一株深綠木霉ta-9菌株及其在水稻病害防控中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領域，設及一株深綠木霉菌（Trichoderma atrovi;ride)TA-9及 其在水稻病害防控中的應用。 技術背景
[0002] 目前，使用化學農(nóng)藥是農(nóng)作物病害防治的主要措施之一?；瘜W農(nóng)藥在提高農(nóng)產(chǎn)品 產(chǎn)量和品質方面起到了重要作用，但大量使用化學農(nóng)藥也導致了如環(huán)境污染、生態(tài)破壞、農(nóng) 產(chǎn)品農(nóng)藥殘留和病原菌產(chǎn)生抗藥性等一系列問題。充分利用綜合防控措施對植物病害進行 防治，減少化學農(nóng)藥使用，已成為植保工作者的共識。利用環(huán)境中的有益微生物防控植物病 害是熱點研究方向之一。木霉作為植物病害生防因子一直收到普遍關注。木霉常見于±壤 中，是±壤微生物的重要群落，對多種植物病原真菌，如立枯絲核菌、腐霉、疫霉、輪枝菌、鑲 刀菌等具有括抗和寄生作用，目前已形成商業(yè)化木霉生防制劑，如，美國的Topshield(哈 茨木霉T22)、W色列的Trichodex (哈茨木霉T39)、新西蘭的木霉制劑Tricho化y和 Trichoflow等。鑒于木霉菌來源廣泛，對不同植物病原菌的括抗和寄生能力有不同，其應用 植物對象也有差異，因此仍需針對某些重要植物病害進行木霉菌株的篩選和開發(fā)應用。
[0003] 水稻在其生長季受多種真菌病害的威脅。如，隨著優(yōu)質高產(chǎn)水稻品種在我國大面 積推廣種植，為水稻紋枯病和稻曲病等真菌病害提供了較好的流行發(fā)生條件，病害發(fā)生呈 現(xiàn)上升趨勢。其中水稻紋枯病為我國水稻上的主要病害之一，目前抗病育種中尚缺乏有效 的抗病基因。水稻紋枯病為上傳病害，病原菌為立枯絲核菌巧hizoctonia solani)，病原菌 先侵入莖基部葉銷隨后擴展。生產(chǎn)上主要使用微生物源殺菌劑井岡霉素和=挫類化學殺菌 劑如丙環(huán)挫、苯離甲環(huán)挫、己挫醇等進行防治。其中，井岡霉素長期超量單一使用防治水稻 紋枯病，已有部分地區(qū)水稻紋枯病菌產(chǎn)生抗藥性且防治效果有所下降的報道。
[0004] 稻曲病在我國各大稻區(qū)均有發(fā)生，已成為水稻上的重要病害之一，其病原菌為稻 綠核菌扣Stilaginoidea Virens),可侵入谷粒形成稻曲球，并產(chǎn)生對人畜有毒的毒素，降 低水稻產(chǎn)量和品質，影響食品安全。稻曲病防治最佳時期為水稻破口前5~7天，目前水稻 生產(chǎn)上也長期主要使用井岡霉素進行防治。
[0005] 生物防治作為一項重要的病害防控措施已得到社會的廣泛認可和關注。在水稻病 害防治領域，生防制劑仍較缺乏，更多高效、安全、穩(wěn)定的生物農(nóng)藥亟需開發(fā)，而木霉菌作為 一類公認的具有生防潛力的真菌具有較好的應用開發(fā)前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種深綠木霉，它可W作為生物農(nóng)藥防治多種水稻病害。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過下列技術措施實現(xiàn)的：本發(fā)明深綠木霉（Tr i choderma atroviride)TA-9菌株是從南京市200份被真菌寄生的水稻稻曲球樣品中分離獲得，已于 2014年9月23日被中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中屯、（CGMCC)保藏，其保藏 編號為CGMCC No. 9698, W上所述木霉菌菌株的ITS序列如SEQ ID No. 1所示。拉了學名 為；Trichoderma atroviride TA-9。
[000引菌株培養(yǎng)特性記載為：在PDA培養(yǎng)基上最適生長溫度為25-30°C，最高生長溫度為 37°C。30°C培養(yǎng)2d，菌落直徑可達到6. 1cm。在PDA上培養(yǎng)4山中央可形成綠色的分生抱子 產(chǎn)抱區(qū)域，有挪子氣味。
[0009] 菌株形態(tài)特征包括；分生抱子梗的可育延伸物沒有或很少產(chǎn)生，沒有不育的菌 毛；分生抱子梗典型分枝方式為單側分枝，分枝角度近似90°。瓶梗直或彎曲，常為單生， 2-4個則呈旋禍狀排列。分生抱子綠色，表面光滑，球形或亞球形，3. 0~5. 0 ymX 2. 3~ 4. 0 ym，長寬比值為0. 8~1. 6,無明顯的脫落痕跡。
[0010] 本發(fā)明采集江蘇省散落稻田中的稻曲球，半埋于濕潤的石英砂中，28 °C培養(yǎng) 15-20d，分離稻曲球上的寄生真菌，分離純化菌株，然后依次與立枯絲核病菌（化izoctonia solani)和稻綠核菌化stilaginoidea virens)進行離體對時病原菌抑制試驗。經(jīng)過反復 篩選，最終選出對立枯絲核菌和稻綠核菌具有強寄生作用、可高產(chǎn)厚垣抱子和分生抱子的 木霉菌菌株，編號為TA-9。通過菌落、分生抱子梗、瓶梗、分生抱子等形態(tài)特征W及內(nèi)轉錄基 因間區(qū)核巧酸序列（口巧的檢測，確定該菌株為深綠木霉（Trichoderma atroviride)。
[0011] 深綠木霉TA-9的厚垣抱子和分生抱子液體發(fā)酵物的獲得，包括如下步驟： (1) 菌株活化；將深綠木霉TA-9移至PDA斜面培養(yǎng)基上，在28-30°C下培養(yǎng)7d ; (2) 用無菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)基上的分生抱子，用血球計數(shù)板計數(shù)后將抱子液濃度 調(diào)節(jié)至1. 〇Xl〇6個/血； (3) 配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每200mL培養(yǎng)基裝入1L S角培養(yǎng)瓶中，121°C濕熱滅菌 30min ； (4) 每200mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟（2)中所述木霉分生抱子液2mL; (5) 在黑暗條件下，30°C，160r/min搖培7-9d，將發(fā)酵培養(yǎng)物用組織搗碎機打碎后獲得 含有5. 4X 107個/血的厚垣抱子和1. 6 X 10 8個/血分生抱子的發(fā)酵混合液；
[0012] 步驟（1)中，PSA培養(yǎng)基組分；200g馬鈴馨煮液、20g葡萄糖，瓊脂20g，用水定容至 1L。分裝后121°C濕熱滅菌備用。 步驟（2)中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分；15g玉米粉、20g燕麥粉，調(diào)節(jié)抑至5.0,用水定容 11。
[00巧]本發(fā)明有益效果： (1) 本發(fā)明提供一種新的生防菌株一-深綠木霉TA-9菌株，該木霉菌株對立枯絲核菌 (Miizoctonia solani)和稻綠核菌OJstilaginoidea virens)具有較強的寄生能力；該菌 株的液體發(fā)酵物可作為生防菌劑用于防治由立枯絲核菌巧hizoctonia solani)引起的水 稻紋枯病和由稻綠核菌扣stilaginoidea virens)引起的稻曲病。 (2) 該菌株發(fā)酵工藝簡單易行，其中厚垣抱子含量高，將有利于長時間貶藏。
【附圖說明】
[0016] 圖1為深綠木霉菌株TA-9在菌落對時培養(yǎng)中重寄生立枯絲核菌和稻綠核菌的照 片。
[0017] 圖2為深綠木霉菌株TA-9對水稻紋枯病的防效。
[001引圖3為深綠木霉菌株TA-9對稻曲病的防效。
【具體實施方式】
[0019] W下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發(fā)明，但不W任何形式限制 本發(fā)明。在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可W做出若干變形和改進。該些都屬于本發(fā)明 的保護范圍。
[0020] 實施例1 ;分離獲得深綠木霉（Trichoderma atroviride)TA-9菌株的方法。
[0021] PDA培養(yǎng)基配方為；馬鈴馨200g/l，葡萄糖20g/l，水比，瓊脂20g/L(固體培養(yǎng) 基）。將馬鈴馨去皮后切成小塊，加1L水后煮沸30min，用2層紗布過濾，濾液加葡萄糖，加 水補足至比，如制作固體培養(yǎng)基需加入瓊脂后并煮沸，分裝后121°C濕熱滅菌。
[00巧包括W下步驟： (1) 菌株分離、純化和保存。在南京市多處水稻田中的收集水稻采收后7-10天散落在