一種超疏水微坑陣列芯片及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種超疏水微坑陣列芯片及其制備方法與應(yīng)用。該超疏水微坑陣列芯片包括微坑陣列層，所述微坑陣列層上除微坑或微坑底部以外的表面為超疏水表面。所述超疏水微坑陣列芯片可為：1)微坑以外的表面為超疏水表面，超疏水微坑陣列芯片包括微坑陣列層和貼合在微坑陣列層表面上的超疏水層；2)微坑底部以外的表面為超疏水面，微坑陣列層包括基底層和貼合在基底表面的微孔陣列層，微孔陣列層是由超疏水材料制作的。本發(fā)明微坑陣列芯片在構(gòu)建細(xì)胞微陣列過程中可以很低的成本實(shí)現(xiàn)細(xì)胞微陣列間的完全隔絕，避免細(xì)胞陣列之間交叉污染的發(fā)生，并且還保證了很好的生物相容性，對(duì)各種細(xì)胞的正常生長(zhǎng)沒有明顯的影響，適宜于高通量細(xì)胞檢測(cè)和分析。
【專利說明】
一種超疏水微坑陣列芯片及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種超疏水微坑陣列芯片及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是生物學(xué)研究最基本的研究手段之一。很多生物學(xué)研究，例如高通量藥物篩選，干細(xì)胞組合式篩選等，涉及大量的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，通過大量的，過程往往極為相似的細(xì)胞處理過程實(shí)現(xiàn)某些條件或結(jié)果的優(yōu)化;傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作多是由人工手動(dòng)在多孔板中完成這些細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，試劑耗用量很大，研究成本較高。
[0003]細(xì)胞微陣列(cell microarray)是通過化學(xué)、物理分離方式形成的微小細(xì)胞陣列。這樣的細(xì)胞微陣列因?yàn)橥扛?，試劑消耗量小，成本較低等優(yōu)勢(shì)在生物學(xué)研究中越來越受到重視。化學(xué)方式分離細(xì)胞多是通過表面修飾實(shí)現(xiàn)，通過對(duì)表面做差異化修飾，使細(xì)胞只能在特定的陣列位置處生長(zhǎng)而形成的細(xì)胞點(diǎn)陣。物理分離方式可以通過形成微坑的形式，將細(xì)胞阻隔開，多通過注塑成型，或者軟光刻(soft lithography)的方式制備。也有同時(shí)采用化學(xué)物理方法分離的細(xì)胞微陣列平臺(tái)。
[0004]細(xì)胞微陣列及實(shí)現(xiàn)細(xì)胞微陣列的細(xì)胞微陣列平臺(tái)在高通量藥物篩選、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、干細(xì)胞分化等研究中具有重要作用。
[0005](I)高通量藥物篩選
[0006]藥物篩選是一個(gè)廣義的概念，包含了藥物篩選的很多方面。第一，傳統(tǒng)意義上新型藥物分子的篩選。由于合成方法的進(jìn)步，以及天然有機(jī)分子不斷被發(fā)現(xiàn)，藥物分子庫一直在不斷擴(kuò)大，給藥靶點(diǎn)也越來越多，藥物篩選的工作量急劇地增加。利用高通量細(xì)胞微陣列進(jìn)行高通量藥物篩選化合物分子消耗量很小，極大降低了藥物篩選的成本。第二，藥物篩選還包括針對(duì)個(gè)人的個(gè)體化治療方案篩選。對(duì)于每一個(gè)個(gè)體，病情的發(fā)展以及適用的藥物不盡相同，為了進(jìn)一步提高臨床治療的效果，并且及時(shí)有效地遏制病情，我們需要針對(duì)個(gè)體的情況做初步的藥物篩選。這種個(gè)性化治療方案在癌癥或其他疑難雜癥的治療中具有非常重要的意義。通常情況下，我們能夠得到的病人原代細(xì)胞是非常有限的，此時(shí)，高通量細(xì)胞陣列的意義將會(huì)凸顯。因?yàn)槿绻軌蚴褂煤苌倭康募?xì)胞形成高通量微陣列，那么我們就能夠利用少量的原代細(xì)胞進(jìn)行高通量的藥物篩選。所以在這種情況下，高通量細(xì)胞微陣列平臺(tái)的作用幾乎是無可替代的。
[0007](2)研究細(xì)胞基因與表型的關(guān)聯(lián)、探索基因的功能是細(xì)胞學(xué)研究的重要內(nèi)容，通過上調(diào)、下調(diào)或者敲除某個(gè)基因，觀察細(xì)胞的表型，我們有可能能夠確定某些基因的功能。高通量的細(xì)胞微陣列為這樣的研究提供了很好的平臺(tái)。高通量逆轉(zhuǎn)染、慢病毒轉(zhuǎn)錄研究都已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞微陣列在基因功能研究中的巨大潛力。
[0008](3)干細(xì)胞由于它自身獨(dú)特的全能性和增殖性，在臨床的再生醫(yī)學(xué)方面具有非常重要的潛在價(jià)值。但是由于干細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)是一個(gè)多因子影響的過程，干細(xì)胞的定向分化增殖是干細(xì)胞走向臨床治療的關(guān)鍵障礙。干細(xì)胞分化的影響因素包括細(xì)胞基質(zhì)材料、彈性，可溶性/不可溶性因子，基質(zhì)形貌等等。為了有效分拆這些影響因素，探索干細(xì)胞定向分化的微環(huán)境，高通量的細(xì)胞微陣列是重要的平臺(tái)。干細(xì)胞，尤其是胚胎干細(xì)胞，與原代細(xì)胞類似，通常能夠獲得的量是很少的，這種微陣列形式在實(shí)際研究中具有很大的吸引力。通過調(diào)節(jié)、組合各類影響因子，我們可以在細(xì)胞微陣列平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)高通量的篩選，有效地促進(jìn)干細(xì)胞分化研究。
[0009](4)高通量細(xì)胞微陣列在研究細(xì)胞分泌物方面也有重要的意義。它在篩選分泌針對(duì)特定抗原的單克隆抗體的細(xì)胞具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)，相對(duì)于傳統(tǒng)的有限稀釋法，高通量細(xì)胞微陣列能夠顯著提高篩選效率。
[0010](5)在光學(xué)超分辨成像領(lǐng)域，隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(STORM)是當(dāng)前分辨率最高的光學(xué)顯微鏡之一。超高分辨成像對(duì)生物學(xué)的研究具有十分重要的意義。很多亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)都在微米到納米尺度，衍射極限的存在限制了我們使用光學(xué)顯微鏡觀察這些生物樣品。比如細(xì)胞的骨架蛋白微絲非常密集，在熒光顯微鏡下其圖像非常模糊，無法看到細(xì)節(jié)，而電子顯微鏡的分辨率可以達(dá)到Inm左右，非常清楚地呈現(xiàn)了細(xì)胞骨架的細(xì)節(jié)。然而電子顯微鏡幾乎不能做活的樣品，特異性也沒有熒光顯微鏡好。超高分辨率熒光顯微技術(shù)已經(jīng)逐步發(fā)展成熟，但是操作步驟往往較為冗長(zhǎng)繁瑣，檢測(cè)效率不高，因此利用高通量細(xì)胞微陣列實(shí)現(xiàn)高通量超高分辨成像對(duì)于加快這一領(lǐng)域的研究和發(fā)展具有非常重要的意義。
[0011]總之，高通量細(xì)胞微陣列實(shí)驗(yàn)平臺(tái)是具有重要價(jià)值的研究平臺(tái)，無論是在基礎(chǔ)研究還是在實(shí)際應(yīng)用中都有非常重要的價(jià)值和意義。
[0012]目前高通量細(xì)胞微陣列技術(shù)平臺(tái)包括384或者1536孔板(包括相應(yīng)的自動(dòng)化機(jī)械平臺(tái))，高通量微流控生物微反應(yīng)器，PDMS(Polydimethyl si loxane)/PEG(Polyethyleneglycol)微坑(以及各種其他材料制備的微坑)，以及表面微圖案化處理后形成的細(xì)胞微陣列等，它們主要存在如下問題:
[0013](I)使用384/1536孔板進(jìn)行物理分離、形成細(xì)胞微陣列用于高通量分析檢測(cè)，一般都需要采用配套的機(jī)械手、或者自動(dòng)化操作系統(tǒng)，而該操作系統(tǒng)的成本非常昂貴，普通的實(shí)驗(yàn)室或者小型藥物研發(fā)公司根本無力承擔(dān)。這在很大程度上限制了微孔板上高通量分析檢測(cè)平臺(tái)的使用。
[0014](2)近年來，微流控技術(shù)的發(fā)展為開發(fā)新型低成本的細(xì)胞檢測(cè)平臺(tái)積累了技術(shù)基礎(chǔ)。通過復(fù)雜的栗閥設(shè)計(jì)，可以形成細(xì)胞微陣列，并且能夠通過控制栗閥的開關(guān)將不同的藥物分子特異性地加入不同細(xì)胞點(diǎn)陣，從而實(shí)現(xiàn)高通量的藥物分析。但是這種微流控平臺(tái)的構(gòu)建相對(duì)復(fù)雜，不適于在生物學(xué)研究領(lǐng)域大規(guī)模推廣使用。
[0015](3) PDMS微孔、PEG微孔或者其他各種材料制備的微坑等由于其制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉也逐漸引起人們的重視，成為重要的細(xì)胞檢測(cè)分析平臺(tái)。但是由于所有的微孔均浸沒在同一種培養(yǎng)基中，細(xì)胞陣列的微環(huán)境無法獨(dú)立控制，例如，在高通量藥物篩選中水溶性分子會(huì)發(fā)生溶解擴(kuò)散，因而很難避免交叉污染，限制了這類平臺(tái)的使用。因此，很多研究者致力于解決這個(gè)難題，但是結(jié)果并不理想，因?yàn)樵诮鉀Q交叉污染問題的同時(shí)又將引起其他的問題。例如，有研究者采用油封的方式隔絕微坑，雖然可以在一定程度上解決交叉污染，但是與此同時(shí)又帶來操作不便等問題。還有研究者采用微柱封死微坑的方式解決交叉污染，這又將引起通氣性不足的問題，通氣不足將會(huì)使得細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)變差，或者使細(xì)胞表型發(fā)生異常變化。還有研究通過微接觸印刷的方式在二維表面實(shí)現(xiàn)點(diǎn)陣化修飾，使得細(xì)胞只能夠在修飾過的點(diǎn)陣上生長(zhǎng)，從而形成細(xì)胞微陣列，但是這種方式同樣由于生長(zhǎng)環(huán)境不獨(dú)立而很難避免點(diǎn)陣之間的交叉污染，并且由于微接觸印刷修飾穩(wěn)定性較差，隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，原本形成的細(xì)胞陣列之間會(huì)發(fā)生重疊。
[0016]此外，目前開發(fā)出來的各種進(jìn)行高通量細(xì)胞培養(yǎng)、檢測(cè)和分析的微器件生物相容性往往較差，無法保證正常的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，限制了這些微器件在高通量細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。例如，微器件上培養(yǎng)的細(xì)胞的倍增時(shí)間往往遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于多孔板中細(xì)胞增殖的速度；微器件上的細(xì)胞經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，細(xì)胞表型發(fā)生異常變化，如無法表達(dá)該細(xì)胞的特有蛋白等等。因此，絕大多數(shù)的微器件無法進(jìn)行對(duì)環(huán)境非常敏感的原代細(xì)胞、干細(xì)胞的培養(yǎng)和分析，而恰恰原代細(xì)胞、干細(xì)胞高通量微陣列在個(gè)性化醫(yī)療，再生醫(yī)療的研究探索方面具有非常重要的意義。
[0017]在超分辨成像方面，STORM成像對(duì)樣品的處理過程極為復(fù)雜，借助高通量細(xì)胞微陣列實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，可以單獨(dú)控制每個(gè)微坑內(nèi)的獨(dú)立環(huán)境，進(jìn)行大規(guī)模的STORM樣品制備，相比于傳統(tǒng)的STORM樣品制備，效率提升顯著，極大的提高了超分辨成像信息密度，降低實(shí)驗(yàn)成本。同時(shí)，目前尚沒有能夠有效用于高通量高分辨成像的平臺(tái)，以往實(shí)驗(yàn)多通過逐個(gè)樣品處理的方式來進(jìn)行多個(gè)樣品的高分辨成像，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效率低下，很大程度上限制了高分辨成像的發(fā)展。
[0018]最后，目前各種高通量細(xì)胞微陣列器件的操作大多過于復(fù)雜，例如需要逐個(gè)微坑進(jìn)行加樣或者換液操作，也對(duì)這些細(xì)胞微陣列器件的應(yīng)用造成了很大的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]本發(fā)明的目的是提供一種超疏水微坑陣列芯片及其制備方法與應(yīng)用，該超疏水超微坑陣列芯片低成本、操作簡(jiǎn)單、能在保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)狀態(tài)的情況下很好地避免交叉污染，同時(shí)可保證良好的生物相容性，極大地降低了高通量細(xì)胞分析的成本，并進(jìn)一步推動(dòng)了高通量細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的推廣使用，在高通量藥物篩選、高通量超高分辨成像等應(yīng)用中均發(fā)揮重要的作用。
[0020]本發(fā)明提供的一種超疏水微坑陣列芯片，它包括微坑陣列層，所述微坑陣列層上設(shè)有微坑的表面上除微坑或微坑底部以外的表面為超疏水表面。本發(fā)明中的超疏水表面是指與水(或水溶液)的接觸角大于150°，滾動(dòng)角小于10°的表面。
[0021]本發(fā)明超疏水微坑陣列芯片由于自身特殊的超疏水修飾，可以自動(dòng)形成水溶液的微液滴陣列，從而保證微陣列存在物理隔絕，避免了陣列之間的交叉污染。
[0022]上述的超疏水微坑陣列芯片中，所述微坑陣列層的形狀、尺寸、深度和加工方式等均不受限制。本發(fā)明超疏水微坑陣列芯片的實(shí)驗(yàn)通量高，在普通玻片大小(76mm*26mm)的芯片上可以構(gòu)建1000個(gè)以上液滴陣列;試劑消耗量極小，每個(gè)微坑的體積約為50nL，極大降低了高通量檢測(cè)分析的成本。
[0023]所述超疏水微坑陣列芯片可為下述(A)或(B):
[0024](A)所述微坑以外的表面為超疏水表面，所述超疏水微坑陣列芯片包括微坑陣列層和貼合在所述微坑陣列層表面上的超疏水層。
[0025]優(yōu)選地，所述超疏水層的厚度可為10?150微米(如100微米)。
[0026]所述超疏水層的材質(zhì)、制備方式不受限制，例如本發(fā)明列舉了如下例子:將成分如下的超疏水預(yù)聚物溶液:24wt %丙基丙稀酸甲酯、16wt % 二甲基丙稀酸乙二醇酯、60wt %1_癸醇(l_decanol)和lwt% 2，2_二甲氧基_2_苯基苯乙酮充分混合后注入兩片娃燒化的玻片之間，經(jīng)紫外燈曝光，即可得到所述超疏水層;貼合在基底層的方法包括不限于本發(fā)明所述的方法。
[0027]所述微坑陣列層的材質(zhì)包括但不限于聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，PolymethyI methacrylate)，聚碳酸酯(PC，Polycarbonate)、不銹鋼、玻璃等。
[0028]為了滿足超分辨成像的獨(dú)特需求，所述微坑陣列層包括基底層和貼合在所述基底表面的微孔陣列層，所述基底層可為超高分辨成像專用光學(xué)玻片。該超高分辨成像專用超疏水微坑陣列芯片可滿足超高分辨成像時(shí)100倍物鏡工作距離，并能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化高通量成像。
[0029](B)所述微坑底部以外的表面為超疏水面，所述微坑陣列層包括基底層和貼合在所述基底表面的微孔陣列層，所述微孔陣列層是由超疏水材料制作的。本發(fā)明中的超疏水材料是指可制成超疏水表面的任何材料。
[0030]制備所述基底層的材質(zhì)包括但不限于聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，PolymethyI methacrylate)，聚碳酸酯(PC，Polycarbonate)、不銹鋼、玻璃等。
[0031]本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種上述超疏水微坑陣列芯片的制作方法，它包括將所述微坑陣列層上除微坑或微坑底部以外的表面制作成超疏水表面的步驟。
[0032]所述方法可為下述方法I)或方法2):
[0033]I)將所述微坑陣列層上除微坑以外的表面制作成超疏水表面，它包括如下步驟如下:
[0034]1-a)在所述微坑陣列層中設(shè)有微坑的表面粘附一層膠；
[0035]Ι-b)將粘附膠的微坑陣列層按壓在超疏水層的表面，靜置后揭下微坑陣列層，SP可得到上述微坑以外的表面為超疏水表面的微坑陣列芯片；
[0036]具體地，為了滿足超分辨成像的獨(dú)特需求，制備所述微坑陣列層的方法包括如下步驟:在微孔陣列層的表面粘附一層膠，然后貼合在基底層的表面上，即可得到所述超高分辨成像專用微坑陣列芯片。
[0037]該方法可以實(shí)現(xiàn)最小至200微米的精細(xì)化修飾，修飾方法可以適用于各種形狀的圖案化修飾，并且這種修飾方法對(duì)于基底微坑芯片材料幾乎沒有選擇性，可以適用于各種材料微坑芯片的超疏水修飾。
[0038]2)將所述微坑陣列層上除微坑底部以外的表面制作成超疏水表面，它包括如下步驟:
[0039]2-a)在基底上建立微柱陣列;所述微柱陣列具體可為負(fù)膠微柱陣列，通過曝光顯影制的。
[0040]2-b)取另一基底，與步驟2-a)中所述微柱陣列對(duì)齊并固定在一起;在兩個(gè)基底中間的空隙中灌注超疏水預(yù)聚物，經(jīng)固化后分離，即可得到上述除微坑底部以外的表面為超疏水表面的超疏水微坑陣列芯片。
[0041]上述的超疏水微坑陣列芯片在下述1)-8)中任一項(xiàng)中的應(yīng)用或在制備具有下述1)-8)中任一項(xiàng)所述的功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0042]I)構(gòu)建高通量細(xì)胞微陣列；
[0043]2)高通量細(xì)胞培養(yǎng)；
[0044]3)高通量細(xì)胞分析檢測(cè)；
[0045]4)高通量細(xì)胞轉(zhuǎn)染；
[0046]5)高通量藥物篩選；
[0047]6)高通量干細(xì)胞微環(huán)境的組合式篩選；
[0048]7)高通量超分辨成像；
[0049]8)高通量STORM超分辨成像樣品制備。
[0050]本發(fā)明在上述應(yīng)用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提供了一種利用上述的超疏水微坑陣列芯片培養(yǎng)細(xì)胞的方法，它包括下述步驟a)_步驟c)中的至少一種:
[0051 ] a)加液步驟，它包括如下步驟:將溶液在所述超疏水微坑陣列芯片上方懸空逐滴滴下，即可完成所述加液步驟；
[0052]b)加細(xì)胞的步驟，它為下述b-Ι)或b-2):
[0053]b-1)在所述超疏水微坑陣列芯片中的微坑被液滴充滿后，將所述超疏水微坑陣列芯片浸沒，然后加入細(xì)胞懸液，待細(xì)胞自然沉降后即可將完成所述加細(xì)胞的步驟；
[0054]b-2)在形成液滴陣列的超疏水微坑中，逐個(gè)加入細(xì)胞，即可完場(chǎng)所述加細(xì)胞的步驟；
[0055]c)換液的步驟，它包括如下步驟:
[0056]c-1)將所述超疏水微坑陣列芯片中加入新鮮的培養(yǎng)液并浸沒所述超疏水微坑陣列芯片，通過靜置完成新舊培養(yǎng)基的交換；
[0057]c-2)抽走多余的培養(yǎng)液，至重新形成液滴陣列，即可完成所述換液的步驟。
[0058]本發(fā)明具有如下有益效果:
[0059](I)由于所述芯片自身獨(dú)特的超疏水修飾，超疏水微坑陣列可以自動(dòng)在微坑中形成微液滴陣列，這相對(duì)于傳統(tǒng)的384孔板中通過機(jī)械臂逐孔加入細(xì)胞的方式要方便得多。同時(shí)，這種微坑陣列上的液滴之間完全是物理隔絕，可以很好地避免交叉污染的發(fā)生，因此非常適用于傳統(tǒng)高通量平臺(tái)很難實(shí)現(xiàn)的可溶性因子的高通量篩選，例如高通量水溶性藥物分子的篩選。
[0060](2)本發(fā)明超疏水微坑陣列中細(xì)胞微陣列的培養(yǎng)和維持很方便，最突出的優(yōu)勢(shì)在于換液非常簡(jiǎn)單，只需要將原有的液滴陣列浸沒于新鮮培養(yǎng)基中靜置，等待其充分?jǐn)U散置換后即可再次形成液滴陣列進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)和觀察，而無需傳統(tǒng)孔板技術(shù)逐一進(jìn)行換液的操作。
[0061](3)本發(fā)明超疏水微坑陣列生物相容性極好，完全避免了之前高通量細(xì)胞微裝置的各種問題:超疏水微坑芯片上的細(xì)胞微陣列能夠進(jìn)行超過六天液滴式培養(yǎng)，而之前的微器件上的細(xì)胞培養(yǎng)最多只能持續(xù)96個(gè)小時(shí)，絕大部分僅能維持24小時(shí)以下;超疏水微坑芯片上細(xì)胞微陣列液滴培養(yǎng)的增殖速度與普通24孔板中基本一致，且保持正常的表型，之前的微器件上培養(yǎng)的細(xì)胞增殖速度往往顯著低于普通孔板中細(xì)胞增殖速度;超疏水微坑陣列上可以用于原代細(xì)胞和干細(xì)胞微陣列的構(gòu)建和培養(yǎng)，且能夠很好地維持這些細(xì)胞的本來性質(zhì)，這在已有的絕大多數(shù)的微器件上是不可能實(shí)現(xiàn)，在這些微器件上細(xì)胞可能無法維持原有的表型，使得微器件上的細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果失去可信度;超疏水微坑陣列上細(xì)胞微陣列經(jīng)過72h小時(shí)的液滴式培養(yǎng)后存活率高于95%，與浸沒式培養(yǎng)的結(jié)果相近，這表明本發(fā)明超疏水微坑陣列芯片培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)存活無明顯影響。此外，可通過點(diǎn)樣加樣的方式向不同微坑中加入不同功能分子。高通量細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及干細(xì)胞微環(huán)境組合式分析均證明超疏水微坑非常適于各種高通量檢測(cè)分析。
[0062]總之，本發(fā)明超疏水微坑芯片構(gòu)建細(xì)胞微陣列的最大優(yōu)勢(shì)在于它在構(gòu)建細(xì)胞微陣列過程中完全不需要傳統(tǒng)的384孔技術(shù)中使用的昂貴的機(jī)械手裝置，因此它能夠以很低的成本實(shí)現(xiàn)細(xì)胞微陣列間的完全隔絕，避免細(xì)胞陣列之間交叉污染的發(fā)生，并且與此同時(shí)它還保證了很好的生物相容性，對(duì)各種細(xì)胞(包括比較敏感的原代細(xì)胞和干細(xì)胞)的正常生長(zhǎng)沒有明顯的影響，因而非常適宜于高通量細(xì)胞檢測(cè)和分析。
【附圖說明】
[0063]圖1為實(shí)施例1中超疏水微坑陣列芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。圖1中各標(biāo)記如下:I微坑陣列層、2超疏水層。
[0064]圖2為實(shí)施例1中微嫁接制備超疏水微坑陣列芯片的流程圖。
[0065]圖3為實(shí)施例1中制備得到的超疏水微坑陣列芯片的照片、微坑SEM照片及接觸角照片，其中圖3(a)為超疏水微坑陣列芯片的照片，圖3(b)為圖3(a)中方框區(qū)域內(nèi)的橫向SEM照片，圖3(c)為圖3(b)中方框區(qū)域內(nèi)超疏水層的接觸角照片，圖3(d)為圖3(b)中方框區(qū)域內(nèi)的縱向SEM照片。
[0066]圖4為實(shí)施例1中制備得到的各種形狀和尺寸的超疏水微坑陣列芯片的SEM照片。
[0067]圖5為實(shí)施例2中超疏水微坑陣列芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5中各標(biāo)記如下:I基底層、2超疏水微孔陣列層。
[0068]圖6為實(shí)施例2中原位合成制備超疏水微坑陣列芯片的流程圖。
[0069 ]圖7為實(shí)施例2中制備得到的超疏水微坑陣列芯片的照片。
[0070]圖8為實(shí)施例3中制備超高分辨成像專用超疏水微坑陣列芯片的流程圖。
[0071 ]圖9為本發(fā)明超疏水微坑陣列芯片中自發(fā)的形成液滴陣列。
[0072]圖10為使用涂膠棒輕輕掃過超疏水芯片液滴陣列表面的示意圖及處理前后的液滴體積方差的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及對(duì)應(yīng)的SEM照片，其中圖10(a)為使用涂膠棒輕輕掃過超疏水芯片液滴陣列表面的示意圖，圖10(b)為處理前后液滴體積方差的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及對(duì)應(yīng)的SEM照片。
[0073]圖11為利用本發(fā)明超疏水微坑陣列芯片進(jìn)行高通量細(xì)胞微陣列培養(yǎng)及檢測(cè)分析的示意圖。
[0074]圖12為利用本發(fā)明超疏水微坑陣列芯片進(jìn)行高通量細(xì)胞微陣列培養(yǎng)時(shí)所用的抑制液滴揮發(fā)的裝置，其中，圖12a為控制芯片在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時(shí)的濕度的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖，圖12b為圖12a的實(shí)物照片。
[0075]圖13為利用本發(fā)明超疏水微坑陣列芯片進(jìn)行液滴式培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中圖13a為倉鼠腎細(xì)胞BHK-21、人臍靜脈血管上皮細(xì)胞HUVEC和人慢性髓原白血病細(xì)胞K562分別培養(yǎng)48小時(shí)、72小時(shí)和120小時(shí)后的顯微照片及Calcein AM/PI染色后的顯微照片，圖13(b)為倉鼠腎細(xì)胞BHK-21、人臍靜脈血管上皮細(xì)胞HUVEC分別進(jìn)行液滴式培養(yǎng)和浸沒式培養(yǎng)后的存活率，圖13 (c)為倉鼠腎細(xì)胞BHK-21、人臍靜脈血管上皮細(xì)胞HUVEC分別進(jìn)行浸沒式培養(yǎng)、液滴式培養(yǎng)和在普通24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞增殖速度。
[0076]圖14為利用本發(fā)明超疏水微坑陣列對(duì)HUVEC進(jìn)行培養(yǎng)72小時(shí)后的免疫熒光染色顯微照片以及成血管化檢測(cè)的結(jié)果，其中14a是CD 31蛋白免疫熒光染色的結(jié)果，14b是VE-cadherin蛋白免疫熒光染色的結(jié)果，14c是成血管化檢測(cè)的結(jié)果。
[0077]圖15為通過噴樣技術(shù)本發(fā)明超疏水微坑陣列中加入不同的熒光染料分子進(jìn)行高通量分析和檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中圖15a為加入不同熒光染料分子后的照片，圖15b為加入不同濃度的熒光染料分子的照片，圖15c為圖15b對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度與熒光染料分子的濃度的線性關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0078]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0079]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0080]下述實(shí)施例中的超疏水聚合物預(yù)聚物溶液的成分包括:24wt%丙基丙烯酸甲酯(butyl methacrylate ,BMA)、16wt%:甲基丙稀酸乙二醇酯(ethylene dimethacrylate,EDMA)、60wt% 1-癸醇(l-decanol)和lwt% 2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酬(相對(duì)于單體質(zhì)量總和而言)(2，2-dimethoxy-2-phenylacetophenone ,DMPAP)(全部購自 Sigma-Aldrich)。制備方法為將上述配比的原料在勻漿儀上充分混合Ih后備用。
[0081]下述實(shí)施例中的玻片在使用之前均進(jìn)行清洗和烷基化，清洗步驟為:使用98%濃硫酸和30 %雙氧水混合物(體積比= 7:3)清洗玻片30min，再用去離子水清洗玻片三次，氮?dú)鈴氐状蹈蓚溆?。烷基化修飾的步驟為:使用20% (體積比)3-(三甲氧基硅基)丙基丙烯酸甲酯(3_(1:1'；[11161:11(?78；[171)口1'(^71 methacrylate)乙醇溶液對(duì)上述清洗后的玻片進(jìn)行浸沒即可完成硅烷化修飾，Ih后用丙酮清洗三次，氮?dú)獯蹈蓚溆谩?br>[0082]實(shí)施例1、微嫁接制備超疏水微坑陣列芯片
[0083]超疏水微坑陣列芯片的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示，它包括微坑陣列層I和貼合在微坑陣列層表面上的超疏水層2，其中，超疏水層2的厚度為100微米。
[0084]如圖1所示，利用微嫁接技術(shù)制備超疏水微坑陣列芯片，具體步驟如下:
[0085](a)勻膠:以Dow Corning 3140為例，以7000rpm的轉(zhuǎn)速勻膠30s即可在PMMA層上得到很薄的一層黏膠。
[0086](b)PDMS微坑芯片制備:使用加工好的硅片SU-8模具(由博奧生物芯片公司定制加工生產(chǎn))，用錫紙包好后作為倒模的容器備用。配制PDMS預(yù)聚物溶液，單體與催化劑的體積比為10:1(購自Dow Corning公司，目錄號(hào)SylgardR 184)，玻璃棒充分?jǐn)嚢杌旃春蠓湃胝婵蘸嫦渲谐檎婵?0min去除溶液中氣泡。再將預(yù)聚物溶液倒在SU-8模具上，放入80 V烘箱聚合2h以上再從模具上揭下備用。
[0087](c)將上述PDMS微坑芯片輕輕按壓在步驟(a)中得到的薄層黏膠后再揭下即可在微坑芯片的上表面粘附一層薄膠。
[0088](d)取兩片硅烷化玻片，在一片玻片的兩端貼上150微米后的雙面膠條作為spacer，再將另一片玻片粘到上述玻片上，將配置好的超疏水預(yù)聚物溶液緩緩注入兩片玻片的縫隙中，再置于紫外燈下(302]1111，0^-100000881;[111^1'，1^3)曝光15111；[11。
[0089](e)用刀片撬開兩片玻片即可在下層玻片上得到一層ΙΟΟμπι的超疏水層。將該超疏水層浸沒在乙醇中清洗三次，吹干后備用。
[0090](f)轉(zhuǎn)移超疏水層:將步驟(c)得到的粘附了薄膠的微坑芯片按壓在步驟(e)得到的超疏水層上，靜置4h以上后揭下微坑芯片即可在微坑芯片的上層轉(zhuǎn)移一層超疏水層，SP得超疏水微坑陣芯片。
[0091]本實(shí)施例制備得到的超疏水微坑陣列芯片的照片、微坑SEM照片及接觸角照片，如圖3所示。
[0092]本實(shí)施例中基于微嫁接技術(shù)的超疏水微坑陣列加工方法可以實(shí)現(xiàn)最小至200微米的精細(xì)化修飾，修飾方法可以適用于各種形狀的圖案化修飾(如圖4所示)，并且這種修飾方法對(duì)于基底微坑芯片材料幾乎沒有選擇性，可以適用于各種材料微坑芯片的超疏水修飾。
[0093]實(shí)施例2、原位合成制備超疏水微坑陣列芯片
[0094]超疏水微坑陣列芯片的結(jié)構(gòu)示意圖(側(cè)面)如圖5所示，它包括基底層I和貼合在基底表面的超疏水微孔陣列層2(微孔陣列層2是由超疏水材料制作的)。
[0095]如圖6所示，利用原位合成技術(shù)制備超疏水微坑陣列芯片，具體步驟如下:
[0096](a)負(fù)膠微柱陣列制備:在該硅烷化后的玻片上勻ΙΟΟμπι厚負(fù)膠，曝光顯影得到高度為ΙΟΟμπι，直徑為500μηι，圓心距ΙΟΟΟμηι的微柱陣列。
[0097](b)超疏水層原位聚合:將具有微坑陣列的玻片與另一硅烷化的玻片對(duì)齊后使用夾具夾緊，向兩玻片間的微柱陣列空隙中將配置好的超疏水預(yù)聚物溶液緩緩注入，再置于紫外燈下(302nm, CL-1000 Cross I inker ,UVP)曝光15min，最后用刀片撬開兩片玻片即可在無微柱陣列的玻片上得到ΙΟΟμπι深微坑陣列，最后用乙醇清洗三次即可備用，即得超疏水微坑陣列芯片。
[0098]本實(shí)施例制備得到的超疏水微坑陣列芯片的照片如圖7所示。
[0099 ]實(shí)施例3、超高分辨成像專用超疏水微坑陣列芯片
[0100]本實(shí)施例是基于超分辨成像的獨(dú)特需求，對(duì)微坑基底陣列制備方式進(jìn)行了相應(yīng)調(diào)整，超疏水微坑陣列芯片的結(jié)構(gòu)示意圖與圖1相同，包括微坑陣列層I和貼合在微坑陣列層表面上的超疏水層2，僅是微坑陣列層I由基底層(超高分辨成像專用光學(xué)玻片)和貼合在該基底上的微孔陣列層組成。
[0101 ]制作流程如圖8所示，具體步驟如下:
[0102](a)勻膠:以Dow Corning 3140為例，以7000rpm的轉(zhuǎn)速勻膠30s即可在PMMA層上得到很薄的一層黏膠。
[0103](b)光刻膠干膜微陣列制備:用100微米厚的光刻膠干膜經(jīng)過前烘、曝光、后烘、顯影等過程得到微孔陣列膜備用。
[0104](C)和(d)將光刻膠微孔陣列膜輕輕按壓在該薄層黏膠后再揭下即可在微孔陣列膜上粘附一層薄膠。
[0105](e)貼附微孔陣列膜:將粘附了薄膠的微孔陣列膜按壓在超高分辨成像專用光學(xué)玻片上，靜置4h以上后即可將該膜貼附在光學(xué)玻片上。
[0106](f)和(g)制備超疏水層:制備步驟同實(shí)施例1中的步驟(c)和(d)。
[0107](h)再次勻膠:以Dow Corning 3140為例，以7000rpm的轉(zhuǎn)速勻膠30sS卩可在PMMA層上得到很薄的一層黏膠。將貼附好的光刻膠微孔陣列膜輕輕按壓在該薄層黏膠后再揭下即可在微孔陣列膜上粘附一層薄膠。
[0108](i)微坑陣列芯片的制備:將粘附了薄膠的微孔陣列按壓在超疏水層上，靜置4h以上后揭下微坑芯片即可在微孔陣列的上層轉(zhuǎn)移一層超疏水層，即得超疏水微坑陣列芯片。
[0109]實(shí)施例4、本發(fā)明超疏水微坑陣列芯片的效果和用途
[0110]—、自發(fā)形成液滴陣列及液滴的均一性
[0111]由于本發(fā)明超疏水微坑陣列芯片中的超疏水層對(duì)水溶液具有強(qiáng)烈的排斥作用，因此可以自發(fā)地形成液滴陣列。形成方式如下:首先將通過懸垂逐滴滴下液滴，利用重力沖擊力使得水溶液進(jìn)入微孔即可在超疏水微坑陣列中形成液滴陣列(如圖9所示)；一旦形成液滴后可以將整張芯片浸沒，再抽走多余的水溶液又能在微坑陣列中自發(fā)的形成液滴陣列，這個(gè)過程可以反復(fù)循環(huán)進(jìn)行。因此在這個(gè)超疏水芯片上可以很方便地形成高通量細(xì)胞微陣列，而不需要通過機(jī)械臂點(diǎn)樣的方式逐個(gè)微坑添加細(xì)胞形成細(xì)胞陣列，同時(shí)保證微坑陣列之間完全物理隔絕，基本上避免了交叉污染。
[0112]使用涂膠棒輕輕掃過超疏水芯片液滴陣列表面，可以顯著提高液滴陣列的均一性，如圖10所示，液滴體積的方差從11 %減小到I %。這說明超疏水微坑陣列可以進(jìn)行定量檢測(cè)分析。此外，本發(fā)明超疏水微坑陣列的液滴體積在50nL左右，相對(duì)于傳統(tǒng)多孔板中微升級(jí)的體積顯著降低了試劑的消耗量，大大減少了高通量細(xì)胞檢測(cè)分析的成本。
[0113]二、本發(fā)明超疏水微坑陣列芯片在高通量細(xì)胞微陣列的形成、培養(yǎng)中的應(yīng)用
[0114](D實(shí)驗(yàn)材料
[0115]DMEM basic(lX)培養(yǎng)基(貨號(hào):C11995500B7)，F(xiàn)BS(Fetal Bovine Serum,胎牛血清，貨號(hào):10099-141)，雙抗(青霉素penicillin和鏈霉素streptomycin)(上述均購自Thermal Fisher) oPBS(phosphate buffer saline，磷酸鹽緩沖液)pH 7.4basic(I X )(購自 Gibco ,Life technologies ,貨號(hào):C10010500BT)，Ca Ice in AM (I丐黃綠素，購自 ThermalFisher,貨號(hào)C3100MP)，PI (溴化丙啶，購自Sigma Aldrich,貨號(hào)25535)，福爾馬林溶液(購自 Sigma Aldrich,貨號(hào)252549)，Triton-X 100(購自 Sigma Aldrich，貨號(hào)X100-500ML)，BSA(牛血清蛋白，Bovine Serum Albumin，購自 AMRES⑶，貨號(hào):0332_100g)，鼠抗人CD31 單抗(購自 Sigma，貨號(hào)SAB4700463_100yg)，鼠抗人VE-cadherin單抗(購自 Santa CruzB1technology，貨號(hào):SC-9989)，山羊抗鼠二抗(Alexa Fluor 488 goat ant1-mouseantibody，購自Life Technologies，貨號(hào):A10667) ,Tween 20，DAPI(上述試劑均購自SigmaAldrich) ,Matrigel(購自BD公司，貨號(hào)356231)，胰酶(HyClone Trypsin 0.25%(1 X )solut1nHealthcare Life Sciences,貨號(hào):SH30042.01)，倉鼠腎細(xì)胞BHK_21(購自英茂盛業(yè)生物科技有限公司)、人臍靜脈血管上皮細(xì)胞HUVEC(購自南京科佰生物科技有限公司，品牌ATCC，產(chǎn)品目錄號(hào)CBP60340)和人慢性髓原白血病細(xì)胞K562(購自南京科佰生物科技有限公司，品牌ATCC，產(chǎn)品目錄號(hào)CBP60529)。
[0116]熒光倒置顯微鏡(1X83 ,Olympus)，真空栗(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，61^-8028型)，培養(yǎng)箱(冊(cè)1^0611 150i J^lgThermal Scientific)
[0117](2)實(shí)驗(yàn)步驟:
[0118]A、本發(fā)明液滴式培養(yǎng)
[0119]如圖11所示，利用本發(fā)明超疏水微坑陣列芯片實(shí)現(xiàn)高通量細(xì)胞微陣列的培養(yǎng)及檢測(cè)分析，整個(gè)細(xì)胞微陣列操作主要包括超疏水微坑加液，加細(xì)胞，形成液滴，液滴式培養(yǎng)，換液等多個(gè)步驟，具體如下:
[0120]I)超疏水微坑加液:由于嫁接的超疏水層對(duì)水溶液具有強(qiáng)烈的排斥作用，因此細(xì)胞培養(yǎng)液并不能按照常規(guī)加液的方式加入，本發(fā)明采用懸滴砸入的方式向微坑中加液，即用1mL的吸量管吸取DMEM溶液(HyClone DMEM高糖液體培養(yǎng)基，購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)后，在芯片上方懸空20cm逐滴滴下，液滴通過重力作用克服超疏水層的排斥進(jìn)入微坑。
[0121]2)加細(xì)胞:目前有兩種方式向微坑中加入細(xì)胞。第一種方式是當(dāng)所有微坑中都被液滴充滿后，將整張芯片浸沒，然后加入細(xì)胞懸液，晃勻后使細(xì)胞自然沉降，即可將細(xì)胞加入各個(gè)微坑中。第二種方式是在超疏水微坑中形成液滴陣列后，通過手持加液槍逐個(gè)微坑地加入細(xì)胞，這樣的加入方法所需的細(xì)胞數(shù)目非常少，可以有望在可獲得數(shù)量極少的珍貴細(xì)胞樣品的高通量檢測(cè)中發(fā)揮重要的作用。
[0122]3)浸沒式培養(yǎng):將上述細(xì)胞溶液點(diǎn)陣再次用培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基，10% FBS,100U/mL青霉素，和100yg/mL鏈霉素)浸沒，逐孔拍照確定起始細(xì)胞數(shù)目，然后開始液滴式培養(yǎng)。
[0123]4)液滴形成:將浸沒芯片的多余培養(yǎng)基完全抽走就可以自發(fā)地形成液滴陣列。
[0124]5)液滴式培養(yǎng):為了抑制高通量細(xì)胞微陣列在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時(shí)的蒸發(fā)，采用套裝培養(yǎng)皿放置超疏水芯片(如圖12a，12b所示)，并在外層的培養(yǎng)皿中加入滅菌水，保證液滴陣列微環(huán)境的空氣濕度達(dá)到飽和。
[0125]6)換液:經(jīng)過12h液滴式培養(yǎng)后，加入新鮮培養(yǎng)基浸沒超疏水芯片，靜置1min，使新鮮培養(yǎng)基可以充分?jǐn)U散進(jìn)入超疏水微坑中，完成新舊培養(yǎng)基的交換。在浸沒換液的同時(shí)逐孔對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目，以細(xì)胞相對(duì)增殖倍數(shù)的Ln值為縱坐標(biāo)，以增殖時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞的增殖曲線。最后再將多余的培養(yǎng)基抽走，即可重新形成液滴陣列，以便進(jìn)行進(jìn)一步的液滴培養(yǎng)增殖。這個(gè)過程可以循環(huán)往復(fù)進(jìn)行，因此本發(fā)明超疏水微坑陣列芯片可以進(jìn)行高通量細(xì)胞微陣列長(zhǎng)時(shí)間的液滴式培養(yǎng)。
[0126]7)細(xì)胞存活率分析:細(xì)胞液滴式培養(yǎng)結(jié)束后，加入5mL PBS溶液浸沒細(xì)胞液滴陣列，同時(shí)加入50yL Calcein AM(100 X )溶液和5yL PI溶液(1000 X )，混勻后在37°C條件下孵育30min。顯微鏡下逐孔拍照，觀察統(tǒng)計(jì)細(xì)胞液滴式培養(yǎng)后的存活率。Calcein AM能夠在活細(xì)胞內(nèi)酶的作用下水解為鈣黃綠素，發(fā)出綠色熒光，故綠色熒光通道顯示的為活細(xì)胞;PI能夠穿透死細(xì)胞或者凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核內(nèi)的DNA雙鏈結(jié)合發(fā)出紅色熒光，所以紅色熒光通道顯示死細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。
[0127]8)免疫熒光染色實(shí)驗(yàn):HUVEC細(xì)胞72h液滴式培養(yǎng)結(jié)束后，需要進(jìn)行免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其是否能夠特異性表達(dá)CD31和VE Cadherin兩種蛋白。首先在液滴培養(yǎng)結(jié)束后用福爾馬林溶液固定超疏水芯片上的HUVEC細(xì)胞10分鐘，再將福爾馬林吸去，用PBS洗三次(福爾馬林溶液有毒，應(yīng)收集在廢液瓶里)。用封閉液(PBS+0.05% Triton-X 100+2% BSA)封閉2小時(shí)。吸去封閉液，用封閉液將抗人CD31抗體稀釋100倍，加200uL于微孔上，4度孵育過夜(周圍加一些液體，用封口膜封上，防止蒸發(fā)變干)。用清洗緩沖液(PBS+0.05% Tween20)洗三次，每次5分鐘，緩慢震蕩。再用封閉液將二抗稀釋100倍，加200uL于微孔上，室溫孵育2小時(shí)，注意避光。清洗緩沖液洗三次，每次5分鐘。加DAPI染色液200uL于組織上，孵育10分鐘，PBS洗三遍。注意避光。熒光顯微鏡觀察。VE Cadherin的染色過程類似。
[0128]9)成血管化檢測(cè):72h液滴式培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS溶液浸沒液滴陣列，充分?jǐn)U散交換清洗干凈微孔內(nèi)的培養(yǎng)基，然后將PBS抽走，加入胰酶溶液覆蓋住微孔陣列，細(xì)胞消化Imin后將胰酶溶液抽走，再加入培養(yǎng)基將芯片浸沒，用移液槍逐孔逐片吹打?qū)⒓?xì)胞吹出，然后把細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，離心后抽走多余上層清液，使得最終細(xì)胞大致濃度為1-3 X 10'5個(gè)細(xì)胞。與此同時(shí)，準(zhǔn)備好Matrigel處理的培養(yǎng)皿，將消化得到的HUVEC細(xì)胞加到有Matrigel處理的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)觀察，驗(yàn)證HUVEC細(xì)胞是否仍然具有成血管的潛力。
[0129]按照上述步驟對(duì)倉鼠腎細(xì)胞BHK-21、人臍靜脈血管上皮細(xì)胞HUVEC和人慢性髓原白血病細(xì)胞K562進(jìn)行液滴式培養(yǎng)，培養(yǎng)條件均如下:37°C，5% CO2培養(yǎng)箱。
[0130]B、對(duì)照一:浸沒式培養(yǎng)
[0131 ]作為對(duì)照，同時(shí)將上述細(xì)胞進(jìn)行浸沒式培養(yǎng)，步驟如下:
[0132]I)超疏水微坑加液:由于嫁接的超疏水層對(duì)水溶液具有強(qiáng)烈的排斥作用，因此細(xì)胞培養(yǎng)液并不能按照常規(guī)加液的方式加入，這里我們采用懸滴砸入的方式向微坑中加液，即用1mL的吸量管吸取DMEM溶液(HyClone DMEM高糖液體培養(yǎng)基，購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)后，在芯片上方懸空20cm逐滴滴下，液滴通過重力作用克服超疏水層的排斥進(jìn)入微坑。
[0133]2)加細(xì)胞:第一種加細(xì)胞方式為直接浸沒超疏水微坑芯片，再向芯片培養(yǎng)皿中加入4-6 X 10~4個(gè)細(xì)胞溶液。混勻后靜置沉降1min抽走多余細(xì)胞溶液，即可形成細(xì)胞溶液點(diǎn)陣。第二種加細(xì)胞方式是在超疏水微坑中形成液滴陣列后，通過手持加液槍逐個(gè)微坑地加入細(xì)胞，這樣的加入方法所需的細(xì)胞數(shù)目非常少，可以有望在可獲得數(shù)量極少的珍貴細(xì)胞樣品的高通量檢測(cè)中發(fā)揮重要的作用。
[0134]3)浸沒式培養(yǎng):將上述細(xì)胞溶液點(diǎn)陣再次用培養(yǎng)基浸沒，逐孔拍照確定起始細(xì)胞數(shù)目，然后開始浸沒式培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37 °C，5 % CO2培養(yǎng)箱。
[0135]4)換液:經(jīng)過12h浸沒式培養(yǎng)后，抽走原來的培養(yǎng)基，再加入新鮮培養(yǎng)基浸沒超疏水芯片，然后逐孔對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目，以細(xì)胞相對(duì)增殖倍數(shù)的Ln值為縱坐標(biāo)，以增殖時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞的增殖曲線。繼續(xù)進(jìn)行浸沒式培養(yǎng)，每隔12h換一次液。
[0136]5)細(xì)胞存活率分析:細(xì)胞液滴式培養(yǎng)結(jié)束后，加入5mL PBS溶液浸沒細(xì)胞液滴陣列，同時(shí)加入50yL Calcein AM(100 X )溶液和5yL PI溶液(1000 X )，混勻后在37°C條件下孵育30min。顯微鏡下逐孔拍照，觀察統(tǒng)計(jì)細(xì)胞液滴式培養(yǎng)后的存活率。Calcein AM能夠在活細(xì)胞內(nèi)酶的作用下水解為鈣黃綠素，發(fā)出綠色熒光，故綠色熒光通道顯示的為活細(xì)胞;PI能夠穿透死細(xì)胞或者凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核內(nèi)的DNA雙鏈結(jié)合發(fā)出紅色熒光，所以紅色熒光通道顯示死細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。
[0137]C、對(duì)照二:普通24孔板培養(yǎng)
[0138]作為對(duì)照，同時(shí)將上述細(xì)胞在普通24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，步驟如下:
[0139]I)加細(xì)胞:直接向24孔板中加入細(xì)胞溶液，細(xì)胞起始密度與超疏水微孔陣列中細(xì)胞密度相當(dāng)。
[0140]2)培養(yǎng):將24孔板置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。
[0141 ] 3)計(jì)數(shù):經(jīng)過12h培養(yǎng)后，同時(shí)取6個(gè)孔統(tǒng)計(jì)細(xì)胞密度，以細(xì)胞相對(duì)增殖倍數(shù)的Ln值為縱坐標(biāo)，以增殖時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞的增殖曲線。
[0142]4)換液:除K562細(xì)胞外其他種類細(xì)胞均需進(jìn)行換液操作，除已計(jì)數(shù)孔外，將其余各孔的培養(yǎng)液抽走，加入同等量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)在37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，然后再取6個(gè)孔統(tǒng)計(jì)細(xì)胞密度，以細(xì)胞相對(duì)增殖倍數(shù)的Ln值為縱坐標(biāo)，以增殖時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞的增殖曲線。
[0143](3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0144]培養(yǎng)結(jié)果如圖13所示。本發(fā)明超疏水微坑陣列的生物相容性非常好，可以進(jìn)行超過6天的高通量細(xì)胞微陣列培養(yǎng)，可以進(jìn)行大多數(shù)平臺(tái)很難實(shí)現(xiàn)的高通量懸浮細(xì)胞微陣列式培養(yǎng)。本發(fā)明的超疏水微坑陣列能夠進(jìn)行原代細(xì)胞，干細(xì)胞的高通量微陣列式長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)(圖13a所示)；經(jīng)過數(shù)十小時(shí)的液滴式培養(yǎng)后，細(xì)胞也能夠保持較高的存活率，只有不足5 %的細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡或死亡，與浸沒式培養(yǎng)的結(jié)果相當(dāng)(圖13b所示)；超疏水微坑芯片上的細(xì)胞微陣列培養(yǎng)的細(xì)胞增殖速度與普通24孔板中的增殖速度基本一致(圖13c所示)。
[0145]本發(fā)明超疏水微坑陣列上原代細(xì)胞微陣列，以HUVEC為例，經(jīng)過72h液滴式培養(yǎng)后也能夠很好地特異性表達(dá)⑶31，VE-cadherin這兩種蛋白，同時(shí)也維持著成血管化的功能(如圖14所示)。
[0146]三、本發(fā)明超疏水微陣列芯片在高通量細(xì)胞微陣列的分析檢測(cè)中的應(yīng)用
[0147]本發(fā)明超疏水微坑陣列由于實(shí)現(xiàn)了液滴陣列的物理隔絕，因此可以很容易地通過噴樣技術(shù)將紅、綠兩種顏色的熒光染料分子(羅丹明B和異硫氰酸熒光素)加入隔列加入不同的微坑中(如圖15a所示)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞微陣列的高通量檢測(cè)和分析。圖15a所示為通過噴樣可以將不同顏色的染料加入不同列的微坑中，微坑間無交叉污染發(fā)生。此外，本發(fā)明還可以實(shí)現(xiàn)定量化地加入綠色熒光分子異硫氰酸熒光素，實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物分子的濃度梯度加入(圖15b和圖15c所示)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種超疏水微坑陣列芯片，它包括微坑陣列層，其特征在于:所述微坑陣列層上設(shè)有微坑的表面上除微坑或微坑底部以外的表面為超疏水表面。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超疏水微坑陣列芯片，其特征在于:所述微坑以外的表面為超疏水表面，所述超疏水微坑陣列芯片包括微坑陣列層和貼合在所述微坑陣列層表面上的超疏水層。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的超疏水微坑陣列芯片，其特征在于:所述超疏水層的厚度為10?200μπιο4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的超疏水微坑陣列芯片，其特征在于:所述微坑陣列層包括基底層和貼合在所述基底表面的微孔陣列層，所述基底層為超高分辨成像專用光學(xué)玻片。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超疏水微坑陣列芯片，其特征在于:所述微坑底部以外的表面為超疏水面，所述微坑陣列層包括基底層和貼合在所述基底表面的微孔陣列層，所述微孔陣列層是由超疏水材料制作的。6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的超疏水微坑陣列芯片的制作方法，其特征在于:它包括將所述微坑陣列層上除微坑或微坑底部以外的表面制作成超疏水表面的步驟。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制作方法，其特征在于:所述方法為下述I)或2): 1)將所述微坑陣列層上除微坑以外的表面制作成超疏水表面，步驟如下: l_a)在所述微坑陣列層中設(shè)有微坑的表面粘附一層膠；l_b)將粘附膠的微坑陣列層按壓在超疏水層的表面，經(jīng)靜置后揭下微坑陣列層，即可得到權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)所述的微坑陣列芯片； 2)將所述微坑陣列層上除微坑底部以外的表面制作成超疏水表面，步驟如下: 2_a)在基底上建立微柱陣列；2-b)取另一基底，與步驟2-a)中所述微柱陣列對(duì)齊并固定在一起;在兩個(gè)基底中間的空隙中灌注超疏水預(yù)聚物，經(jīng)固化后分離，即得權(quán)利要求5所述的超疏水微坑陣列芯片。8.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的超疏水微坑陣列芯片在下述I)-8)中任一項(xiàng)或制備具有下述I) -8)中任一項(xiàng)功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用: 1)構(gòu)建高通量細(xì)胞微陣列； 2)高通量細(xì)胞培養(yǎng)； 3)高通量細(xì)胞分析檢測(cè)； 4)高通量細(xì)胞轉(zhuǎn)染； 5)高通量藥物篩選； 6)高通量干細(xì)胞微環(huán)境的組合式篩選； 7)高通量超分辨成像； 8)高通量STORM超分辨成像樣品制備。9.一種利用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的超疏水微坑陣列芯片進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的方法，它包括下述a)-c)中的至少一種: a)加液步驟，它包括如下步驟:將溶液在所述超疏水微坑陣列芯片上方懸空逐滴滴下，即可完成所述加液步驟； b)加細(xì)胞的步驟，它為下述b-1)或b-2): b_l)在所述超疏水微坑陣列芯片中的微坑被液滴充滿后，將所述超疏水微坑陣列芯片浸沒，然后加入細(xì)胞懸液，待細(xì)胞自然沉降后即可將完成所述加細(xì)胞的步驟； b-2)在形成液滴陣列的超疏水微坑中，逐個(gè)加入細(xì)胞，即可完場(chǎng)所述加細(xì)胞的步驟； c)換液的步驟，它包括如下步驟: c-1)將所述超疏水微坑陣列芯片中加入新鮮的培養(yǎng)液并浸沒所述超疏水微坑陣列芯片，通過靜置完成新舊培養(yǎng)基的交換； c-2)抽走多余的培養(yǎng)液至重新形成液滴陣列，即可完成所述換液的步驟。
【文檔編號(hào)】C12M3/00GK105861309SQ201610232372
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月14日
【發(fā)明人】劉鵬, 張鵬飛, 張健雄, 邊升太, 程淳, 程一淳
【申請(qǐng)人】清華大學(xué)