一種利用黃綠木霉發(fā)酵制備煙用酸角香料的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用黃綠木霉發(fā)酵制備煙用酸角香料的方法。所述菌株為黃綠木霉(Trichoderma aureoviride)HLMM?04 CGMCC No.10839，具有產(chǎn)纖維素酶，進(jìn)而促進(jìn)纖維素分解成寡糖或單糖的能力。將菌株通過(guò)活化、發(fā)酵、過(guò)濾、透析制得纖維素酶粗酶液，用于發(fā)酵酸角，再經(jīng)提取、過(guò)濾、減壓濃縮制成煙用香料。HLMM?04菌株的最適產(chǎn)酶條件為培養(yǎng)基初始pH為6.5，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為5d。加香結(jié)果表明，所制備的香料具有增加煙香豐富性，生津，舒適口腔，改善余味，使卷煙香氣醇和的作用。CGMCC No. 1083920150522
【專利說(shuō)明】
一種利用黃綠木霉發(fā)酵制備煙用酸角香料的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵及其應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一株黃綠木霉新菌株。同時(shí)，本發(fā) 明還涉及利用該菌株制備煙用酸角香料的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 加香加料是卷煙工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是有效提升卷煙抽吸品質(zhì)，形成卷煙特有風(fēng) 格的有效手段之一。目前我國(guó)煙草中添加的煙用香料大多是采用傳統(tǒng)方法萃取再加以調(diào)配 所得，雖然生產(chǎn)操作簡(jiǎn)單，但也存在香氣單調(diào)、改善卷煙抽吸效果不明顯等缺點(diǎn)。利用微生 物對(duì)香原料進(jìn)行發(fā)酵可以增加傳統(tǒng)提取香料中多種香氣物質(zhì)的含量，提升香氣豐富性，進(jìn) 而生產(chǎn)出香氣豐富、高品質(zhì)的卷煙，滿足消費(fèi)者對(duì)卷煙品質(zhì)的要求。
[0003] 酸角(Tamarindus indica)又稱酸豆、羅望子等。蘇木科酸角屬。根據(jù)《本草綱目》 記載，酸角具有止渴消熱、消食，養(yǎng)肝明目等功能。常用于治療中暑、消化不良、食積、腹痛、 慢性胃炎、便秘、高血壓及缺鐵性心臟病。生津止渴、消熱解暑，清涼爽口，回味無(wú)窮。
[0004] 木霉菌(Trichoderma spp.)廣泛分布于自然界，在腐木、種籽、植物殘?bào)w、有機(jī)肥、 土壤和空氣中尤多。木霉菌生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)速度快，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)十分有利。黃 綠木霉(Trichoderma aureoviride)為木霉屬的一種，作為一種重要的生防因子，對(duì)植物病 原的拮抗作用具有廣譜性、多制性，還能產(chǎn)生多種酶類分解土壤中的動(dòng)植物殘?bào)w，增加土壤 肥力。已有對(duì)黃綠木霉的報(bào)道多集中在土壤改良、生物防治及生物肥料等方面?，F(xiàn)有技術(shù)中 尚未見(jiàn)將黃綠木霉用于酸角發(fā)酵制備煙用香料的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株黃綠木霉新菌株，該菌株具有 產(chǎn)纖維素酶，進(jìn)而促進(jìn)纖維素分解成寡糖或單糖的能力。
[0006] 本發(fā)明的目的還在于提供一種利用該菌株發(fā)酵酸角制備煙用香料的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。
[0008] 除非另有說(shuō)明，本發(fā)明所采用的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[0009] -種黃綠木霉（Trichoderma aureoviride)HLMM_04菌株，CGMCC No. 10839,其具 有產(chǎn)纖維素酶，進(jìn)而促進(jìn)纖維素分解成寡糖或單糖的能力。
[0010] 利用所述菌株制備煙用香料的方法，包括以下步驟：
[0011] (1)將黃綠木霉!〇^-040610：如.10839菌株活化兩次后，接種于裝有20011^^^ 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在20~35 °C，180rpm下發(fā)酵培養(yǎng)1~7d;所述的PDA液體培養(yǎng)基：馬 鈴薯200g，葡萄糖20g，補(bǔ)蒸餾水至lL，pH5.5~8.5,115°C高壓滅菌15min;
[0012] (2)發(fā)酵液過(guò)濾去除菌體，取上清液緩慢加入硫酸氨至80%飽和度，4°C下靜置過(guò) 夜，離心收集沉淀物并溶于2mL緩沖液中，再用緩沖液進(jìn)行透析，得到粗酶液;所述的緩沖液 為：0.02mol/L Na2HP〇4_NaH2P〇4，pH 7.3;
[0013] (3)將酸角去污洗凈，破碎后加入兩倍重量的水，混合均勻，調(diào)pH至6.0;加入黃綠 木霉HLMM-04粗酶液，發(fā)酵，粗酶液添加量為酸角質(zhì)量的5%~20%，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵 時(shí)間2~5h;回流提取3h，過(guò)濾除渣，將上清液減壓濃縮，即得所需煙用香料。
[0014] 進(jìn)一步的，為防止香料變質(zhì)，按煙用香料重量的5%添加丙二醇。
[0015] 步驟(1)中最適宜的產(chǎn)香條件為初始pH 6.5,培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時(shí)間5d。
[0016] 相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0017] (1)本發(fā)明首次將黃綠木霉應(yīng)用于煙用香料制備領(lǐng)域。采用黃綠木霉HLMM-04菌株 發(fā)酵液處理酸角，與未處理對(duì)照相比，在原有酸角特征香氣保持的同時(shí)，具有增加煙香豐富 性，生津，舒適口腔，改善余味，使卷煙香氣醇和的作用。
[0018] (2)本發(fā)明成本低廉，操作簡(jiǎn)單，便于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，應(yīng)用前景良好。
[0019] 保藏生物材料的說(shuō)明
[0020] 本發(fā)明的菌株，已于2015年5月22日，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心(CGMCG);該中心地址：中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生 物研究所。該菌株分類命名為黃綠木霉（Trichoderma aureoViride)HLMM_04，保藏號(hào)為 CGMCC No.10839。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但實(shí)施例并不是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方 案的限定。
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 1、黃綠木霉HLMM-04菌株的適宜產(chǎn)酶條件
[0024] 1.1培養(yǎng)基初始pH對(duì)HLMM-04菌株產(chǎn)酶的影響
[0025]將液體培養(yǎng)基的口!1分別調(diào)到5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，在28°(：、120印111下振 蕩培養(yǎng)3天后，測(cè)定纖維素酶活，表明最適宜的初始pH為6.5。
[0026] 1.2培養(yǎng)溫度對(duì)HLMM-04菌株產(chǎn)酶的影響
[0027] 將接種后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別置于20°C、25°C、28°C、32°C、35°C下，120r/min振 蕩培養(yǎng)3d后，測(cè)定纖維素酶活，表明最適宜的培養(yǎng)溫度為28°C。
[0028] 1.3培養(yǎng)時(shí)間對(duì)HLMM-04菌株產(chǎn)酶的影響
[0029]將接種好的液體培養(yǎng)基(？!16.5)置于恒溫恒濕箱中，28°(：，12(^/1^11振蕩培養(yǎng)，每 24h測(cè)定一次纖維素酶活，培養(yǎng)到第5天時(shí)纖維素酶活達(dá)到最大值。
[0030] 2、黃綠木霉HLMM-04粗酶液制備方法
[0031] 根據(jù)以上優(yōu)化結(jié)果，將黃綠木霉HLMM-04菌株活化兩次后，接種于裝有200mL PDA 液體培養(yǎng)基(pH 6.5)的三角瓶中，在28°C，180rpm下發(fā)酵培養(yǎng)5d。過(guò)濾去除菌體。取上清液 緩慢加入硫酸氨至80 %飽和度，4 °C下靜置過(guò)夜，離心收集沉淀物并溶于2mL緩沖液 (0.02111〇1/1似2冊(cè)〇4-他!^〇4的緩沖液4117.3)中，用同樣的緩沖液進(jìn)行透析，得到粗酶 液。
[0032] 3、黃綠木霉HLMM-04菌株發(fā)酵制備煙用香料的方法
[0033]將酸角去污洗凈，破碎后加入兩倍重量的水，混合均勻，調(diào)pH至6.0。加入黃綠木霉 HLMM-04粗酶液，發(fā)酵。粗酶液添加量為酸角質(zhì)量的15 %，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵時(shí)間3h?；?流提取3h，過(guò)濾除渣，將上清液減壓濃縮，即得酸角發(fā)酵煙用香料。
[0034]為防止變質(zhì)，按發(fā)酵香料重量的5 %添加丙二醇。
[0035] 4、產(chǎn)品特征及理化性質(zhì)
[0036]所得發(fā)酵煙用香料為紅棕色流狀膏體，不澄清。產(chǎn)品理化性質(zhì)見(jiàn)表1。
[0037] 表1黃綠木霉HLMM-04發(fā)酵酸角香料的理化指標(biāo)
[0039] 5、卷煙加香實(shí)驗(yàn)
[0040]取酸角發(fā)酵煙用香料0.1 g，取無(wú)菌水稀釋50倍后，均勻噴灑在50g未加香葉組中， 裝入干凈的密封袋內(nèi)，于室溫下放置2h后，將煙絲于120°C烘箱中烘干，使水分含量達(dá)到 11 %-13%。將處理后的煙絲及對(duì)照放入恒溫恒濕箱中，在溫度22°C、濕度60%條件下平衡 24h，手工卷制成卷煙，由評(píng)吸專家組成的評(píng)吸小組進(jìn)行感官評(píng)吸。以未發(fā)酵酸角提取香料 及枯草芽孢桿菌發(fā)酵酸角香料為對(duì)照。加香結(jié)果表明，酸角黃綠木霉HLMM-04發(fā)酵香料與對(duì) 照區(qū)別明顯，具有增加煙香豐富性，生津，舒適口腔，改善余味，使卷煙香氣醇和的作用。評(píng) 價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。
[0041 ]表2酸角發(fā)酵香料評(píng)吸結(jié)果
[0043] 實(shí)施例2
[0044] 重復(fù)實(shí)施例1，有以下不同點(diǎn):粗酶液添加量為酸角質(zhì)量的5%，發(fā)酵時(shí)間2h。
[0045] 1、產(chǎn)品特征及理化性質(zhì)
[0046] 所得發(fā)酵煙用香料為紅棕色流狀膏體，不澄清。產(chǎn)品理化性質(zhì)見(jiàn)表3。
[0047] 表3黃綠木霉HLMM-04發(fā)酵酸角香料的理化指標(biāo)
[0049] 2、卷煙加香實(shí)驗(yàn)
[0050] 加香結(jié)果表明，酸角黃綠木霉HLMM-04發(fā)酵香料與對(duì)照區(qū)別明顯，具有增加煙香豐 富性，生津，減少刺激的作用。評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表4。
[0051] 表4酸角發(fā)酵香料評(píng)吸結(jié)果
[0053] 實(shí)施例3
[0054]重復(fù)實(shí)施例1，有以下不同點(diǎn):粗酶液添加量為酸角質(zhì)量的20%，發(fā)酵時(shí)間5h。 [0055] 1、產(chǎn)品特征及理化性質(zhì)
[0056]所得發(fā)酵煙用香料為紅棕色流狀膏體，不澄清。產(chǎn)品理化性質(zhì)見(jiàn)表5。
[0057] 表5黃綠木霉HLMM-04發(fā)酵酸角香料的理化指標(biāo)
[0059] 2、卷煙加香實(shí)驗(yàn)
[0060] 加香結(jié)果表明，酸角黃綠木霉HLMM-04發(fā)酵香料與對(duì)照區(qū)別明顯，具有增加酸香、 生津、改善口腔舒適性的作用。評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表6。
[0061 ]表6酸角發(fā)酵香料評(píng)吸結(jié)果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種黃綠木霉（Trichoderma aureoviride)HLMM_04菌株，CGMCC No. 10839,其具有 產(chǎn)纖維素酶，進(jìn)而促進(jìn)纖維素分解成寡糖或單糖的能力。2. 利用權(quán)利要求1所述菌株制備煙用香料的方法，包括以下步驟： (1) 將黃綠木霉見(jiàn)]\^-04061〇：如.10839菌株活化兩次后，接種于裝有2001^?0纟液體 培養(yǎng)基的三角瓶中，在20~35°C，180rpm下發(fā)酵培養(yǎng)1~7d;所述的PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯 200g，葡萄糖20g，補(bǔ)蒸餾水至lL，pH5.5~8.5,115°C高壓滅菌15min; (2) 發(fā)酵液過(guò)濾去除菌體，取上清液緩慢加入硫酸氨至80%飽和度，4°C下靜置過(guò)夜，離 心收集沉淀物并溶于2mL緩沖液中，再用緩沖液進(jìn)行透析，得到粗酶液;所述的緩沖液為： 0.02mol/L Na2HP〇4-NaH2P〇4,pH 7.3； (3) 將酸角去污洗凈，破碎后加入兩倍重量的水，混合均勻，調(diào)pH至6.0 ;加入黃綠木霉 HLMM-04粗酶液，發(fā)酵，粗酶液添加量為酸角質(zhì)量的5%~20%，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵時(shí)間2 ~5h;回流提取3h，過(guò)濾除渣，將上清液減壓濃縮，即得所需煙用香料。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備煙用香料的方法，其特征在于：為防止香料變質(zhì)，按煙用 香料重量的5 %添加丙二醇。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備煙用香料的方法，其特征在于：步驟（1)中最適宜的發(fā)酵 培養(yǎng)條件為初始pH 6.5，培養(yǎng)溫度28 °C，培養(yǎng)時(shí)間5d。
【文檔編號(hào)】C12P1/02GK105861319SQ201610240447
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月18日
【發(fā)明人】者為, 段焰青, 焦俊, 夏建軍, 陳興, 王文元, 汪顯國(guó)
【申請(qǐng)人】云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司