一種檢測甘蔗赤條病菌的熒光定量pcr試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒，包括：（1）陽性標準品；（2）陰性對照；（3）PCR反應(yīng)液；（4）ExTaq酶液；（5）探針溶液；（6）無菌水。本試劑盒對甘蔗赤條病菌的檢測有高度的特異性，與其他植物病菌無交叉反應(yīng)；檢測的靈敏度達100拷貝，可直接用于甘蔗植株、脫毒種苗等樣本的定量檢測甘蔗赤條病菌；利用本發(fā)明試劑盒檢測快速簡單，準確性好，靈敏度高，檢測結(jié)果可靠穩(wěn)定。
【專利說明】一種檢測甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測植物病菌的PCR試劑盒，具體涉及一種檢測甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒，屬微生物檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]甘鹿赤條病(Sugarcane red stripe disease)是一種普遍發(fā)生的細菌性病害，幾乎在主要甘蔗種植國家均有發(fā)生，我國甘蔗赤條病在幾個種植甘蔗的省(區(qū))都有零星發(fā)生。甘鹿赤條病菌被認為是紅條紋假單胞菌rubrilineans (Lee et al.)Stapp引起，其形態(tài)特征為無芽孢，呈桿狀，大小為0.7 X 1.6 μ m，有單根極生鞭毛，有薄莢膜，革蘭氏染色反應(yīng)為陰性。1992年Willems等將紅條紋假單胞菌重新命名為燕麥噬酸菌燕麥亞種 dii/orarazsubsp.A venae) 0 Zia-ul-Hussnain 等(2011)從巴基斯坦甘蔗赤條病株上分離得到了燕麥噬酸菌燕麥亞種病菌，并對該病菌的菌體形態(tài)、培養(yǎng)性狀、生理生化反應(yīng)作了研究。燕麥噬酸菌燕麥亞種病菌其寄主范圍除甘蔗外，還有水稻、玉米、鋪地黍等禾本科的一些植物。病害有葉條斑和頂腐兩種類型。兩者可以單獨發(fā)生，亦可并發(fā)。在潮濕溫暖的條件下容易發(fā)病，而且病葉的傷痕表面常有細菌溢泌物，借助雨水和氣流傳播?；疾〉目堇险崛~、病莖中的病原菌經(jīng)4個月后仍然有致病力。因此建立甘蔗赤條病菌的快速、準確、靈敏的檢測技術(shù)，對該病的防治起到十分關(guān)鍵的作用。
[0003]常用的檢測病菌的方法有生物學(xué)鑒定法、電鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)等。生物學(xué)鑒定法耗時、且步驟繁瑣；電鏡技術(shù)需要植物組織切片，步驟繁瑣，且只能通過形態(tài)學(xué)觀察判斷；酶聯(lián)免疫技術(shù)需要特異性的抗血清，且靈敏度不及分子檢測技術(shù)；基于PCR原理的分子生物學(xué)技術(shù)是一種靈敏度高、特異性強的快速檢測技術(shù)，在其它甘蔗病原物的檢測已得到廣泛應(yīng)用。目前，檢測甘蔗赤條病菌燕麥噬酸菌燕麥亞種的熒光定量PCR試劑盒及其方法未見報道。
[0004]本發(fā)明在分離獲得甘蔗赤條病菌，克隆測序病菌基因組核糖體rDNA序列基礎(chǔ)上，選擇甘蔗赤條病菌16S-23S rDNA間隔區(qū)序列(ITS)，設(shè)計用于熒光定量PCR檢測的引物及探針，通過對反應(yīng)體系的優(yōu)化，研制用于檢測甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒及方法，為我國甘蔗科研、檢疫、質(zhì)檢等部門提供快速、靈敏、準確的病害檢測試劑盒產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的是提供一種檢測甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒能快速準確的對待測樣品的甘蔗赤條病菌進行定量檢測。該試劑盒不僅可使用于目前市場上的所有類型熒光定量PCR儀，而且能夠靈敏、特異的對甘蔗赤條病菌進行定量檢測。
[0007]為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明采用Taqman探針建立熒光定量PCR檢測甘蔗赤條病菌試劑盒，通過制備病菌DNA標準樣品與待測樣品同時檢測，得到待測樣品的初始病菌拷貝數(shù)，對病菌進行定量檢測。
[0008]本發(fā)明提供了一種利用熒光定量PCR方法檢測甘蔗赤條病菌的引物對QPCR-F5、QPCR-R5和Taqman探針QPCR-P5，所述的引物對序列如下:
QPCR-F5:5’ -TCATCCTCCACCAACCAATA-3’，
QPCR-R5:5’ -TACCGGACCAACAACAAAGA-3’ ；
Taqman探針QPCR-P5的序列如下:
5，-FAM-CACCAAAGCGGCTTCGCAAG-TAMRA-3，。
[0009]本發(fā)明還提供一種檢測甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒由下列試劑組成:
Cl)陽性標準品:采用常規(guī)PCR擴增含有16S-23S rDNA間隔區(qū)的DNA作為標準樣品，I X 101° 拷貝 / μ L，50 μ L/ 瓶，-20°C冷凍保存；
(2)陰性對照:采用無甘蔗赤條病菌感染的甘蔗葉片組織，提取葉片總DNA為陰性對照，100 ng/ μ L，50 μ L/瓶，-20 °C冷凍保存?zhèn)溆茫?br> (3)PCR反應(yīng)液:每個反應(yīng)包括5XPCR緩沖液5.0 μ LUO mmol dNTPs 0.5 μ L、25mmol MgCl2 2.0 μ L 以及濃度為 10 μ mol/L 的引物對 QPCR-F5 和 QPCR-R5 各 2.0 μ L，共
11.5 μ L，50個反應(yīng)體系共計575 μ L, -20 °C保存?zhèn)溆茫?br> (4)Ex Taq酶:每個反應(yīng)體系包括5 U/μ L Ex Taq酶0.5 μ L，50個反應(yīng)體系共計25μ L, _20°C保存?zhèn)溆茫?br> (5)探針溶液:Taqman探針QPCR-P5采用5’-FAM和3’ -TAMRA修飾，合成后采用無菌水稀釋,濃度為10 μ mol/L,每個反應(yīng)體系0.4 μ L, 50個反應(yīng)體系共計20 yL,_20°C保存?zhèn)溆?
(6)無菌水:2X10 mL/瓶。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果主要體現(xiàn)在:本試劑盒對甘蔗赤條病菌的檢測有高度的特異性，與其他甘蔗病菌無交叉反應(yīng)；檢測的靈敏度達100拷貝，可以在甘蔗田間樣品和脫毒種苗等樣本中檢測甘蔗赤條病菌；利用本發(fā)明試劑盒檢測操作簡單快速，從樣品病菌核酸提取至完成檢測，耗時2~3小時。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是甘蔗赤條病菌DNA標準品熒光定量PCR的動力學(xué)曲線。圖中橫坐標代表熒光定量PCR擴增循環(huán)數(shù)，縱坐標代表熒光信號強度，擴增曲線分別是DNA標準品IX IO8拷貝/μ L、1 X IO7 拷貝 / μ L、1 X IO6 拷貝 / μ L、1 X IO5 拷貝 / μ L、1 X IO4 拷貝 / μ L、1 X IO3 拷貝/ μ L、I X IO2 和 I X IO1 拷貝 / μ Lo
[0012]圖2是甘蔗赤條病菌DNA標準品熒光定量PCR的標準曲線。橫坐標χ代表標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值，縱坐標y代表PCR擴增循環(huán)數(shù)；y= -3.2167x+39.785 ;R代表相關(guān)系數(shù)，決定系數(shù) R2=0.9998。
【具體實施方式】
[0013]為了進一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，以下結(jié)合實施例加以說明。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料如無特殊說明均可從商業(yè)途徑獲得。
[0014]實施例1 一種檢測甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒，包括Taqman探針 QPCR-P5 和引物對 QPCR-F5、QPCR-R5,其中 Taqman 探針 QPCR-P5 序列為 5’ -CACCAAAGCGGCTTCGCAAG _3 ’，探針的5 ’端和3 ’端分別采用熒光基團FAM和TAMRA進行修飾；引物對 QPCR-F5 和 QPCR-R5 序列為 5’ - TCATCCTCCACCAACCAATA -3，和 5’ -TACCGGACCAACAACAAAGA -3’ ；該試劑盒包括下列試劑:
(I)陽性標準品:以 16S-F3 (5，-ACTGCGTGAAGTCGGAATC-3’)和 23S-R1(5’ -TCGGAATCTCGGTTGATG-3’)為引物，利用常規(guī)PCR方法擴增獲得甘蔗赤條病菌16S-23SrDNA間隔區(qū)序列(ITS)片段，PCR產(chǎn)物純化后作為甘蔗赤條病菌DNA標準樣品。用核酸蛋白分析儀測定PCR產(chǎn)物DNA濃度后，稀釋為100 ng/yL, PCR產(chǎn)物片段大小為1070 bp，根據(jù)公式計算DNA標準樣品的拷貝數(shù)為8.52X IO10拷貝/ μ L，并稀釋成標準樣品I X 101°拷貝/yL，50 μ L/瓶，-20 °C冷凍保存。
[0015](2)陰性對照:采用無甘蔗赤條病菌感染的甘蔗葉片組織，提取葉片總DNA為陰性對照，用核酸蛋白分析儀測定提取的總DNA濃度，并稀釋成濃度為100 ng/yL作為陰性樣品，50 μ L/瓶，-20 1:冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0016](3)無菌水:2X 10 mL/瓶。
[0017](4)PCR 反應(yīng)液:每個反應(yīng)包括 5XPCR 緩沖液 5.0 μ LUO mmol dNTPs 0.5 μ L、25 mmol MgCl2 2.0 μ L 以及濃度為 10 μ mol/L 的引物對 QPCR-F5 和 QPCR-R5各 2.0 μ L,共11.5 μ L，50個反應(yīng)體系共計575 μ L, -20 °C保存?zhèn)溆茫?br> (5)Ex Taq酶:每個反應(yīng)體系包括5 U/μ L Ex Taq酶0.5 μ L，50個反應(yīng)體系共計25μ L, _20°C保存?zhèn)溆茫?br> (6)探針溶液:Taqman探針QPCR-P5采用5’-FAM和3’ -TAMRA修飾，合成后采用無菌水稀釋,濃度為10 μ mol/L,每個反應(yīng)體系0.4 μ L, 50個反應(yīng)體系共計20 yL,_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0018]實施例2甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒檢測應(yīng)用
I)標準品DNA稀釋:將甘蔗赤條病菌DNA標準品用無菌水按10倍稀釋成I X IO8~I X IO1拷貝/ y L的一系列DNA標準品。
[0019]2)標準曲線方程建立
以此稀釋后DNA標準品為模板，每個標準樣品處理重復(fù)3次。并以無甘蔗赤條病菌感染的甘蔗葉片總DNA為陰性對照，以無菌水為空白對照。按上述試劑盒內(nèi)組分，熒光定量PCR反應(yīng)總體系為25 μ L，包括PCR反應(yīng)液11.5 μ L，反應(yīng)酶混合液0.5 μ L，探針溶液0.4μ L，標準樣品DNA 1.0 μ L，無菌水補至25 μ L ;然后放于ABI公司7500定量PCR儀進行熒光定量PCR擴增。擴增程序為:95 V 15 S，60 V I min，40個循環(huán)，在60 1:進行單點熒光檢測。獲得如圖1所示的擴增曲線，然后繪制如圖2所示的標準曲線，構(gòu)建標準曲線方程。本實施例構(gòu)建的標準曲線方程為Υ=-3.2167χ+39.785，決定系數(shù)R2為0.9998，擴增效率為104.58 %，滿足熒光定量PCR正常的標準曲線要求。檢測靈敏度可10拷貝/μ L。將熒光定量PCR方法獲得產(chǎn)物用常規(guī)電泳檢測，只能檢測到IO4拷貝/ μ L，比常規(guī)的PCR檢測靈敏度至少高100倍。[0020]3)待測樣品DNA提取:采用CTAB法提取幾份待測甘蔗葉片DNA，在核酸蛋白分析儀上測定DNA的光吸收值，計算提取的DNA濃度，然后統(tǒng)一稀釋成100 ng/ μ L。
[0021 ] 4)熒光定量PCR擴增:以待測樣品的RNA為模板，熒光定量PCR反應(yīng)總體系和擴增程序同上述標準曲線方程建立。在ABI公司7500定量PCR儀進行熒光定量PCR擴增，獲得待測樣品的甘蔗赤條病菌標準品熒光定量PCR的動力學(xué)曲線。將待測樣品的Ct值代入標準曲線方程轉(zhuǎn)化成初始病菌分子拷貝數(shù)，即一個分子拷貝數(shù)代表一個甘蔗赤條病菌，從而定量分析甘蔗樣品中感染甘蔗赤條病菌的數(shù)量，結(jié)果如表1所示。檢測結(jié)果表明，具有典型甘蔗赤條病癥狀的福農(nóng)38號、福農(nóng)1110這2個田間樣品證實感染了甘蔗赤條病菌，病菌含量達IO5拷貝/ μ L ;沒有甘蔗赤條病癥狀的新臺糖25、德宏06-24這2個田間樣品沒有檢測出甘蔗赤條病菌。為了進一步證實福農(nóng)38號、福農(nóng)1110感染的病菌是否為甘蔗赤條病菌，我們將熒光定量PCR產(chǎn)物進行克隆和測序，核苷酸序列提交http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/比對,結(jié)果證實是甘鹿赤條病菌,屬于燕麥曬酸菌燕麥亞種avenaesubsp.ΑνθΩ3θ\本發(fā)明建立的檢測甘鹿赤條病菌突光定量PCR方法具有很好的重復(fù)性，同一樣品的Ct值變異系數(shù)小于I %。
[0022]利用本發(fā)明的Taqman探針熒光定量PCR試劑盒進行檢測時，可以準確快速的得到樣品的甘蔗赤條病菌初始拷貝數(shù)，可以應(yīng)用于甘蔗田間樣品檢測、脫毒種苗質(zhì)量監(jiān)控和甘蔗抗性鑒定。
[0023]表1待測樣品Ct值及穩(wěn)定性
【權(quán)利要求】
1.一種檢測甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒，包括Taqman探針QPCR-P5和引物對QPCR-F5、QPCR-R5，其中 Taqman 探針 QPCR-P5 序列為 5，-CACCATCACGAAATCAATGCAGCA-3，，探針的5’端和3’端分別采用熒光基團FAM和TAMRA進行修飾；引物對QPCR-F5和QPCR-R55序列為 5’ -CGGGAAACCCATAATACCAC-3’ 和 5’ -GTCGAITTCTGCTGGTGAGA-3 ’。
2.一種用于甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒由下列試劑組成: Cl)陽性標準品:采用常規(guī)PCR擴增含有16S-23S rDNA間隔區(qū)的DNA作為標準樣品，I X 101° 拷貝 / μ L，50 μ L/ 瓶，-20°C冷凍保存； (2)陰性對照:采用無甘蔗赤條病菌感染的甘蔗葉片組織，提取葉片總DNA為陰性對照，100 ng/ μ L，50 μ L/瓶，-20 °C冷凍保存?zhèn)溆茫? (3)PCR反應(yīng)液:每個反應(yīng)包括5XPCR緩沖液5.0 μ LUO mmol dNTPs 0.5 μ L、25mmol MgCl2 2.0 μ L，以及權(quán)利要求1所述的引物對，濃度為10 μ mol/L的QPCR-F5和0卩0?-1?5各2.0 μ L，共11.5 μ L，50個反應(yīng)體系共計575 μ L, -20 °C保存?zhèn)溆茫? (4)ExTaq酶:每個反應(yīng)體系包括5 U/ μ L Ex Taq酶0.5 μ L，50個反應(yīng)體系共計25μ L, _20°C保存?zhèn)溆茫? (5)探針溶液:如權(quán)利要求1所述的Taqman探針QPCR-P5，采用5’-FAM和3’ -TAMRA修飾，合成后采用無菌水稀釋，濃度為10 μ mol/L，每個反應(yīng)體系0.4 μ L，50個反應(yīng)體系共計20 μ L，_20°C保存?zhèn)溆茫? (6)無菌水:2X10 m L/瓶。
【文檔編號】C12R1/01GK103555844SQ201310548336
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】高三基, 葛丹鳳, 付衛(wèi)林, 吳小斌, 林藝華, 孫生仁, 陳如凱, 傅華英 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)