì)血管脆性、改善微循環(huán)等多種生物活性。對(duì)新橙皮苷二氫查爾酮的區(qū)域選擇性酯化修飾不僅可以提高生物利用率，還可以拓展其在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用。并且新橙皮苷二氫查爾酮是一類含糖黃酮類衍生物，我們可以利用前期的研究基礎(chǔ)對(duì)新橙皮苷二氫查爾酮的酶促區(qū)域選擇性酯化進(jìn)行研究。因此我們研究了微流控通道反應(yīng)器中脂肪酶催化選擇性合成6" -O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯的方法，旨在尋找一種高效環(huán)保的新橙皮苷二氫查爾酮月桂酸單酯的在線可控選擇性合成方法。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種微流控通道反應(yīng)器中脂肪酶催化選擇性合成6" -O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯的新工藝，具有反應(yīng)時(shí)間短、選擇性高及產(chǎn)率高的優(yōu)點(diǎn)。
[0010]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0011 ] 一種脂肪酶催化在線合成6 " -O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯的方法，所述方法采用微流控通道反應(yīng)器，所述的微流控通道反應(yīng)器包括注射泵、注射器、反應(yīng)通道和產(chǎn)物收集器，所述注射器安裝于注射泵中，通過第一接口與反應(yīng)通道的入口連通，所述產(chǎn)物收集器通過第二接口與反應(yīng)通道的出口連通，所述反應(yīng)通道內(nèi)徑為0.8~2.4_，反應(yīng)通道長(zhǎng)為
0.5~1.0m ;所述方法包括:以物質(zhì)的量之比為1:1~1: 12的新橙皮苷二氫查爾酮與月桂酸乙烯酯為原料，以0.5~1.0g脂肪酶Lipozyme RMIM為催化劑，以叔戍醇和二甲亞砜(DMSO)的混合溶劑為反應(yīng)溶劑，將脂肪酶Lipozyme RM頂均勻填充在反應(yīng)通道中，將原料和反應(yīng)溶劑置于注射器中，注射器在注射泵的推動(dòng)下將原料和反應(yīng)溶劑連續(xù)通入反應(yīng)通道中進(jìn)行?；磻?yīng)，控制?；磻?yīng)溫度為40~55°C，酰化反應(yīng)時(shí)間為20~40min，通過產(chǎn)物收集器在線收集反應(yīng)液，反應(yīng)液經(jīng)后處理制得6" -O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯。
[0012]本發(fā)明采用的微流控通道反應(yīng)器中，所述注射器數(shù)目可以是一個(gè)或多個(gè)，視具體反應(yīng)需求而定。比如，當(dāng)使用兩個(gè)注射器時(shí)，可采用T型或Y型接口與反應(yīng)通道的入口相連通，使不同的反應(yīng)物從兩個(gè)入口引入，匯流進(jìn)入公共的反應(yīng)通道，通過微通道的中反應(yīng)物分子接觸與碰撞幾率增大，使兩股反應(yīng)液流在公共的反應(yīng)通道中混合并進(jìn)行反應(yīng)。注射泵將多個(gè)注射器同步進(jìn)行推動(dòng)。[0013]所述的微流控通道反應(yīng)器還包括恒溫箱，所述的反應(yīng)通道置于恒溫箱中，例如恒溫箱將反應(yīng)通道封在箱內(nèi)，以此可以有效控制反應(yīng)溫度。所述的恒溫箱可以根據(jù)反應(yīng)溫度要求自行選擇，比如水浴恒溫箱等。
[0014]本發(fā)明對(duì)于反應(yīng)通道的材質(zhì)不限，推薦使用綠色、環(huán)保的材質(zhì)，例如硅膠管；對(duì)于反應(yīng)通道的形狀最好為曲線形，可以保證反應(yīng)液勻速穩(wěn)定的通過。
[0015]本發(fā)明在實(shí)施過程中，可先用叔戊醇和DMSO的混合溶劑(叔戊醇:DMS0=4: I)溶解新橙皮苷二氫查爾酮，其用量只要保證新橙皮苷二氫查爾酮能充分溶解即可，并裝于注射器中備用；僅用無(wú)毒的叔戊醇溶解月桂酸乙烯酯，裝于另一注射器中備用；然后在注射泵(例如PHD2000注射泵)的同步推動(dòng)下使原料和反應(yīng)溶劑通入反應(yīng)通道中進(jìn)行反應(yīng)。因此，本發(fā)明中，反應(yīng)溶劑中叔戊醇和DMSO體積比大于4: 1，相比于常規(guī)的搖床反應(yīng)，可以將有毒的DMSO的使用量降至最低。
[0016]較為優(yōu)選的，本發(fā)明所述的方法包括下列步驟:
[0017]先用體積比為4: 1的叔戊醇和DMSO的混合溶劑溶解新橙皮苷二氫查爾酮，裝于注射器中備用；用叔戊醇溶解月桂酸乙烯酯，裝于另一注射器中備用；兩支注射器通過Y型接口與反應(yīng)通道的入口相連通，然后在注射泵的同步推動(dòng)下將原料和反應(yīng)溶劑通入反應(yīng)通道中進(jìn)行?；磻?yīng)。
[0018]當(dāng)使用兩個(gè)注射器分別向反應(yīng)通道注入溶有新橙皮苷二氫查爾酮的叔戊醇和DMSO的混合溶液以及溶有月桂酸乙烯酯的叔戊醇溶液時(shí)，用于溶解月桂酸乙烯酯的叔戊醇的體積用量與溶解新橙皮苷二氫查爾酮的叔戊醇和DMSO的混合溶劑的體積用量?jī)?yōu)選是相等的，以便于保證進(jìn)入反應(yīng)通道時(shí)兩種原料摩爾比的一致性。
[0019]所述用于溶解新橙皮苷二氫查爾酮的叔戊醇和DMSO的混合溶劑的體積用量通常以新橙皮苷二氫查爾酮的物質(zhì)的量計(jì)為10~25mL/mmol。
[0020]本發(fā)明中，所述的脂肪酶Lipozyme RMIM使用諾維信(novozymes)公司生產(chǎn)的商品，是一種從Rhizomucor miehei得到的脂肪酶,是用一種基因改性的米曲霉(Aspergillusoryzae)微生物經(jīng)過深層發(fā)酵而生產(chǎn)。Lipozyme RM IM是顆粒狀產(chǎn)品,粒度為0.2-0.6mm。
[0021]本發(fā)明方法將脂肪酶Lipozyme RMM均勻填充在反應(yīng)通道，通過機(jī)械方法直接將顆粒狀的催化劑均勻固定于反應(yīng)通道內(nèi)即可。
[0022]進(jìn)一步，所述新橙皮苷二氫查爾酮與月桂酸乙烯酯的摩爾比優(yōu)選為1: 8~12，最優(yōu)選為1: 8。
[0023]進(jìn)一步，所述?；磻?yīng)溫度優(yōu)選為52~55°C，最優(yōu)選為52 °C。
[0024]進(jìn)一步，所述?；磻?yīng)時(shí)間優(yōu)選為30~40min,最優(yōu)選為35min?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)注射泵來調(diào)節(jié)反應(yīng)通道內(nèi)流體的流速進(jìn)而調(diào)節(jié)原料在反應(yīng)通道內(nèi)的停留時(shí)間，即反應(yīng)時(shí)間。
[0025]本發(fā)明的反應(yīng)產(chǎn)物可以在線收集，所得反應(yīng)液可以通過常規(guī)后處理方法即可獲得6" -O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯。所述常規(guī)后處理方法可以是:所得反應(yīng)液減壓蒸餾除去溶劑，剩余物經(jīng)硅膠柱層析分離，用200-300目硅膠濕法裝柱，洗脫試劑為乙酸乙酯、甲醇、水體積比為25: 2.5: 0.6的混合溶劑，剩余物用少量洗脫試劑溶解后濕法上柱，收集洗脫液，同時(shí)TLC跟蹤洗脫進(jìn)程，將得到的含有單一產(chǎn)物的洗脫液合并蒸干，可以得到淡黃色的單酯晶體，即為6" -O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯。
[0026]本發(fā)明使用的反應(yīng)通道內(nèi)徑為2_，反應(yīng)通道長(zhǎng)為1.0m。反應(yīng)通道內(nèi)徑和長(zhǎng)度會(huì)影響反應(yīng)通道內(nèi)的流體流速及停留時(shí)間，但對(duì)反應(yīng)本身不造成直接影響。
[0027]本發(fā)明中，雖然在新橙皮苷二氫查爾酮中有6個(gè)性能相近的羥基，但在微流控微通道反應(yīng)器中脂肪酶催化選擇性合成6" -O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯具有較高的轉(zhuǎn)化率和選擇性，二酯的轉(zhuǎn)化率很低，幾乎沒有，通過柱層析分離得到的單酯的含量100%。產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR確證。這表明微流控微通道反應(yīng)器中新橙皮苷二氫查爾酮月桂酸酯的酶促選擇性合成具有很好的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率及選擇性，能實(shí)現(xiàn)高的單酯化率。
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明微流控通道反應(yīng)器中選擇性合成新橙皮苷二氫查爾酮-6" -O-月桂酸酯，該法不僅大大地縮短了反應(yīng)時(shí)間，而且具有高的轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)選擇性；同時(shí)降低了 DMSO的使用量，具有環(huán)保優(yōu)勢(shì)。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為本發(fā)明實(shí)施例采用的微流控通道反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖。 (五)【具體實(shí)施方式】
[0030]下面以具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此:
[0031]本發(fā)明實(shí)施例使用的微流控通道反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)參考圖1，包括一個(gè)注射泵(未顯示)、兩個(gè)注射器1、反應(yīng)通道3、水浴恒溫箱(5，僅顯示其平面示意圖)和產(chǎn)物收集器4 ;兩個(gè)注射器I安裝于注射泵中，通過一個(gè)Y型接口與反應(yīng)通道3的入口連通，所述反應(yīng)通道3置于水浴恒溫箱5中，通過水浴恒溫箱5控制反應(yīng)溫度，所述的反應(yīng)通道3的內(nèi)徑2.0mm,管長(zhǎng)lm，所述反應(yīng)通道3的出口通過一接口與產(chǎn)物收集器4連通。
[0032]實(shí)施例1:6" -O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯的合成
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一種脂肪酶催化在線合成6" -O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯的方法，其特征在于所述方法采用微流控通道反應(yīng)器，所述的微流控通道反應(yīng)器包括注射泵、注射器、反應(yīng)通道和產(chǎn)物收集器，所述注射器安裝于注射泵中，通過第一接口與反應(yīng)通道的入口連通，所述產(chǎn)物收集器通過第二接口與反應(yīng)通道的出口連通，所述反應(yīng)通道內(nèi)徑為0.8~2.4_，反應(yīng)通道長(zhǎng)為0.5~1.0m;所述方法包括:以物質(zhì)的量之比為1:1~12的新橙皮苷二氫查爾酮與月桂酸乙烯酯為原料，以0.5~1.0g脂肪酶Lipozyme RMIM為催化劑，以叔戊醇和二甲亞砜的混合溶劑為反應(yīng)溶劑，將脂肪酶Lipozyme RM頂均勻填充在反應(yīng)通道中，將原料和反應(yīng)溶劑置于注射器中，注射器在注射泵的推動(dòng)下將原料和反應(yīng)溶劑連續(xù)通入反應(yīng)通道中進(jìn)行?；磻?yīng)，控制酰化反應(yīng)溫度為40~55°C，?；磻?yīng)時(shí)間為20~40min，通過產(chǎn)物收集器在線收集反應(yīng)液，反應(yīng)液經(jīng)后處理制得6" -O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯。
2.如權(quán)利要求1所述的脂肪酶催化在線合成6"-O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯的方法，其特征在于:所述的方法包括下列步驟:先用體積比為4: I的叔戊醇和DMSO的混合溶劑溶解新橙皮苷二氫查爾酮，裝于注射器中備用；用叔戊醇溶解月桂酸乙烯酯，裝于另一注射器中備用；兩支注射器通過Y型接口與反應(yīng)通道的入口相連通，然后在注射泵的同步推動(dòng)下將原料和反應(yīng)溶劑通入反應(yīng)通道中進(jìn)行酰化反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求1所述的脂肪酶催化在線合成6"-O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯的方法，其特征在于:所述微流控通道反應(yīng)器包括恒溫箱，所述反應(yīng)通道置于恒溫箱中。
4.如權(quán)利要求2所述的脂肪酶催化在線合成6"-O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯的方法，其特征在于:所述微流控通道反應(yīng)器包括恒溫箱，所述反應(yīng)通道置于恒溫箱中。
5.如權(quán)利要求1~4之一所述的脂肪酶催化在線合成6"-O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯的方法，其特征在于 :所述新橙皮苷二氫查爾酮與月桂酸乙烯酯的物質(zhì)的量之比為1: 8~12。
6.如權(quán)利要求1~4之一所述的脂肪酶催化在線合成6"-O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯的方法，其特征在于:所述酰化反應(yīng)溫度為52~55°C，所述?；磻?yīng)時(shí)間為30~40mino
7.如權(quán)利要求5所述的脂肪酶催化在線合成6"-O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯的方法，其特征在于:所述新橙皮苷二氫查爾酮與月桂酸乙烯酯的物質(zhì)的量之比為1: 8。
8.如權(quán)利要求6所述的脂肪酶催化在線合成6"-O-月桂酰-新橙皮苷二氫查爾酮酯的方法，其特征在于:所述?；磻?yīng)溫度為52°C，所述?；磻?yīng)時(shí)間為35min。
【文檔編號(hào)】C12P19/44GK103667394SQ201310392183
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月2日
【發(fā)明者】羅錫平, 杜理華, 何鋒, 凌慧敏, 楊文俊 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué)