一株耐鹽堿長枝木霉及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株耐鹽堿長枝木霉及其應(yīng)用。本發(fā)明的耐鹽堿長枝木霉的菌株號為29TJ04,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC?No.7976。本發(fā)明的長枝木霉29TJ04能耐受80g/L以下鹽濃度引起的鹽脅迫和pH8.0以下的堿脅迫。在鹽堿土壤中引進(jìn)本發(fā)明的長枝木霉29TJ04，通過生物防治可以有效地防治真菌病害并可以有效的改善環(huán)境，維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)平衡。
【專利說明】一株耐鹽堿長枝木霉及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株耐鹽堿長枝木霉及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]木霉菌(Trichoderma spp.)屬于半知菌類的絲孢綱,叢梗孢目，叢梗孢科,廣泛存在于土壤中。1932年，Weindling發(fā)現(xiàn)木素木霉(Trichoderma Iignorum)可以寄生于多種植物病原真菌，建議將該菌用于土傳植物病害的生物防治，木霉菌生防研究工作從此開始。20世紀(jì)70年代以來，國內(nèi)外學(xué)者對木霉菌的拮抗作用及其機制作了大量深入的研究。K.Rinu(2013)等的研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)可引起病原菌結(jié)構(gòu)畸變，進(jìn)而引發(fā)形態(tài)畸變，從而抑制其孢子生長。李沖偉(2012)等的研究指出木霉菌產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)可破壞病原菌的防護(hù)系統(tǒng)和代謝途徑，從而抑制其生長。除了生防功能外，木霉菌株還可以促進(jìn)多種植物種子萌發(fā)、植株生長和開花、提高作物產(chǎn)量。關(guān)于其促生機制的研究也已比較深入,Hexon Angel Contreras-Corne jo等(2009)的研究指出，木霉菌通過生長素依賴機制增加植物的生物產(chǎn)量，刺激側(cè)根生長，從而促進(jìn)植物生長；還有研究(K.Rinu, 2013;戚瑋真，2012，等)發(fā)現(xiàn)部分木霉菌具有溶解可溶性或微溶性礦物質(zhì)的能力，促進(jìn)植物對礦物質(zhì)的吸收，從而促進(jìn)植物生長。
[0003]煙草猝倒病俗稱“倒苗病”、“塌皮爛”，其病原菌主要是由腐霉屬真菌引起，猝倒病在幼苗生長的任何時期都可發(fā)生，但在三葉期以前幼苗出土至大十字期最易發(fā)病，根、莖、葉均可受害。發(fā)病初期幼苗基部呈褐色水潰狀軟腐，真葉局部發(fā)生褐色水潰狀斑，發(fā)病后期莖部似沸水燙過，呈暗綠色；然后病部腐爛并逐漸干縮，病苗猝然萎蔫、折倒、干枯、死亡，苗床通常連片發(fā)病，煙苗成片倒伏死亡。天氣潮濕時，腐爛部分常產(chǎn)生白色菌絲。煙苗病死后，在苗床上形成“補丁狀”病區(qū)，嚴(yán)重時整畦煙苗所剩無幾。4一6葉期的幼苗也可被害，受病植株停止生長，葉片呈蒼黃色，病苗根部發(fā)生水潰狀腐爛，皮層易自中柱剝離。如病菌從土面侵害煙株，則根不變色，但`移栽后如環(huán)境條件有利，在莖的近土面處產(chǎn)生褐色水潰傷痕，進(jìn)而莖部破碎或皺縮干癟。成株期受害，也多從莖基部開始，病部表現(xiàn)污白色或褐色水腐狀病斑，并沿土層向上、下發(fā)展，最后使莖基部組織腐爛，引起整株枯萎。特別是在澇害之后，有時在煙株中部也可產(chǎn)生大塊褐色塊斑。自80年代以來，煙草猝倒病的發(fā)生范圍、危害程度均迅速擴大，在山東、河南、安徽、云南、貴州、四川、福建、黑龍江和臺灣等省都有流行，是全國各煙區(qū)普遍發(fā)生的一種苗床期主要病害，已成為煙草生產(chǎn)上的嚴(yán)重威脅。
[0004]煙草黑脛病俗稱“黑根”、“黑桿瘋”，多發(fā)生于成株期，也有少數(shù)苗床期發(fā)生。幼苗染病時，莖基部出現(xiàn)污黑色病斑，或從底葉發(fā)病沿葉柄蔓延至幼莖，引致幼苗猝倒，濕度大時，病部長滿白色菌絲，幼苗成片死亡，莖桿染病時，莖基部初呈水潰狀黑斑，后向上下及髓部擴展，繞莖I周時，植株萎蔫死亡?？v剖病莖，可見髓部黑褐色壞死并干縮呈“筍節(jié)”狀，“節(jié)”間長滿白色絮狀菌絲。葉片染病時，初為水潰狀暗綠色小斑，后擴大為中央黃褐色壞死、邊緣不清晰隱約有輪紋呈”膏藥”狀黑斑.潮濕條件下，表面會生白色絨毛狀物，是煙草上為害最嚴(yán)重的病害之一。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國煙草黑脛病平均每年發(fā)病面積高達(dá)76373hm2，產(chǎn)量損失2869.26萬千克，產(chǎn)值損失超過1.23億元人民幣。
[0005]目前生產(chǎn)上多采用化學(xué)藥劑防治，但是長期大量地使用農(nóng)藥致使病原菌產(chǎn)生抗性，且嚴(yán)重破壞農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，造成對環(huán)境的污染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一株耐鹽堿長枝木霉及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供的耐鹽堿長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum),菌株號為29TJ04，已于2013年07月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC N0.7976。長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum) 29TJ04CGMCC N0.7976 在下文中簡稱長枝木霉 29TJ04。
[0008]實驗證明長枝木霉29TJ04能耐受80g/L以下(如50g/L以下或20g/L以下、50g/L-80g/L、20g/L-80g/L或20g/L_50g/L)的鹽引起的鹽脅迫和pH8.0以下的堿脅迫。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述鹽脅迫由含80g/L、50g/L或20g/L的NaCl環(huán)境引起。
[0009]所述長枝木霉29TJ04可以分生孢子、厚垣孢子、菌絲或含有分生孢子和菌絲的菌絲體的形式存在。
[0010]本發(fā)明所提供的長枝木霉29TJ04的應(yīng)用為下述任一種:
[0011]1、長枝木霉29TJ04在防治植物病害中的應(yīng)用。
[0012]2、長枝木霉29TJ04和/或長枝木霉29TJ04的代謝物在制備植物病原菌抑制劑中的應(yīng)用。
[0013]3、長枝木霉29TJ04和/或長枝木霉29TJ04的代謝物在制備植物病害抑制劑中的應(yīng)用。
[0014]4、植物病原菌抑制劑或植物病害抑制劑，它的活性成分是長枝木霉29TJ04和/或長枝木霉29TJ04的代謝物。
[0015]5、防治煙草煙草猝倒病和/或煙草黑脛病的方法，包括用長枝木霉29TJ04菌懸浮液燒灌煙草植株的步驟；每株煙草植株的用量為(5-10) X IO5Cfu長枝木霉29TJ04。
[0016]在本發(fā)明的一個實施方式中，所述長枝木霉29TJ04菌懸浮是用水懸浮長枝木霉29TJ04得到的液體。
[0017]上文中，所述防治植物病害可為防治植物在鹽堿脅迫環(huán)境中的所述植物病害。所述植物病害可為真菌病害。所述真菌病害可為煙草猝倒病和煙草黑脛病中的至少一種。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述煙草粹倒病由瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)引起，所述煙草黑胚病由寄生疫霉煙草致病變種(Phytophthora parasitica var.nicotianae)引起。
[0018]上文中，所述防治具體可為預(yù)防和/或治療。所述長枝木霉29TJ04的代謝物可從長枝木霉29TJ04的發(fā)酵液中獲得。所述長枝木霉29TJ04的代謝物具體可按照如下方法制備，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)長枝木霉29TJ04，除去液體培養(yǎng)物(發(fā)酵液)中的長枝木霉29TJ04即得到所述長枝木霉29TJ04的代謝物。
[0019]上文中，所述植物病原菌抑制劑和植物病害抑制劑中除所述活性成分外，還含有載體。所述載體可為農(nóng)藥領(lǐng)域常用的且在生物學(xué)上是惰性的載體。所述載體可為固體載體或液體載體；所述固體載體可為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料可為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料可為玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一種；所述高分子化合物可為聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液體載體可為有機溶劑、植物油、礦物油或水；所述有機溶劑可為癸烷和/或十二烷。
[0020]所述植物病原菌抑制劑和植物病害抑制劑中，所述長枝木霉29TJ04可以分生孢子、厚垣孢子、菌絲或含有分生孢子和菌絲的菌絲體的形式存在。
[0021]所述植物病原菌抑制劑和植物病害抑制劑的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑或水分散粒劑。
[0022]根據(jù)需要，所述植物病原菌抑制劑和植物病害抑制劑中還可添加表面活性劑(如吐溫20、吐溫80等)、粘合劑、穩(wěn)定劑(如抗氧化劑)、pH調(diào)節(jié)劑等。
[0023]本發(fā)明制劑中的長枝木霉29TJ04的分生孢子數(shù)量隨劑型和施用的方法而變化。固體制劑中，分生孢子的數(shù)量為(IX IO4)- (IXlO8)Cfu/克，如(IX IO6)- (IX IO7)個Cfu/克。對于液體制劑，稀釋后的噴灑液中分生孢子的含量通常為(1.0Xio4)- (5.0X107)cfu孢子 /mL,如(1-3) X 105cfu/mLo
[0024]所述植物病原菌抑制劑和植物病害抑制劑可以與其它適合的化學(xué)農(nóng)藥配合使用，從而降低化學(xué)農(nóng)藥劑的用量，減少對環(huán)境的污染。
[0025]實驗證明，本發(fā)明的長枝木霉29TJ04能耐受80g/L以下鹽濃度引起的鹽脅迫和PH8.0以下的堿脅迫，對煙草猝倒病和煙草黑脛病的防治效果分別為50%和100%，在鹽堿土壤中引進(jìn)本發(fā)明的長枝木霉29TJ04，通過生物防治可以有效地防治真菌病害并可以有效的改善環(huán)境，維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)平衡。
[0026]生物材料保藏說明`
[0027]1、分類命名:哈茨木霉(Trichoderma harzianum),
[0028]菌株編號:29HB16，
[0029]保藏機構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，
[0030]保藏機構(gòu)簡稱:CGMCC，
[0031]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，
[0032]保藏日期:2013年07月31日，
[0033]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.7975。
[0034]2、分類命名:長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum),
[0035]菌株編號:29TJ04，
[0036]保藏機構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，
[0037]保藏機構(gòu)簡稱:CGMCC，
[0038]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，
[0039]保藏日期:2013年07月31日，
[0040]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.7976。
[0041]下面結(jié)合具體實施例詳細(xì)描述本發(fā)明，這些實施例用于理解而不是限制本發(fā)明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1為編號為29TJ04的木霉菌株對猝倒病病菌和黑脛病病菌的抑制作用。[0043]A為編號為29TJ04的木霉菌株與猝倒病病菌的對峙培養(yǎng)平板；
[0044]B為只接種猝倒病病菌的平板；
[0045]C為編號為29TJ04的木霉菌株與黑脛病病菌的對峙培養(yǎng)平板；
[0046]D為只接種黑脛病病菌的平板。
[0047]圖2為編號為29TJ04的木霉菌株的菌落形態(tài)和顯微照片。
[0048]圖3為編號為29HB16的木霉菌株的菌落形態(tài)和顯微照片。
[0049]圖4為編號為29HB16的木霉菌株對猝倒病病菌和黑脛病病菌的抑制作用。
[0050]A為編號為29HB16的木霉菌株與猝倒病病菌的對峙培養(yǎng)平板；
[0051]B為只接種猝倒 病病菌的平板；
[0052]C為編號為29HB16的木霉菌株與黑脛病病菌的對峙培養(yǎng)平板；
[0053]D為只接種黑脛病病菌的平板。
【具體實施方式】
[0054]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0055]下述實施例中所用的黑脛病致病菌為寄生疫霉卵菌綱真菌寄生疫霉煙草致病變種(Phytophthora parasitica var.nicotianae),在中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心的保藏編號為ACCC38065，收藏日為2011年8月10日，自收藏之日起，公眾可從中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心獲得該菌株，下述實施例中均簡稱為黑脛病病菌。
[0056]實施例中所用的根腐病(粹倒病)致病菌為瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum),在中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心的保藏編號為ACCC38064，收藏日為2011年8月10日，自收藏之日起公眾可從中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心獲得該菌株，下述實施例中均簡稱為猝倒病病菌。
[0057]實施例中所用的編號為ACCC32522的木霉菌株(長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)),在中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心的保藏編號為ACCC32522，收藏日為2013年3月23日，自收藏之日起公眾可從中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心獲得該菌株。
[0058]實施例中所用的編號為ACCC32524的木霉菌株(哈茨木霉(Trichodermaharzianum)),在中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心的保藏編號為ACCC32524，收藏日為2013年3月23日，自收藏之日起公眾可從中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心獲得該菌株。
[0059]實施例1、哈茨木霉29HB16和長枝木霉29TJ04的特性及鑒定
[0060]1.1 土壤樣品來源采自天津、河北地區(qū)的鹽堿地。
[0061]1.2培養(yǎng)基
[0062]馬鈴薯去皮，200g切成小塊，加水煮沸30min，4層紗布過濾，加20g葡萄糖，蒸餾水定容到IOOOmL,煮沸混勻，得到不含氯化鈉的H)液體培養(yǎng)基。
[0063]馬鈴薯去皮，200g切成小塊，加水煮沸30min，4層紗布過濾，加20g葡萄糖，20g瓊月旨，蒸餾水定容到IOOOmL,煮沸混勻，得到不含氯化鈉的PDA培養(yǎng)基。
[0064]耐鹽堿木霉菌選擇性固體培養(yǎng)基:分別向上述不含氯化鈉的PDA培養(yǎng)基中加入氯化鈉至氯化鈉的含量為 20g/L (0.34mol/L)，50g/L (0.86mol/L)或 80g/L (L4mol/L)，均調(diào)節(jié)pH為8.0，得到氯化鈉含量為20g/L的耐鹽堿木霉菌選擇性培養(yǎng)基(簡稱20g/LNaCl耐鹽堿木霉菌選擇性培養(yǎng)基)、氯化鈉含量為50g/L的耐鹽堿木霉菌選擇性培養(yǎng)基(簡稱50g/LNaCl耐鹽堿木霉菌選擇性培養(yǎng)基)和氯化鈉含量為80g/L的耐鹽堿木霉菌選擇性培養(yǎng)基(簡稱80g/LNaCl耐鹽堿木霉菌選擇性培養(yǎng)基)。
[0065]耐鹽堿木霉菌選擇性液體培養(yǎng)基:分別向上述不含氯化鈉的ro液體培養(yǎng)基中加入氯化鈉至氯化鈉的含量為 20g/L (0.34mol/L), 50g/L (0.86mol/L)或 80g/L (1.4mol/L),均調(diào)節(jié)pH為8.0，得到氯化鈉含量為20g/L的耐鹽堿木霉菌選擇性液體培養(yǎng)基(簡稱20g/LNaCl耐鹽堿木霉菌選擇性液體培養(yǎng)基)、氯化鈉含量為50g/L的耐鹽堿木霉菌選擇性液體培養(yǎng)基(簡稱50g/LNaCl耐鹽堿木霉菌選擇性液體培養(yǎng)基)和氯化鈉含量為80g/L的耐鹽堿木霉菌選擇性液體培養(yǎng)基(簡稱80g/L NaCl耐鹽堿木霉菌選擇性液體培養(yǎng)基)。
[0066]以上培養(yǎng)基菌種115 °C條件下滅菌20分鐘。
[0067]1.3耐鹽堿木霉菌株的分離篩選及基本生物學(xué)特性分析
[0068]1.3.1耐鹽堿木霉菌株的分離篩選采用稀釋涂布法由上述耐鹽堿木霉菌選擇性固體培養(yǎng)基分離菌株，挑取不同形態(tài)的木霉菌菌落進(jìn)行純化，轉(zhuǎn)接至上述20g/LNaCl耐鹽堿木霉菌選擇性培養(yǎng)基斜面保存。
[0069]結(jié)果共得到可耐受80g/LNaCl濃度、pH8.0的木霉菌株20株。其中，編號為29HB16、29TJ04、ACCC32522和ACCC32524的四株木霉菌的土樣信息如表I所示。
[0070]表I四株木霉菌土樣信息`
[0071]
【權(quán)利要求】
1.長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum),其特征在于:所述長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)的菌株號為29TJ04,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC N0.7976。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長枝木霉，其特征在于:所述長枝木霉耐受80g/L以下鹽濃度引起的鹽脅迫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的長枝木霉，其特征在于:所述長枝木霉耐受pH8.0以下的堿脅迫。
4.權(quán)利要求1-3中任一所述的長枝木霉在防治植物病害中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1-3中任一所述的長枝木霉和/或所述長枝木霉的代謝物在制備植物病原菌抑制劑或植物病害抑制劑中的應(yīng)用。
6.植物病原菌抑制劑或植物病害抑制劑，它的活性成分是權(quán)利要求1-3中任一所述的長枝木霉和/或所述長枝木霉的代謝物。
7.如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用或權(quán)利要求6所述的抑制劑，其特征在于:所述植物病害為真菌病害。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用或抑制劑，其特征在于:所述真菌病害為煙草猝倒病和/或煙草黑脛病。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述防治植物病害為防治植物在鹽堿脅迫環(huán)境中的所述植物病害。
10.防治煙草煙草猝倒病和/或煙草黑脛病的方法，包括用權(quán)利要求1-3中任一所述的長枝木霉的菌懸浮液澆灌煙草植株的步驟；每株煙草植株的用量為(5-10)X IO5Cfu所述長枝木霉。
【文檔編號】C12R1/885GK103451112SQ201310392175
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月2日
【發(fā)明者】顧金剛, 崔西苓, 李世貴, 雷強, 劉好寶, 屈健康, 王倩, 張良, 龔明波 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所