一株高產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體是一株高產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素酶是指能水解纖維素的β_1，4糖苷鍵，使纖維素降解為纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱，是由多個水解酶組成的復(fù)雜酶系。該酶主要由外切葡聚糖酶、內(nèi)切
葡聚糖酶、葡萄糖苷酶和濾紙酶組成。纖維素酶主要由真菌、細(xì)菌和放線菌等微生物產(chǎn)生。由于纖維素酶能將環(huán)境中廣泛存在的纖維素質(zhì)原料如秸桿、稻草、木屑等水解為葡萄糖，因此纖維素酶在紡織、飼料、發(fā)酵工業(yè)、食品和環(huán)境工程等領(lǐng)域具有巨大的市場潛力，甚至在中國完全有可能成為第一大酶種，因此纖維素酶是酶制劑工業(yè)中的一個新的增長點。
[0003]目前對纖維素酶產(chǎn)生菌的研究大多數(shù)集中于木霉屬，而木霉屬由于存在安全性，在食品和飼料上的應(yīng)用受到限制。而黑曲霉是一種纖維素酶的產(chǎn)生菌，具較好的安全性，所以目前國內(nèi)外對其產(chǎn)纖維素酶能力的研究報道逐漸增多。如1996年趙小立等以黑曲霉為出發(fā)菌株，采用銅蒸汽激光誘變處理獲得了 4株高產(chǎn)的突變菌株，每克濕曲的最高酶活:cmc酶活為2839mg葡萄糖/g.h、濾紙酶活為299mg葡萄糖/g.h、β -葡萄糖苷酶活為1091mg葡萄糖/g*h【錢育軍等，黑曲霉產(chǎn)纖維素酶菌種的激光選育.中國激光，1996 (07):第667-672頁】。2007年胡立明等通過液體深層發(fā)酵方法研究黑曲霉產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，獲得的最佳產(chǎn)酶條件為:纖維素粉3 %、硝酸鉀3 %、聚乙二醇0.1 %，初始pH6.5，接種量10%、32°C培養(yǎng)5d，纖維素酶各組分酶活力分別為:濾紙酶活力、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活力分別為24.52U/mL,20.63U/mL和6.89U/mL【胡立明等，黑曲霉產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵條件的研究.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2007 (01):第70-74頁】。2012年杜曉梅等以啤酒糟為主要原料，采用黑曲霉3.316(Aspergillus niger3.316)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，對培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明:啤酒糟和麩皮的質(zhì)量比為8:2、水料質(zhì)量比為1.5:1、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、發(fā)酵時間為4d時，所產(chǎn)纖維素酶活性最大，濾紙酶活性和羧甲基纖維素酶活性分別達(dá)72.6118和692.1700nkat【杜曉梅等，黑曲霉3.316固態(tài)發(fā)酵啤酒糟生產(chǎn)纖維素酶.青島科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2012 (03):第263-268頁】。
[0004]雖然眾多的研究者對應(yīng)用黑曲霉生產(chǎn)纖維素酶進(jìn)行了研究，但如何提高纖維素酶的活力仍然是一個亟待解決的難題。該難題的解決對于開闊其應(yīng)用領(lǐng)域和市場份額具有重要的的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種產(chǎn)高活力纖維素酶的黑曲霉。
[0006]本發(fā)明提供的黑曲霉Aspergillus niger L1-2013-03是由實驗室保藏的一株產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉AspergillusnigerL1-2010經(jīng)亞硝基胍多輪誘變篩選，然后對優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測試篩選得到產(chǎn)高活力纖維素酶的黑曲霉菌株AspergiIIus nigerL1-2013-03。
[0007]本發(fā)明提供的產(chǎn)高活力纖維素酶的菌株具體為黑曲霉Aspergillus nigerL1-2013-03。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，郵編100101)，保藏號為 CGMCC N0.7927。
[0008]本發(fā)明黑曲霉菌株Aspergillus nigerL1-2013-03 (CGMCC N0.7927)具有以下微生物學(xué)特征:
[0009]1、形態(tài)學(xué)特征:
[0010]黑曲霉菌株CGMCC N0.7927，生物學(xué)形態(tài)為包括分生孢子、胞梗、頂囊、產(chǎn)胞結(jié)構(gòu)等幾部分。分生孢子頭球形至輻射形，直徑150-450 μ m，分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)。胞梗莖1000-3000 (長度)X 12-20 (直徑)μ m，黃色或黃褐色，壁平滑；頂囊球形或近似球形，直徑45-75 μ m,表面全面可育；產(chǎn)胞結(jié)構(gòu)雙層，?；?0-20 (長度)X 4.5-7.0 (直徑)μ m,瓶梗6-10 (長度)X 2.5-3.5 (直徑)μ m，分生孢子球形或近球形，直徑3-4.5 μ m,褐色，壁粗糙。
[0011]2、培養(yǎng)學(xué)特征:
[0012]菌株在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長迅速，28°C 4天孢子可鋪滿斜面；質(zhì)地絲絨狀或稍帶絮狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量，褐黑色，無滲出液；菌落反面略帶黃色。
[0013]3、生理生化特征:
[0014]黑曲霉菌株CGMCC N0.7927可在玉米秸桿、稻草、木屑、馬鈴薯、玉米粉、可溶性淀粉、糖蜜等碳源上生長，最適pH范圍5-6，最適生長溫度范圍28-33°C，最適產(chǎn)酶溫度范圍28-30。。。
[0015]本發(fā)明黑曲霉菌株CGMCC N0.7927的篩選技術(shù)路線為:出發(fā)菌株一斜面培養(yǎng)一孢子懸液的制備一誘變處理一平板分離一初篩一復(fù)篩一遺傳穩(wěn)定性測定一擴大實驗(發(fā)酵性能測定)。
[0016]按誘變篩選方案，對突變株逐級篩選淘汰，最后對優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測試篩選，得到一株高產(chǎn)酶性能菌株黑曲霉菌Aspergillus nigerL1-2013-03，發(fā)酵96小時后纖維素酶的外切β -葡聚糖酶、內(nèi)切β -葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達(dá)到620U/mL、1289U/mL、456U/mL 和 732U/mL。
[0017]有益效果:本發(fā)明提供的黑曲霉Aspergillus nigerL1-2013-03具有纖維素酶產(chǎn)量高的優(yōu)點，經(jīng)篩選過程培養(yǎng)基優(yōu)化，與出發(fā)菌株相比生長迅速，28°C發(fā)酵4天直徑75mm，發(fā)酵液纖維素酶的的外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達(dá)到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分別比出發(fā)菌株提高了 9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。
【具體實施方式】
[0018]下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019]本發(fā)明提供的黑曲霉菌株Aspergillus nigerL1-2013-03是由實驗室保藏的一株產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)的黑曲霉Aspergillus nigerL1-2010經(jīng)多輪亞硝基胍誘變，然后對突變株逐級篩選淘汰，最后對優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測試篩選得到產(chǎn)高活力纖維素酶的黑曲霉菌株Aspergillus nigerL1-2013-03。
[0020]本發(fā)明提供的產(chǎn)高活力纖維素酶的菌株具體為黑曲霉Aspergillus nigerL1-2013-03。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，郵編100101)，保藏號為 CGMCC N0.7927。
[0021]產(chǎn)高活力纖維素酶菌株的篩選方法，包括以下步驟:
[0022]I)斜面培養(yǎng):將原始黑曲霉菌株Aspergillus niger Li_2010劃線接種斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)2?3d，直至菌絲體成熟、產(chǎn)大量黑色孢子。所述斜面培養(yǎng)基組成如下:
12。Brix 麥芽汁 100mL, pH 值自然，121°C滅菌 20min ；
[0023]2)孢子懸液制備(以下步驟均在無菌條件下操作):向試管斜面加入15mL無菌水，把孢子刮下，用濾紙過濾，將濾過液倒入已滅菌、并加有5-10粒無菌玻璃珠的150mL三角瓶中，將三角瓶放入搖床振蕩10-15min，使孢子分散。
[0024]3)亞硝基胍(NTG)誘變
[0025]A.用無菌水將孢子懸浮液調(diào)節(jié)為稀釋成16-1O7個/mL。
[0026]B.取1mL菌懸液轉(zhuǎn)移至10mL三角瓶中，加入1mg的NTG,配制成終濃度為1mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0027]C.在30°C下200rpm振蕩反應(yīng)30min, 5000rpm離心1min收集菌體,用無菌生理鹽水洗滌數(shù)次，中止反應(yīng)。
[0028]D.適當(dāng)稀釋將孢子濃度調(diào)節(jié)為13個/mL，取最后稀釋度的菌液0.2mL，稀釋涂布于纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基上。在30°C培養(yǎng)2?3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株200支。(所述纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基組成如下:纖維素粉10g、剛果紅0.2g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、明膠2g、瓊脂20g、自來水定容100mL, pH 值 5-6,121°C滅菌 20min)。
[0029]E.復(fù)篩:將獲得的200株菌分別用無菌牙簽接種于斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)至孢子鋪滿斜面。分別將孢子以無菌水洗下接種于裝有50mL復(fù)篩培養(yǎng)基的250mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵，接種量10% (V/V)，30°C、100r/min培養(yǎng)96h，分別測定各菌株的纖維素酶活性。(所述復(fù)篩培養(yǎng)基組成如下:纖維素粉50g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、自來水定容lOOOmL，pH值5-6，121°C滅菌20min)。選取纖維素酶酶活力最高的菌株進(jìn)行放大實驗。
[0030]4)遺傳穩(wěn)定性試驗
[0031]將L1-2013-03菌株在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復(fù)篩的方法檢測每次傳代后的發(fā)酵情況。實驗發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標(biāo)都正常，說明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強。
[0032]5)放大試驗
[0033]①種子培養(yǎng):將纖維素酶酶活力最高的菌株Aspergillus nigerL1-2013-03接入500mL三角瓶中，種子培養(yǎng)基裝量100毫升，30°C、150rpm搖床培養(yǎng)72_96h。
[0034]③種子罐培養(yǎng):將種子液以10% (v/v)接種量接入裝有7.5L發(fā)酵液的1L發(fā)酵罐中，控制pH值恒定為6.0±0.2，培養(yǎng)溫度30±0.1°C，攪拌速度300rpm，通風(fēng)量(v/v) I:0.8-1.2，培養(yǎng)時間96h，溶解氧20-30%。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:纖維素粉100g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、自來水定容lOOOmL，pH值5-6，121°C滅菌20mino
[0035]發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵上清液(粗酶液)進(jìn)行酶活力檢測經(jīng)測定，菌株AspergillusnigerL1-2013-03的外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達(dá)到 620U/mL、1289U/mL、456U/mL 和 732U/mL,分別比出發(fā)菌株 AspergillusnigerL1-2010 提高了 9.21 倍、7.43 倍、8.15 倍和 10.31 倍。
【主權(quán)項】
1.黑曲霉菌株(Aspergillusniger)，保藏編號為CGMCC N0.7927。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述黑曲霉菌株(Aspergillusniger),其特征在于所述黑曲霉菌株CGMCC N0.7927生長溫度范圍28_33°C，產(chǎn)酶溫度范圍28_30°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述黑曲霉菌株(Aspergillusniger),其特征在于所述黑曲霉菌發(fā)酵96小時后纖維素酶的外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達(dá)到 620U/mL、1289U/mL、456U/mL 和 732U/mL。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉，本發(fā)明屬于黑曲霉領(lǐng)域，特別涉及高產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉菌株。本發(fā)明所提供的黑曲霉(Aspergillusniger)，該菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.7927。發(fā)酵罐實驗跟蹤的各項性能指標(biāo)表明，該菌株代謝正常，產(chǎn)纖維素酶能力強，是一株優(yōu)良的纖維素酶高產(chǎn)菌株。CGMCC No792720130715
【IPC分類】C12R1-685, C12N1-14
【公開號】CN104630069
【申請?zhí)枴緾N201310571925
【發(fā)明人】李政, 李績, 喬長晟, 張健飛
【申請人】天津工業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年11月12日