一種橘綠木霉m-13及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物和水處理領(lǐng)域，公開了一種保藏號(hào)為CGMCC?No.8332的橘綠木霉M-13，這種微生物可用于還原或吸附Cr6+，用于處理含Cr6+的水體，對(duì)受污染水體有修復(fù)作用，可用于污水處理。本發(fā)明將上述微生物用于處理污水，工藝較簡(jiǎn)單，處理效率高，成本低，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】—種橘綠木霉M-13及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物和水處理領(lǐng)域，具體為一種可以還原水體中Cr6+的橘綠木霉?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]目前重金屬對(duì)水體污染越來越嚴(yán)重，而且重金屬在水體中的濃度和種類大大增加。某些金屬不僅由于價(jià)格昂貴，還會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境、人體健康危害極其嚴(yán)重，因此如何有效地處理廢水中的重金屬已經(jīng)越來越重要和急迫。
[0003]鉻廣泛存在于自然界中，例如巖石、土壤、植物體、動(dòng)物體和火山等。鉻污染主要由電鍍，制革，冶金等生產(chǎn)過程中的廢水造成的。鉻離子主要以三價(jià)陽離子和六價(jià)陰離子形式存在。Cr(VI)可溶，有劇毒和致癌；Cr (III)微溶，毒性較低，Cr (VI)比Cr(III)移動(dòng)性強(qiáng)，所以Cr(VI)對(duì)人體和動(dòng)物體危害更大，有文獻(xiàn)報(bào)道Cr (VI)毒性是Cr(III)的100倍，而且還會(huì)影響植物的生長(zhǎng)和改變其形態(tài)。[0004]傳統(tǒng)對(duì)重金屬處理方法包括沉淀法、化學(xué)氧化還原法、離子交換法、電化學(xué)法等。但這些方法存在去除不徹底、操作繁瑣、運(yùn)行成本高、費(fèi)用昂貴和造成二次污染等缺點(diǎn)。微生物處理法作為新型高效環(huán)保的重金屬廢水處理技術(shù)，已成為研究的熱點(diǎn)。微生物吸附法利用微生物自身的特性來吸附溶于水體的重金屬，具有原料來源豐富、品種多、成本低、在低濃度下處理效果好、吸附容量大、速度快、選擇性好，同時(shí)吸附設(shè)備簡(jiǎn)單、易操作等優(yōu)勢(shì)。微生物吸附法主要以活微生物細(xì)胞和死微生物細(xì)胞兩種形式來吸附重金屬離子，雖然已經(jīng)報(bào)道顯示活細(xì)胞比死細(xì)胞更具有去除重金屬離子的效果，但選擇死細(xì)胞對(duì)處理重金屬廢水更加有利，因?yàn)樗兰?xì)胞不會(huì)受重金屬毒性的影響，也不需要持續(xù)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且可以重復(fù)利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在提供一種可還原或吸附六價(jià)鉻的霉菌。
[0006]本發(fā)明還將上述霉菌用于處理含六價(jià)鉻或其他重金屬離子的水體。
[0007]一種橘綠木霉M-13，保藏號(hào)為CGMCC N0.8332 (保藏機(jī)構(gòu):中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所;保藏日其月:2013年10月12曰)，分類命名:橘綠木霉Trichoderma Citrinoviride0并且,這種橘綠木霉M-13的tef序列如SEQ ID.N0.1所示。
[0008]本文從重金屬污染的土壤分離篩選出具有高效吸附和還原能力的霉菌，以一定量死的細(xì)胞投放到Cr (VI)水溶液中，測(cè)定這些霉菌對(duì)Cr (VI)的修復(fù)能力，并對(duì)修復(fù)功能最好的霉菌進(jìn)行鑒定，得到一種橘綠木霉M-13。
[0009]上述橘綠木霉M-13可用于還原或吸附Cr6+，用于處理含Cr6+的水體。
[0010]用上述橘綠木霉M-13處理含Cr6+水體的方法，步驟包括:將上述的橘綠木霉M-13的菌絲體干燥后，置于含Cr6+的水體中，25~30°C處理24~96小時(shí)。優(yōu)選的，處理時(shí)以50~200rpm速度進(jìn)行震蕩處理。[0011]干燥的菌絲體與所處理的水體用量比為5g/L~50g/L。更優(yōu)選的，干燥的菌絲體與所處理的水體用量比為15g/L~25g/L。
[0012]這種橘綠木霉M-13的培養(yǎng)方法為:用霉菌培養(yǎng)基，如馬丁液體培養(yǎng)基、馬鈴薯液體培養(yǎng)基或查氏瓊脂培養(yǎng)基(Czapek yeast autolysate agar),在25~35°C下培養(yǎng)72h。(馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，在28°C下培養(yǎng)48h ;馬丁液體培養(yǎng)基，在28°C下培養(yǎng)72h ;查氏瓊脂培養(yǎng)基(Czapek yeast autolysate agar),在 25°C下培養(yǎng) 5d。).[0013]結(jié)果顯示，上述菌株干燥后得到的死細(xì)胞可將水體中的六價(jià)鉻還原為三價(jià)鉻，并且能吸附部分鉻元素。
[0014]本發(fā)明獲得了一種新型微生物，可以吸附和還原水體中的六價(jià)鉻，對(duì)受污染水體有修復(fù)作用，可用于污水處理。本發(fā)明工藝較簡(jiǎn)單，處理效率高，成本低，具有良好的應(yīng)用前
景
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明霉菌M-13的形態(tài)圖，圖a和b分別表示M_13的孢子梗和孢子頭
[0016]圖2為本發(fā)明霉菌M-13與其他木霉家族的關(guān)系圖
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1
[0018]菌株來源
[0019]上海市某廢棄鋼鐵廠地處亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)。于2012年9月在上海市某廢棄鋼鐵廠內(nèi)取土壤樣品，放入無菌袋中。
[0020]培養(yǎng)基及試劑
[0021]重鉻酸鉀(優(yōu)級(jí)純)，使用前110°C烘干2h。培養(yǎng)基所用的試劑(孟加拉紅培養(yǎng)基、馬丁式培養(yǎng)基)采購自國(guó)藥；Taq DNA聚合酶、dNTP、購自大連TaKaRa公司；DNA Marker購自北京天根生化科技有限公司；抗生素等購自英國(guó)OXOID公司；Mill1-Q水。
[0022]霉菌菌株初分離
[0023]從采集的土樣中稱取25g，溶解到裝有適量玻璃珠和225mL無菌水的采樣杯中(已滅菌)，搖勻，用0.9%的無菌生理鹽水梯度稀釋，分別稀釋到ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—4。涂布到孟加拉紅培養(yǎng)基上(l*105Pa，121°C滅菌20min)，28°C培養(yǎng)2d，原位復(fù)制法復(fù)制到另一個(gè)平板中培養(yǎng)，重復(fù)4~5次，獲得初篩純培養(yǎng)菌株(根據(jù)《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》操作，錢存柔、黃儀秀主編，北京大學(xué)出版社，1999)。霉菌菌株的耐受性
[0024]向發(fā)酵液添加Cr6+儲(chǔ)備液，使培養(yǎng)液中的Cr6+終濃度分別為100、150、200、250、300,350 ;400，500，600，700mg/L，將斜面保存的耐Cr6+菌株在種子液活化24h，以1%接種量接入發(fā)酵液中，28°C，220r/min震蕩培養(yǎng)72h，觀察菌株生長(zhǎng)情況，能夠抑制菌株生長(zhǎng)的最低濃度為菌株的最低抑制菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。(結(jié)果:對(duì)土壤中所分離篩選到的耐Cr6+霉菌經(jīng)過逐步馴化，研究其對(duì)Cr6+的耐受能力。M-13的Cr6+最低抑制濃度可達(dá)到了 450mg/L。而其它大部分分離得到的菌株均在100mg/L不生長(zhǎng),5株菌最低抑制濃度在100mg/L以上，但此菌最低抑制濃度第二高。篩選得到本發(fā)明保藏號(hào)為CGMCC N0.8332 的橘綠木霉 M-13。[0025]實(shí)施例2耐Cr6+霉菌還原六價(jià)鉻離子
[0026]將斜面保存高耐受性的菌種M-13接種于未添加Cr6+的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h，收集菌絲，自然干燥4h，稱取1.(^菌絲置于5011111001^/1 Cr6+水溶液中，28°C，150r/min震蕩培養(yǎng)48h，過濾。用ICP-MS測(cè)定其濾液中鉻離子的含量，重復(fù)3次，求平均值，以不接種但含有100mg/L Cr6+水溶液作為對(duì)照。選擇處理效果最好的菌株，命名為M-13并進(jìn)行下一步鑒定。
[0027]ICP-MS檢測(cè)根據(jù)以下文獻(xiàn)記載的方法進(jìn)行:
[0028](I)Pitt J1.1979.The genus Penicillium and its teleomorphic statesEupenicillium and Talaromyces.London:Academic Press.[0029](2)N/T2210-2008保健食品中六價(jià)鉻的測(cè)定離子色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法
[0030](3 )SN/T2208-2008水產(chǎn)品中鈉、鈉、鎂、鋁、鈣、鉻、鐵、鎳、銅、鋅、砷、鍶、鑰、鎘、鉛、
汞、硒的測(cè)定微波消解-電感耦合等離子體-質(zhì)譜法
[0031]通過TCP-MS測(cè)定結(jié)果為:處理后的水體中，Cr6+的濃度測(cè)定值在檢測(cè)以下，Cr3+為61.lmg/L。M-13能將初始濃度100mg/L的Cr6+水溶液還原成Cr3+，Cr3+比Cr6+流動(dòng)性弱，所以Cr3+的毒性比Cr6+弱，從而降低其毒性。將這種霉菌應(yīng)用處理重金屬Cr6+污水中，可以降低其毒性。
[0032]將過濾后的菌絲，用去離子水沖洗3次后烘干，對(duì)其用原子吸收儀測(cè)定其總鉻的含量，重復(fù)3次，求平均值。結(jié)果:菌絲含量鉻量為0.68mg/g。(GB/T5009.123-2003，食品中鉻的測(cè)定)
[0033]實(shí)施例3還原Cr6+霉菌的鑒定
[0034]一、分子系統(tǒng)學(xué)鑒定
[0035]將篩選到高吸附性的耐Cr6+霉菌接種到培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)48h。取單菌落到液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)48h，采用石英砂研磨CTAB提取法(Scott et al.，2000，DNAheteroduplex fingerprinting in Penicillium.1n:Samson RA,Pitt JI (eds).1ntegration of modern taxonomic methods for Penicillium and Aspergillusclassification.Amsterdam:Harwood Academic Publishers, p.225 - 236),提取菌株的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。選用翻譯延伸因子(tef Ι-alpha)基因(tef)，擴(kuò)增引物為EFlT和 EF2T(Bischoff et al., 2006.Metarhizium frigidum sp.nov.: a cryptic species ofM.anisopliae and a member of the M.flavoviride complex.Mycologia, 98:737 - 745)。
[0036]PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:先94°C加熱3分鐘使模板DNA變性，然后進(jìn)入下列溫度循環(huán):94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸45秒，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后在72°C延伸5分鐘。(可參考文獻(xiàn):Wang L.2012.Four new records of Aspergillus section Usti fromShandong Provice, China.Mycotaxonl20:373 - 384)
[0037]PCR 產(chǎn)物檢測(cè)和測(cè)序:PCR 產(chǎn)物與 IOObp DNA ladder (MBI Fermentas)用 2.0% 的瓊脂糖凝膠(agarose gel)在0.5XTBE電泳緩沖液中于80V電壓下電泳20分鐘，然后置于0.5 μ g/ml的溴乙淀(EB, ehidium bromide)溶液中染色15分鐘，在波長(zhǎng)365和254nm的紫外光下檢測(cè)為明顯單一條帶的產(chǎn)物由擎科生物技術(shù)有限公司純化后用ABI3700 (AppliedBiosystems)進(jìn)行雙向直通測(cè)序。檢測(cè)結(jié)果，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0038]數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:原始序列用生物軟件Bioedit7.0.9編輯后得到準(zhǔn)確無誤的序列，與GenBank下載的模式和權(quán)威菌株序列組成序列數(shù)據(jù)矩陣。對(duì)于序列矩陣，在Bioedit7.0.9下做必要的人工編輯和調(diào)整得到的新矩陣。將該矩陣用MEGA5.0 (Tamura etal.，2011)進(jìn)行鄰居連接法(neighbor-joining, NJ)分析,推斷出系統(tǒng)發(fā)育樹,并用自展法(bootstrap)進(jìn)行1000次重復(fù)評(píng)估各分支的可靠性。以菌株M-13的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 2 (在圖中以 Trichoderma citrinoviride strain M-13E 表不)，展不了菌株M-13與其他木霉家族的關(guān)系，M-13與Trichoderma citrinoviride聚成一簇，自舉值為99%。因此，菌株M-13屬于木霉屬Trichoderma。
[0039]二、形態(tài)學(xué)鑒定
[0040]將菌株M-13 在 Czapek yeast autolysate agar (CYA, Pittl979)上 25°C 培養(yǎng) 5天，然后進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。
[0041]形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果為:菌株M-13在Czapekyeast autolysate agar (CYA, Pittl979)上25°C培養(yǎng)5天，菌落布滿平皿，直徑可達(dá)70mm，稀疏但中央稍厚，絨狀；分生孢子較多，近于水綠色(Water Green);無滲出液；無可溶性色素；菌落反面呈黃色。瓶梗單生，少數(shù)2-3個(gè)簇生；瓶型，直或稍彎曲；瓶梗頸明顯；3.5-7X2-2.5微米；分生孢子膠囊型，壁光滑，
3.5-4X2-2.5微米。如圖1，其中圖a和圖b分別表示M-13的孢子梗和孢子頭。
[0042]綜合以上兩種方式鑒定結(jié)果, 可以將M-13鑒定為木霉Tichoderma citrinovirideM-13。
【權(quán)利要求】
1.一種橘綠木霉M-13，其特征在于，保藏號(hào)為CGMCC N0.8332。
2.權(quán)利要求1所述橘綠木霉M-13，其特征在于，其tef序列如SEQID.N0.1所示。
3.權(quán)利要求1或2所述橘綠木霉M-13用于還原或吸附Cr6+。
4.權(quán)利要求1或2所述橘綠木霉M-13用于處理含Cr6+的水體。
5.處理含Cr6+水體的方法，其特征在于，步驟包括:將權(quán)利要求1或2所述橘綠木霉M-13的菌絲體干燥后，置于含Cr6+的水體中，25~30°C處理24~96小時(shí)。
6.權(quán)利要求5所述處理含Cr6+水體的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1或2所述橘綠木霉M-13的菌絲體干燥后，置于含Cr6+的水體中，25~30°C下，50~200rpm震蕩處理24~96小時(shí)。
7.權(quán)利要求5或6所述處理含Cr6+水體的方法，其特征在于，干燥的菌絲體與所處理的水體用量比為5g/L~50g/L。
8.權(quán)利要求7所述處理含Cr6+水體的方法，其特征在于，干燥的菌絲體與所處理的水體用量比為15g/L~ 25g/L。
【文檔編號(hào)】C12R1/885GK103740596SQ201310548694
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月6日
【發(fā)明者】馬晨晨, 歐杰, 殷曦敏, 董博, 張皓文 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)