一種里氏木霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種里氏木霉菌株(Trichoderma reesei)，其保藏號為：CGMCC No.9644。另外，本發(fā)明還公開了所述里氏木霉菌株在生產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的里氏木霉菌株具有更強的纖維素酶生產(chǎn)能力，蛋白分泌能力更強，相比于出發(fā)菌株，其濾紙酶活最高值提高了13～31％。CGMCC No.96442014.09.09
【專利說明】一種里氏木霉菌株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，尤其涉及一種里氏木霉菌株及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是自然界中分布最廣、數(shù)量最多的的生物質(zhì)資源，也是最廉價的可再生資 源。目前，利用可再生的纖維素資源生產(chǎn)多種生物燃料和生物基產(chǎn)品已成為克服能源危機 的有效途徑之一。在生產(chǎn)多種生物燃料和生物基產(chǎn)品的流程中，纖維素降解是整個過程至 關(guān)重要的一步。纖維素的降解方法主要有化學水解法和酶水解法兩種。與化學水解法相比， 纖維素酶降解纖維素反應(yīng)條件溫和、特異性高、環(huán)境友好等特點，因而受到廣泛關(guān)注。
[0003] 當前，纖維素酶生產(chǎn)中面臨著纖維素酶酶活低、生產(chǎn)周期長、誘導(dǎo)物成本高等瓶頸 問題。纖維素酶的生產(chǎn)主要采用液體發(fā)酵培養(yǎng)，由于液體發(fā)酵過程中涉及的影響因素較多， 再考慮到生產(chǎn)菌株本身的特性及誘導(dǎo)物的種類，所以纖維素酶合成過程及其復(fù)雜。因此，為 了解決這個瓶頸問題，一方面是從菌株本身角度考慮，提高菌株的產(chǎn)纖維素酶的能力；另一 方面，通過調(diào)控外部的培養(yǎng)條件、添加誘導(dǎo)物等方式提高產(chǎn)酶縮短生產(chǎn)周期。而從上述兩個 方面來講，改善菌株的本身生產(chǎn)性能是降低纖維素酶生產(chǎn)成本的根本解決方式。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于提供一種高產(chǎn)纖維素酶的里氏木霉菌株。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的在于提供里氏木霉菌株在生產(chǎn)纖維素酶的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0007]一種里氏木霉菌株（Trichodermareesei)，其保藏號為：CGMCCNo. 9644,保藏單 位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期：2014年09月09日。
[0008] 本發(fā)明提供所述里氏木霉菌株在生產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明所述的里氏木霉菌株具有以下的有益效果：本發(fā)明所述的里氏木霉菌株具 有更強的纖維素酶生產(chǎn)能力，蛋白分泌能力更強，相比于出發(fā)菌株，其濾紙酶活最高值提高 了 13?31%，蛋白含量提高了 9?31%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1為本發(fā)明所述的致死率曲線，橫坐標為誘變實驗的反應(yīng)時間，單位為分鐘 (min)，縱坐標為致死率，單位為％ ;
[0011] 圖2為本發(fā)明所述的突變菌株DES1-DES19以及出發(fā)菌株RutC30的濾紙酶活的 柱狀圖，橫坐標為菌株編號，縱坐標為濾紙酶活，單位為IU·mr1 ;
[0012] 圖3(a)為本發(fā)明所述的實施例三中高產(chǎn)菌株DES-15和出發(fā)菌株RutC30在發(fā)酵 過程中濾紙酶活的變化曲線，橫坐標為發(fā)酵時間，單位為小時（h)，縱坐標為濾紙酶活，單位 為IU^mr1，圖3(b)為本發(fā)明所述的實施例三中高產(chǎn)菌株DES-15和出發(fā)菌株RutC30在 發(fā)酵過程中蛋白含量的變化曲線，橫坐標為發(fā)酵時間，單位為小時（h)，縱坐標為濾紙酶活， 單位為IU?πιΓ1，圖3 (a)和圖3(b)中，方塊代表出發(fā)菌株RutC30,三角形代表高產(chǎn)菌株 DES-15 ；
[0013] 圖4(a)、圖4(b)、圖4(c)、圖4(d)、圖4(e)分別代表實施例三中高產(chǎn)菌株DES-15 在第1個、第2個、第3個、第4個和第5個時間點的菌絲照片，圖4 (f)、圖4 (g)、圖4 (h)、圖 4⑴和圖4(j)分別代表實施例三中出發(fā)菌株RutC30在第1個、第2個、第3個、第4個和 第5個時間點上的菌絲照片，第1個時間點為發(fā)酵過程中的第1個24小時，以后每隔24小 時取一次樣，并拍攝菌絲照片。
[0014] 生物保藏說明
[0015]高產(chǎn)菌株DES-15:分類命名：里氏木霉，（Trichodermareesei)，保藏號為：CGMCC No. 9644,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期：2014年09月09日；
[0016]出發(fā)菌株RutC30:分類命名：里氏木霉，（Trichodermareesei)，保藏號為： CICC13052,該菌株購自于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文 字能夠據(jù)以實施。
[0018] 實施例一利用出發(fā)菌株RutC30誘變得到高產(chǎn)菌株DES-15
[0019] 本發(fā)明所述的高產(chǎn)菌株DES-15是通過硫酸二乙酯誘變得到的，進行6組誘變實 驗，6組誘變實驗的反應(yīng)時間分別為5min、10min、20min、30min、40min和50min，其他條件均 一致。
[0020] 誘變實驗的具體過程為：將出發(fā)菌株RutC30接于PDA平板中在30°C下培養(yǎng)5-7 天，至孢子鋪滿平板為止。用磷酸緩沖液（PH7. 0)沖洗孢子，3層擦鏡紙過濾得到孢子懸液， 將孢子懸液稀釋到IO6個/ml。將IOml稀釋后的孢子懸液中加入0.2ml硫酸二乙酯（簡稱 DES)，室溫搖床中反應(yīng)一定時間（轉(zhuǎn)速為IOOrpm)，反應(yīng)結(jié)束后加入Iml25%的硫代硫酸鈉 終止反應(yīng)。
[0021] 將DES處理后的孢子懸液梯度稀釋，稀釋到10'HT5和KT6稀釋倍數(shù)的孢子懸液 100μ1涂于PDA平板中，于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，統(tǒng)計6組誘變實驗的PDA平板 上的菌落數(shù)。以接有出發(fā)菌株RutC30的平板為對照組，依據(jù)下列公式計算出每組誘變實 驗的致死率，繪制致死率曲線（如圖1所示），其中反應(yīng)時間為橫坐標，以致死率為縱坐標。 致死率的計算公式為 ：
[0022] 致死率（％ ) = [(對照組菌落數(shù)-誘變實驗菌落數(shù)）/對照組菌落數(shù)]X100 %。
[0023] 從圖1中可知，隨著反應(yīng)時間的增加，致死率也增加了。當致死率達到80%時，獲 得正突變菌株的可能性最高。因此，選擇致死率為80%，即從第6組誘變實驗（反應(yīng)時間為 50min)所得到的突變菌株中進行篩選。
[0024] 實施例二高產(chǎn)菌株DES-15的篩選
[0025] 從長出菌落的平板（第6組誘變實驗的）隨機挑取菌株60株，接于新的PDA平板 純化培養(yǎng)。將隨機挑選的60株菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天后進行濾紙酶活的測定。發(fā) 酵條件為：26°C，170rpm，初始pH4.5。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：微晶纖維素33g/L，玉米漿干粉 17g/L，硫酸銨5g/L，碳酸鈣2. 5g/L，磷酸二氫鉀6g/L，硫酸鎂lg/L。所得發(fā)酵液4°C離心， 收集上清液進行濾紙酶活測定。圖2中最左側(cè)一項表示出發(fā)菌株RutC30的濾紙酶活，另 外還展示了菌株DES1-DES19的濾紙酶活，從圖2中可知，菌株DES-15為酶活提高最多的菌 株，即本發(fā)明所述的高產(chǎn)菌株，將其用于后續(xù)研究。
[0026] 實施三出發(fā)菌株RutC30和高產(chǎn)菌株DES-15的酶活比較
[0027] 分別采用出發(fā)菌株RutC30和高產(chǎn)菌株DES-15進行以下實驗，兩個菌株的實驗條 件完全一致。
[0028] 將菌株的孢子懸液接于種子培養(yǎng)基中，170rpm，30°C培養(yǎng)24h;長好的種子再接于 含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，接種量為3 %。種子培養(yǎng)基成分為：微晶纖維素20g/L， 玉米漿干粉17g/L，葡萄糖2g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基成分與種子培養(yǎng)基成分一致。發(fā)酵罐控制條 件為：pH5.0,溫度26°C，溶氧30%，壓力為0.05Mpa。在一系列的發(fā)酵時間點取樣，離心收 集上清液進行濾紙酶活和蛋白含量測定。由圖3(a)和圖3(b)可以看出，在整個發(fā)酵過程 中高產(chǎn)菌株DES-15的濾紙酶活和蛋白含量均高于出發(fā)菌株RutC30,高產(chǎn)菌株DES-15的濾 紙酶活最高值出現(xiàn)在124h，出發(fā)菌株的濾紙酶活最高值出現(xiàn)在120h。另外，為了進一步說 明高產(chǎn)菌株DES-15在生產(chǎn)纖維素酶方面的優(yōu)越性，還將高產(chǎn)菌株的酶活最高值、蛋白濃度 與出發(fā)菌株RutC30的酶活最高值、蛋白濃度進行比較，并計算濾紙酶活提高率（具體數(shù)值 見表1)和蛋白質(zhì)含量提高率（具體數(shù)值見表2)。
[0029] 實施例四
[0030] 分別采用出發(fā)菌株RutC30和高產(chǎn)菌株DES-15進行以下實驗，兩個菌株的實驗條 件完全一致。發(fā)酵過程中，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與實施例三一致。發(fā)酵過程中， 發(fā)酵罐內(nèi)的PH值控制為4.0,其他條件與實施例三相同。實驗顯示，整個發(fā)酵過程中，高產(chǎn) 菌株DES-15的濾紙酶活和蛋白含量均高于出發(fā)菌株RutC30,二者濾紙酶活最高值都出現(xiàn) 在124h。將高產(chǎn)菌株的酶活最高值、蛋白濃度與出發(fā)菌株RutC30的酶活最高值、蛋白濃度 進行比較，并計算濾紙酶活提高率（具體數(shù)值見表1)和蛋白質(zhì)含量提高率（具體數(shù)值見表 2)。
[0031] 實施例五
[0032] 分別采用出發(fā)菌株RutC30和高產(chǎn)菌株DES-15進行以下實驗，兩個菌株的實驗條 件完全一致。種子培養(yǎng)基的成分為：微晶纖維素l〇g/L，玉米漿干粉17g/L，葡萄糖2g/L;發(fā) 酵培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基相同。其他發(fā)酵條件與實施例三相同。實驗顯示，整個發(fā)酵 過程中，高產(chǎn)菌株DES-15的濾紙酶活和蛋白含量均高于出發(fā)菌株RutC30,二者的濾紙酶 活最高值都出現(xiàn)在124h。將高產(chǎn)菌株的酶活最高值、蛋白濃度與出發(fā)菌株RutC30的酶活 最高值、蛋白濃度進行比較，并計算濾紙酶活提高率（具體數(shù)值見表1)和蛋白質(zhì)含量提高 率（具體數(shù)值見表2)。
[0033] 實施例六
[0034] 分別采用出發(fā)菌株RutC30和高產(chǎn)菌株DES-15進行以下實驗，兩個菌株的實驗條 件完全一致。種子培養(yǎng)基的成分為：氣爆玉米秸桿30g/l，玉米漿干粉17g/L，葡萄糖2g/L， 發(fā)酵培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基的成分相同。發(fā)酵過程中的其他條件與實施例三相同。實驗顯 示，整個發(fā)酵過程中，高產(chǎn)菌株DES-15的濾紙酶活和蛋白含量均高于出發(fā)菌株RutC30,二 者的濾紙酶活最高值都出現(xiàn)在124h。將高產(chǎn)菌株的酶活最高值、蛋白濃度與出發(fā)菌株Rut C30的酶活最高值、蛋白濃度進行比較，并計算濾紙酶活提高率（具體數(shù)值見表1)和蛋白質(zhì) 含量提高率（具體數(shù)值見表2)。
[0035] 實施例七
[0036] 分別采用出發(fā)菌株RutC30和高產(chǎn)菌株DES-15進行以下實驗，兩個菌株的實驗條 件完全一致。種子培養(yǎng)基的成分為：玉米芯30g/l，玉米漿干粉17g/L，葡萄糖2g/L，發(fā)酵培 養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基的成分相同。發(fā)酵過程中，其他條件與實施例三相同。實驗顯示，整個發(fā) 酵過程中，高產(chǎn)菌株DES-15的濾紙酶活和蛋白含量均高于出發(fā)菌株RutC30,二者的濾紙 酶活最高值都出現(xiàn)在124h。將高產(chǎn)菌株的酶活最高值、蛋白濃度與出發(fā)菌株RutC30的酶 活最高值、蛋白濃度進行比較，并計算濾紙酶活提高率（具體數(shù)值見表1)和蛋白質(zhì)含量提 高率（具體數(shù)值見表2)。
[0037] 表1高產(chǎn)菌株DES-15和出發(fā)菌株RutC30的濾紙酶活的比較
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 一種里氏木霉菌株（Trichoderma reesei)，其保藏號為：CGMCC No. 9644。
2. 如權(quán)利要求1所述的里氏木霉菌株在生產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/14GK104263658SQ201410504700
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】赫榮琳, 李晨, 張東遠, 陳樹林 申請人:中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所