專利名稱：擬康氏木霉胞外多糖作為治療胃癌藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，屬于擬康氏木霉胞外多糖作為治療胃癌藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是一種常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤是當前危害人類健康最嚴重的一類疾病。2008年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全世界有大約1270萬的人被診斷患有腫瘤，近760萬的人死于腫瘤，據(jù)報道估計，在2030年將有超過2100萬的人患有腫瘤，1300萬的人將因腫瘤死亡。具數(shù)據(jù)調(diào)查顯示全世界因腫瘤死亡的病例占所有死亡病例約為13%。我國最為嚴重和危害性較大的腫瘤有胃癌、肺癌、鼻咽癌、食管癌、大腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病及淋巴瘤等,每年約有180萬人因腫瘤去世。胃癌早期診斷困難，多數(shù)患者確診時已達晚期，因此以化療為主的綜合治療成為晚期胃癌的主要治療手段。在全世界范圍，胃癌的死亡率占各類腫瘤死亡率的第二位，約為23. 2%。在我國，胃癌占惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的首位。手術(shù)、放療、化療是治療腫瘤的三大傳統(tǒng)方法，化學治療是應(yīng)用于惡性腫瘤全身治療的主要方法之一，但大部分抗腫瘤化學藥物在殺死腫瘤細胞的同時，也嚴重損傷了正常細胞，因此尋找抗腫瘤活性顯著并且對人體毒副作用小的抗腫瘤藥物具有重要意義。多糖(polysaccharide)是由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接形成的含醒基或酮基的多羥基聚合物及其衍生物。多糖具有廣泛的生物學功能，不僅可以作為體內(nèi)的供能物質(zhì)及細胞的基本組分，還參與細胞識別、機體免疫功能調(diào)節(jié)、細胞間物質(zhì)運輸、細胞的轉(zhuǎn)化、細胞凋亡等過程。菌種保藏號為CGMCC No. 1443 的擬康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)真菌是從玉米秸桿中分離獲得的，具有很強的生長優(yōu)勢，液體發(fā)酵培養(yǎng)過程中分泌大量的胞外多糖。中國專利文獻CN101220101A (申請?zhí)枮?00810014047. 8)公開了一種擬康氏木霉胞外多糖，該多糖的特征在于(I)通過高效凝膠過濾層析檢測，其具有單一對稱峰，分子量為18325 ; (2)通過改良的硫酸-苯酚法和間苯基苯酚法檢測，其中性多糖含量為65. 2%，糖醛酸含量為32. 6% ；(3)通過糖醇乙酸酯的GC分析，其單糖組成為鼠李糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比為RHA GLC GAL=5. 6 :2. 7 :1. 0。該多糖完全還原后，鼠李糖、葡萄糖和半乳糖的摩爾比為RHA GLC GAL= 14. 5 :9. 3:1.0，并且其含有摩爾含量為26. 6%的葡萄糖醛酸。這種擬康氏木霉胞外多糖的制備方法包括粗多糖的制備和多糖的純化。目前，擬康氏木霉胞外多糖的功能性研究已成為擬康氏木霉菌研究的熱點，但擬康氏木霉胞外多糖對人類胃癌細胞生長影響的研究還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容為擬康氏木霉胞外多糖作為治療胃癌藥物的應(yīng)用。所述的擬康氏木霉為CGMCC No. 1443的擬康氏木霉(Trichodermapseudokoningii)。
所述的擬康氏木霉胞外多糖為CN101220101A所制備的多糖。所述的擬康氏木霉胞外多糖抑制人胃癌細胞生長的機制是通過線粒體途徑誘導(dǎo)癌細胞發(fā)生凋亡擬康氏木霉胞外多糖作用于人胃癌細胞后，癌細胞的線粒體膜電位下降，細胞素色C釋放，并于凋亡相關(guān)因子結(jié)合，使癌細胞發(fā)生凋亡；同時癌細胞內(nèi)活性氧ROS濃度增加，過量的ROS加劇線粒體膜電位的下降和細胞色素C的釋放。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，所述的擬康氏木霉胞外多糖可以在體外降低人胃癌細胞BGC-823、MKN-45、MGC-803細胞活力；使BGC-823細胞周期阻滯于S期，提高其胞內(nèi)活性氧濃度，并且使細胞內(nèi)的線粒體膜電位下降，引起人胃癌細胞BGC-823細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻，誘導(dǎo)BGC-823細胞核聚縮、碎裂產(chǎn)生凋亡小體，發(fā)生凋亡從而達到殺滅腫瘤細胞，抑制腫瘤生長的目的；擬康氏木霉胞外多糖在體內(nèi)能夠抑制BGC-823荷瘤小鼠、MKN-45荷瘤小鼠、MGC-803荷瘤小鼠腫瘤生長，明顯減輕瘤重，具有抗腫瘤作用。


圖1不同濃度擬康氏木霉胞外多糖(EPS)體外給藥對人胃癌細胞BGC-823體外增殖活性的抑制率；

其中*表示t檢驗后，與對照組相比呈顯著性差異(P〈0.05)林表示t檢驗后，與對照組相比呈極顯著性差異(Ρ〈0· 01)圖2不同濃度擬康氏木霉胞外多糖體外給藥對人胃癌細胞ΜΚΝ-45體外增殖活性的抑制率。其中*表示t檢驗后，與對照組相比呈顯著性差異(Ρ〈0.05)**表示t檢驗后，與對照組相比呈極顯著性差異(Ρ〈0· 01)圖3不同濃度擬康氏木霉胞外多糖體外給藥對人胃癌細胞MBGC-803體外增殖活性的抑制率。其中*表示t檢驗后，與對照組相比呈顯著性差異(Ρ〈0.05)**表示t檢驗后，與對照組相比呈極顯著性差異(Ρ〈0· 01)圖4不同濃度擬康氏木霉胞外多糖體外給藥對人胃癌細胞BGC-823形態(tài)的影響；圖5擬康氏木霉胞外多糖體外給藥對人胃癌細胞BGC-823 DNA的影響圖6不同濃度擬康氏木霉胞外多糖體外給藥誘導(dǎo)人胃癌細胞BGC-823發(fā)生凋亡；圖7擬康氏木霉胞外多糖體外給藥對人胃癌細胞BGC-823活性氧的影響。圖8不同濃度擬康氏木霉胞外多糖體外給藥對人胃癌細胞BGC-823線粒體膜電位的影響。圖9擬康氏木霉胞外多糖體內(nèi)給藥對人胃癌細胞BGC-823小鼠腫瘤生長的影響。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。實施例中，擬康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號為CGMCC No. 1443 ；擬康氏木霉胞外多糖為CN101220101A所制備的多糖SRB 購自 Sigma-Aldrich 公司；
Hoechst 33258染色液、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒、DNA Ladder抽提試劑盒、Rhodamine 123、PI購自碧云天生物技術(shù)有限公司；人胃癌細胞BGC-823、MKN-45、MGC-803購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；臺盼藍購自上海滬宇生物有限公司；RPM1-1MO 為市售。其他試劑均為本領(lǐng)域常用市售試劑，分析純，BALB / C_nu / nu裸鼠購自中國科學院上海實驗動物中心。PBS:—種緩沖液，由蒸餾水配制而成，每升含磷酸二氫鉀0.27g，磷酸氫二鈉1. 42g，氯化鈉 8g，氯化鉀 O. 2g，pH 7.4ο實施例1擬康氏木霉胞外多糖體外給藥對人胃癌細胞BGC-823、MKN-45、MGC-803增殖活性的影響 SRB是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料，可以與經(jīng)三氯乙酸固定后的細胞蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合呈現(xiàn)一種明亮的粉紅色，并且其顏色的變化與活細胞中的蛋白成正比，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度，可得到一個準確的細胞蛋白含量的數(shù)值，以此來計算細胞數(shù)目，反映細胞的增殖活性。實驗方法取處于對數(shù)生長期 的人胃癌細胞86(-823、1謂-45、1^(-803，制成密度為6\104個/ml細胞懸液,接種于96孔板內(nèi)，150 μ L/孔。培養(yǎng)24 h后,每孔加不同濃度的擬康氏木霉胞外多糖溶液50 μ L (終濃度為O. 2、0. 4,0. 6,0. 8、lmg/ml )，每孔總液量為200 μ L，每個藥物濃度設(shè)6個復(fù)孔，并設(shè)空白對照(沒有細胞，只加RPM1-1640培養(yǎng)液)和正常對照孔(不加藥物，加等量RPM1-1640培養(yǎng)液)，37°C、5%C02、飽和濕度(下述細胞培養(yǎng)條件同此)培養(yǎng)24、48,72小時。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入50μ L4°C的50wt%的三氯乙酸(TCA)溶液，使TCA的終濃度為10wt%，靜置5 min放入4°C冰箱中固定I h。去離子水洗滌5遍，晾干后每孔加入100 μ L O. 4wt%的SRB，室溫放置30 min,棄去各孔液體，用lwt%乙酸洗滌5遍，空氣干燥后每孔加入150uL pH為10. 5的10mmol/L Tris base (三輕甲基氨基甲燒)溶液,平板振蕩器上振蕩5min，直至染料全部溶解，使用酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測定OD值并記錄。抑制率=(對照組OD值-處理組OD值)/對照孔OD值X 100%擬康氏木霉胞外多糖在體外對人胃癌細胞的增殖活性有抑制作用，實驗結(jié)果見圖
1、2、3。擬康氏木霉胞外多糖顯著抑制了人胃癌細胞的體外增殖，并具有時間和劑量依賴性。不同濃度擬康氏木霉胞外多糖處理24h、48h和72h，對人胃癌細胞的生長均產(chǎn)生了抑制作用，對BGC-823抑制率最高達到42. 57%，對MKN-823抑制率最高達到26. 54%，對MGC-803抑制率最高達到36. 34%。實施例2擬康氏木霉胞外多糖體外給藥對人胃癌細胞BGC-823染色質(zhì)形態(tài)的影響細胞發(fā)生凋亡時細胞膜通透性發(fā)生改變，細胞核中的染色質(zhì)聚縮并產(chǎn)生凋亡小體，H0echst33258染料能穿透細胞膜，與DNA結(jié)合，呈藍色熒光，在熒光顯微鏡下可見細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)濃染致密的顆粒塊狀熒光，直觀的觀察到細胞核的形態(tài)變化。
實驗方法將無菌蓋玻片置于六孔板內(nèi)，種入人胃癌細胞BGC-823孵育24h。次日加入不同濃度的擬康氏木霉胞外多糖溶液刺激細胞48小時后，移除培養(yǎng)液，加入O. 5ml固定液(4%多聚甲醛)，固定10分鐘。吸去固定液，PBS清洗后加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分鐘，PBS洗去染色液。熒光顯微鏡下觀察并拍照，激發(fā)波長為350nm左右，發(fā)射波長460nm左右。擬康氏木霉胞外多糖體外給藥導(dǎo)致人胃癌細胞BGC-823細胞核染色質(zhì)形態(tài)的改變，結(jié)果如圖4。Hoechst 33238染色液染色結(jié)果顯示，對照組細胞大小均勻、形態(tài)規(guī)則、細胞核染色較淺，擬康氏木霉胞外多糖處理組細胞膜皺縮，細胞核染色質(zhì)聚縮深染，性狀不規(guī)貝U，出現(xiàn)凋亡小體。凋亡小體的產(chǎn)生是細胞發(fā)生凋亡的顯著標志，說明擬康氏木霉胞外多糖可以誘導(dǎo)人胃癌細胞BGC-823發(fā)生凋亡。實施例3擬康氏木霉胞外多糖體外給藥對人胃癌細胞BGC-823 DNA的影響細胞凋亡的一個顯著特點是細胞染色體的DNA降解，產(chǎn)生180_200bp的整倍的DNA片段，表現(xiàn)在瓊脂糖凝膠電泳中就呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜，而壞死則呈彌漫的連續(xù)圖
-1'TfeP曰。實驗方法取對數(shù)生長期人胃癌細胞BGC-823，種于六孔板內(nèi)，孵育24h。次日加入不同濃度擬康氏木霉胞外多糖溶液，處理48h后收獲細胞，分別提取DNA，再配制1%的瓊脂糖凝膠，分別上樣，電壓80v，進行電泳。 擬康氏木霉胞外多糖體外給藥能誘導(dǎo)人胃癌細胞BGC-823凋亡，產(chǎn)生DNA凋亡片段，瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜，結(jié)果如圖5，條帶從左往右依次是Mark，濃度為0、0. 2、0. 6、1. Omg/mL的擬康氏木霉胞外多糖處理BGC-823后的電泳圖譜。實施例4擬康氏木霉胞外多糖體外給藥誘導(dǎo)人胃癌細胞BGC-823發(fā)生凋亡細胞膜上磷脂酰絲氨酸外翻是細胞早期凋亡的重要標志之一，Annexin-V是一種對磷脂酰絲氨酸具有高親和性的I丐離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，Annexin V-FITC是用帶有綠色熒光的熒光探針FITC標記的Annexin V，用來檢測細胞凋亡是出現(xiàn)在細胞膜表面的磷脂酰絲氨酸。實驗方法取對數(shù)生長期人胃癌細胞BGC-823，調(diào)整濃度為5X IO5個/ml，種于六孔板內(nèi)，孵育24h。次日加入不同濃度擬康氏木霉胞外多糖溶液，處理48h后收獲細胞。取5-10萬細胞，加入 195yL Annexin V-FITC 結(jié)合液，然后加入 5 μ L Annexin V-FITC，室溫(20-25V )避光孵育10分鐘，IOOOg離心5分鐘，棄上清，加入190 μ L Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞，加入10 μ L碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，隨即上機檢測，AnnexinV-FITC激發(fā)光為綠色熒光，碘化丙啶激發(fā)光為紅色熒光。擬康氏木霉胞外多糖體外給藥誘導(dǎo)人胃癌細胞BGC-823發(fā)生凋亡，結(jié)果見圖6。人胃癌細胞BGC-823經(jīng)擬康氏木霉胞外多糖處理48h后，相對于對照組，處理組人胃癌細胞BGC-823的早期凋亡細胞(右下象限)比例從O. 71%上升至29. 2%，晚期凋亡和壞死細胞(右上象限)從O. 74%提高到14. 9%，隨濃度提高，凋亡細胞數(shù)目逐步增加，呈劑量依賴性，說明擬康氏木霉胞外多糖可以誘導(dǎo)人胃癌細胞BGC-823發(fā)生凋亡。實施例5擬康氏木霉胞外多糖體外給藥對人胃癌細胞BGC-823細胞周期的影響。細胞發(fā)生凋亡時，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活使DNA廣泛降解、斷裂，DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生劇變，小分子DNA可經(jīng)通透細胞膜逸出細胞外，凋亡小體也可帶走一部分DNA，導(dǎo)致細胞內(nèi)總DNA量降低，在正常GcZG1期細胞前出現(xiàn)一 DNA低染細胞群，稱凋亡峰，分析峰的百分比可得出凋亡細胞百分比。流式細胞術(shù)可分析凋亡細胞DNA變化。實驗方法人胃癌細胞BGC-823經(jīng)不同濃度擬康氏木霉胞外多糖作用48h后，收集細胞，離心，棄上清，預(yù)冷4 1的75%乙醇固定，固定24h后離心，棄固定液，加lOOyg/mL的PI染色，4 1避光孵育30 min,流式細胞儀檢測。擬康氏木霉胞外多糖體外給藥能使人胃癌細胞BGC-823周期阻滯于S期，結(jié)果見表I。圖7中A、B、C、D分別是濃度為0、0. 2、0. 6、1. Omg/mL的擬康氏木霉胞外多糖作用人胃癌細胞BGC-823 48h后的周期分布圖，可觀察到隨濃度增加，亞二倍體細胞數(shù)量明顯增力口，當濃度達到I mg/mL時，亞二倍體凋亡峰明顯增加，細胞凋亡比例達到16. 8%。從表I中可看出隨處理組濃度增加，G2/M期細胞明顯減少，由對照組的22. 78%下降到7. 30% ；S期細胞由對照組的13. 01%增加到32. 95%，且呈劑量依賴關(guān)系，結(jié)果顯示擬康氏木霉胞外多糖處理細胞后，主要將腫瘤細胞阻滯于S期，細胞在S期大量堆積，不能進行細胞分裂，最終導(dǎo)致腫瘤細胞快速凋亡。表I
權(quán)利要求
1.擬康氏木霉胞外多糖作為治療胃癌藥物的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬康氏木霉胞外多糖作為治療胃癌藥物的應(yīng)用，其特征在于所述的擬康氏木霉為CGMCC No. 1443。
全文摘要
本發(fā)明涉及擬康氏木霉胞外多糖作為治療胃癌藥物的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥及保健食品技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明中的具有抗腫瘤活性的擬康氏木霉胞外多糖，體外給藥可以明顯抑制人胃癌細胞BGC-823、MKN-45、MGC-803生長；引起B(yǎng)GC-823細胞內(nèi)活性氧的爆發(fā)和線粒體膜電位的下降，使腫瘤細胞內(nèi)核酸斷裂，產(chǎn)生DNA片段，并使BGC-823細胞周期阻滯于S期，最終導(dǎo)致癌細胞發(fā)生凋亡,從而產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)；體內(nèi)給藥能抑制BGC-823荷瘤小鼠、MKN-45荷瘤小鼠、MGC-803荷瘤小鼠腫瘤生長，減輕瘤重，具有顯著的抗腫瘤作用。
文檔編號A61P35/00GK103027924SQ20121048679
公開日2013年4月10日 申請日期2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月26日
發(fā)明者陳靠山, 林俊, 李萍, 錢文 申請人:皖南醫(yī)學院