一種鑒別吉富羅非魚性別的實時熒光pcr方法及引物組的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種吉富羅非魚魚種性別的實時熒光PCR方法，屬于分子生物學【技術領域】。本研究通過選擇吉富羅非魚性別相關基因AMH，該基因在雌雄魚中表達量存在顯著的差異。設計一對特異的實時熒光PCR引物，通過和成魚卵巢AMH基因的表達量進行比較來鑒定羅非魚魚種性別。本發(fā)明所建立的方法具有特異性強、可信度高，可應用于羅非魚魚種階段的性別鑒定。
【專利說明】—種鑒別吉富羅非魚性別的實時熒光PCR方法及引物組
[0001]
【技術領域】[0002]本發(fā)明涉及一種吉富羅非魚魚種性別的實時熒光PCR方法，還涉及該方法所用的引物組，屬于分子生物學【技術領域】。
[0003]【背景技術】
[0004]吉富羅非魚屬于鱸形目、鱺魚科，羅非魚屬。由于它食性雜，耐低氧，生長快，抗病力強，現已成為世界性的養(yǎng)殖魚類。在養(yǎng)殖過程中雌雄羅非魚生長差異明顯，雄魚比雌魚生長快，常常導致出池規(guī)格相差懸殊，從而降低了商品魚的質量，減少了經濟效益。因此開展吉富羅非魚性決定機制研究，探索吉富羅非魚全雄育種技術，對于羅非魚養(yǎng)殖產業(yè)的發(fā)展具有重要的經濟效應和社會效應。
[0005]在吉富羅非魚性別決定機制研究中，常常涉及到性別相關基因的克隆及其時空表達研究。在時空表達研究中，魚種階段是個關鍵期，這時性別已經分化，但僅憑肉眼觀察很難分辨雌雄魚。通過乳酸醋酸地衣紅壓片法可區(qū)分雌雄魚，但該方法費時費力，也影響后續(xù)實驗的連貫性。因此迫切需要通過一種簡便的方法來鑒定吉富羅非魚魚種階段的性別。
[0006]
【發(fā)明內容】

[0007]本研究通過選擇吉富羅非魚性別相關基因AMH，該基因在雌雄魚中表達量存在顯著的差異，設計一對特異的實時熒光PCR引物，通過和成魚卵巢AMH基因的表達量進行比較來鑒定吉富羅非魚魚種性別。
[0008]一種鑒別吉富羅非魚性別的實時熒光PCR方法，包括如下步驟:
第1步、提取吉富羅非魚的RNA，反轉錄成cDNA ；
第2步、以吉富羅非魚的AMH基因的正向和反向引物、以及β-actin管家基因的正向和反向引物，對反轉錄的cDNA進行實時熒光PCR擴增；
第3步、通過雙標準曲線法考察吉富羅非魚的AMH基因的相對表達量，如果魚種性腺中AMH表達量比成魚卵巢高10倍以上，魚種則為雄魚，如果小于或等于10倍，魚種則為雌魚；其中，
AMH 基因的正向引物的序列是:5’ -3’ GGAACGGGAACTGATACGAGATG(SEQ ID N0.1)，反向引物的序列是:5’ -3’ AGCAGGGTCTCGCTGGAGGA(SEQ ID N0.2)；
β -actin 基因的正向引物的序列是:5，-3，ATCCGTAAGGACCTGTACGCC(SEQ ID N0.3)，反向引物的序列是:5’ -3’ GTGGGGCAATGATCTTGATCTTC(SEQ ID N0.4)。
[0009]進一步地，第2步中實時熒光PCR擴增的程序可以是:94°C 3min,然后40個循環(huán)94°C 5s，62°C 20s，最后 72°C 3min，4°C保存。[0010]進一步地，在第3步中，雙標準曲線法的標準曲線是以反轉錄的cDNA為模板，進行5倍系列稀釋，選取5個濃度梯度進行實時熒光PCR，以Ct值為坐標，以稀釋倍數的對數為縱坐標,獲得相對定量標準曲線。
[0011]有益效果:本研究通過選擇吉富羅非魚性別相關基因AMH，該基因在雌雄魚中表達量存在顯著的差異。設計一對特異的實時熒光PCR弓|物，通過和成魚卵巢AMH基因的表達量進行比較來鑒定羅非魚魚種性別。本發(fā)明所建立的方法具有特異性強、可信度高，可應用于羅非魚魚種階段的性別鑒定。
[0012]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是實施例第二部分中的AMH基因表達的標準曲線圖2是實施例第三部分中β -actin基因表達的標準曲線
【具體實施方式】
[0014]第一部分吉富羅非魚AMH基因的測序
吉富羅非魚血液基因組DNA提取，設計引物、PCR擴增，產物純化，轉入載體，藍白斑篩選，質粒測序，所設計的引物序列為:
正向:GCTGTGTGCATTTCAGGAGACA反向:TGTCTCCTGAAATGCACACAGC
用此方法克隆所得吉富羅非魚AMH基因含內含子的部分序列為(SEQ ID N0.5):GCTGTGTGCATTTCAGGAGACACACAGTACGTACTCCTGACAGGAAAATCATCAGAGGGGAGTGTTAACGACAGGTGGCATATTACGGCACAGACAAAACTGCCTCATATGA^-1^a ta tea tcttcttcattttatt tcccca tctctggtteattgtgtaccctacttacattt`cctcteattgia^-AGCAAAACCTAAAAAGCATCTTGATTGGTGAAAAATCAGGAAGTAACATCAGCACGAGTCCACTTCTACTTTTCTCCGGGGGAACGGGAACTGATACGAGrtcaccccegctttctttc tgc tgaca t tcac tgtcgt c a gaga egege tcagc 11 tggt ttttatttt tgc 11 tcccagK\^\GCTTCAGGCTCGCCCCCGGCATCTCTGCAAACCTCCTTCCTTTGTGAGATGAATCGCTTGCTGGGTGCTGTGCTCCCTCAGGAACACTTCGCGTCCCCTCCACTTCCTCTGGACTCCTTACAGTCTCTGCCTCCCCTCTCGCTTGGCTTATCCTCCAGCGAGACCCTGCTGGCAGTAATGATCAACTCCACAGCTCCCACAGTCTTTGGCTTCACGAGTTGGGGCTCCGTGTTGCCGGTGTGGCACGGAGAGCTAGCCCTGTCTGCTGCAATGTTAGAGGAGCTCAGACAGAGACTCGACCAGACTTTGGTGCAAATGACAGAAATAATCAGAGAGGAATAGGTTTCACCGGGAGCCAAGGAGAGCCTGGGGAGGCTCAAAGAACTGAGTGCATTACAGGAGAAAGA
其中，大寫字母為外顯子，小寫字母為內含子，下劃線為real tim PCR引物設計時采用的序列。PCR 擴增的反應條件為:95°C 3min ; [30 循環(huán) 94°C 30s、57°C 30s、72°C lmin]；72°C延長8min ;4°C度保存。
[0015]然后根據該基因序列設計正向和反向實時熒光PCR擴增引物。
[0016]第二部分吉富羅非魚AMH基因標準曲線的建立
取吉富羅非魚成魚卵巢，參照說明書，用Trizol裂解法抽提總RNA。用1 μ g總RNA，以Oigo dT Primer 和 Random 6 mers 為引物(Takara,大連)，根據 M-MLV (Takara,大連)使用說明進行反轉錄反應，反應總體積為10 μ 1。以反轉錄的cDNA為模板，進行5倍系列梯度稀釋，選取選取5°飛_4共5個濃度梯度進行實時熒光PCR擴增，引物見表1。以Ct值為坐標，以稀釋倍數的對數為縱坐標，獲得相對定量標準曲線。結果顯示，標準曲線方程為y==-0.2874X+10.30，其相關系數為 r2=0.973，如圖 1。
[0017]表1實驗中的實時熒光PCR引物
【權利要求】
1.一種鑒別吉富羅非魚性別的實時熒光PCR方法，包括如下步驟:第1步、提取吉富羅非魚的RNA，反轉錄成cDNA ；第2步、以吉富羅非魚的AMH基因的正向和反向引物、以及β-actin管家基因的正向和反向引物，對反轉錄的cDNA進行實時熒光PCR擴增；第3步、通過雙標準曲線法測定吉富羅非魚的AMH基因的相對表達量，如果魚種性腺中AMH表達量比成魚卵巢高10倍以上，魚種則為雄魚，如果小于或等于10倍，魚種則為雌魚；其中，AMH基因的正向引物的序列如SEQ ID N0.1所示，反向引物的序列如SEQ ID N0.2所示；β-actin基因的正向引物的序列如SEQ ID N0.3所示，反向引物的序列如SEQ ID N0.4所示。
2.根據權利要求1所述的鑒別吉富羅非魚性別的實時熒光PCR方法，其特征在于:所述的第2步中實時熒光PCR擴增的程序是:94°C 3min,然后40個循環(huán)94°C 5s，62°C 20s,最后 72°C 3min，4°C 保存。
3.根據權利要求1所述的鑒別吉富羅非魚性別的實時熒光PCR方法，其特征在于:所述的在第3步中，雙標準曲線法的標準曲線是以反轉錄的cDNA為模板，進行5倍系列稀釋，選取5個濃度梯度進行實時熒光PCR，以Ct值為坐標，以稀釋倍數的對數為縱坐標，獲得相對定量標準曲線。
4.一種鑒別吉富羅非魚性別的引物組，其特征在于:所述的引物組的一對正向和反向引物的序列如SEQ ID N0.1~2所示。
【文檔編號】C12N15/11GK103667449SQ201310548365
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月7日 優(yōu)先權日:2013年11月7日
【發(fā)明者】唐永凱, 李建林, 李紅霞, 俞菊華, 徐跑 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心