專利名稱：耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)在微生物采油育種中的應(yīng)用，具體涉及一種利用電擊轉(zhuǎn) 化法構(gòu)建的耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程菌，以及該基因工程菌在選擇性封堵高溫 油藏高滲透層、提高其原油采收率中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在各種能源需求量日益增加的今天，全世界對石油開采空前關(guān)注，尋找既有效又 廉價(jià)的三次采油新技術(shù)是各國一直探索的目標(biāo)。多年的經(jīng)驗(yàn)證明，必須選擇最有效的三次 采油方法，才能保證在有限的基本建設(shè)投資條件下最大限度地采出原油。油田開發(fā)進(jìn)入中 后期，增產(chǎn)挖潛的難度不斷加大，僅靠注水開發(fā)已很難提高原油采收率。微生物采油法通常是指向油藏注入合適的菌種及營養(yǎng)物，使菌株在油藏中繁殖， 代謝石油，產(chǎn)生氣體或活性物質(zhì)，降低油水界面張力，以提高石油采收率。微生物提高原油 采收率(Microbial Enhanced Oil Recovery, MEOR)是繼熱力驅(qū)、化學(xué)驅(qū)、聚合物驅(qū)等傳統(tǒng) 方法之后的利用微生物的有益活動(dòng)及代謝產(chǎn)物來提高原油采收率的一項(xiàng)綜合性技術(shù)。與其 他三次采油技術(shù)相比，MEOR具有適用范圍廣、工藝簡單、投資少、見效快、功能多、費(fèi)用低、不 損傷油層和無污染等優(yōu)點(diǎn)，是目前很具發(fā)展前景的一項(xiàng)提高原油采收率的技術(shù)。我國于1955年開始微生物勘探研究。20世紀(jì)60年代，勝利油田和新疆油田開展 過短期的微生物采油技術(shù)研究工作；大慶油田在“七五”到“九五”期間的相關(guān)研究和試驗(yàn) 取得一定進(jìn)展；20世紀(jì)80年代末至90年代初，中國科學(xué)院與吉林油田合作開展單井吞吐 技術(shù)研究和試驗(yàn)，一些高校和科研院所單獨(dú)或與油田合作開展室內(nèi)研究和現(xiàn)場試驗(yàn)；20世 紀(jì)90年代初，國外(主要是美國)公司為國內(nèi)微生物采油提供技術(shù)服務(wù)，主要進(jìn)行井筒處 理或單井吞吐。微生物采油的大部分現(xiàn)場試驗(yàn)取得成功，引起了油田重視，特別是一些進(jìn)入 開發(fā)后期的老油田。微生物提高原油采收率的真正成功或突破的關(guān)鍵在于“超級菌”的組建，因此，培 養(yǎng)較強(qiáng)競爭力的基因工程菌是現(xiàn)代微生物采油技術(shù)的主要目標(biāo)之一。從自然界篩選得到的 野生菌種性能各異，很難同時(shí)既具有優(yōu)良驅(qū)油性能，又具有很好的環(huán)境適應(yīng)性，其礦場應(yīng)用 范圍也往往因此受到很大的限制。利用基因工程，可針對性地培養(yǎng)有利菌株，拓寬微生物采 油的菌種資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖的基因工程菌，該菌株能 夠在高溫下產(chǎn)生胞外水不溶性多糖。本發(fā)明的另一目的在于提供利用所述的耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程菌 產(chǎn)水不溶性多糖的方法，以及所生產(chǎn)得到的水不溶性多糖。本發(fā)明的另一目的在于提供所述的耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程菌在選 擇性封堵高溫油藏的高滲透層、調(diào)剖和/或提高高溫油藏的高滲透層的原油采收率中的應(yīng)
本發(fā)明提供了一種耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程菌，本發(fā)明中將其命名為 GJ，其具有在高溫下高產(chǎn)胞外水不溶性多糖的能力。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的 該基因工程菌GJ是通過提取供體菌嗜熱菌Geobacillus kaustophilus的基因組DNA，利用 電擊轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)移至受體菌腸桿菌屬EntercAacter sp.菌中而得到的。本發(fā)明中所述的受體菌EntercAacter sp.(根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，是從吉 林油田采集的水樣中篩選得到的一株EntercAacter sp.菌，命名為JD菌)，在37°C時(shí)夠以 單糖為碳源代謝產(chǎn)生胞外水不溶性多糖，這種水不溶性聚合物吸水性很強(qiáng)，濕重是干重的 200倍。礦場先導(dǎo)試驗(yàn)表明JD菌可以對高滲透油藏進(jìn)行選擇性封堵，但是其代謝產(chǎn)生胞外 水不溶性多糖的性能受環(huán)境溫度影響較大，當(dāng)溫度超過40°C時(shí)，難以形成多糖聚合物，不能 應(yīng)用于溫度較高的油藏。本發(fā)明中所述的供體菌Geobacillus kaustophilus，是從大慶高溫油田采出水中 分離得到的一株嗜熱菌(命名為GW菌)，其最適溫度60V 70°C，但不具有產(chǎn)胞外水不溶 多糖的性狀。本發(fā)明旨在提高JD菌代謝產(chǎn)生胞外水不溶性多糖的耐溫性能，通過提取GW的基 因組DNA，利用電擊轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)移至JD菌中，得到一株工程菌，本發(fā)明命名為GJ，該基因 工程菌GJ可在溫度低于56°C條件下利用廢糖蜜穩(wěn)定代謝產(chǎn)生胞外水不溶性多糖，當(dāng)培養(yǎng) 溫度為50°C時(shí)所產(chǎn)胞外水不溶性多糖的干重為受體菌在37°C所產(chǎn)胞外水不溶性多糖干重 的2 3倍。本發(fā)明的基因工程菌GJ產(chǎn)胞外水不溶性多糖溫度低于56°C，pH 6 8，可耐 受30000mg/L鹽濃度。本發(fā)明的工程菌菌株GJ已于2010年6月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所， 100101)，保藏編號為 CGMCC No. 3909。本發(fā)明還提供了一種耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程菌制劑，該基因工程菌 制劑中含有本發(fā)明的保藏編號為CGMCC No. 3909的耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程 菌，可以是固態(tài)菌制劑，或是液態(tài)菌制劑或者含活菌的發(fā)酵培養(yǎng)液的形式。本發(fā)明還提供了一種利用本發(fā)明所述基因工程菌GJ或基因工程菌制劑生產(chǎn)胞 外水不溶性多糖的方法，該方法包括將本發(fā)明所述的基因工程菌或基因工程菌制劑在發(fā) 酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生胞外水不溶性多糖。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述基因工程菌 產(chǎn)糖最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組分為廢糖蜜2% 4% (V/V)，(NH4)2PO4O. 05% 0. (ff/V), NaC15000 30000mg/L ；產(chǎn)胞外多糖條件為pH 6 8，溫度低于58°C，在溫度低至15°C的 環(huán)境下也能穩(wěn)定地產(chǎn)胞外水不溶性多糖，優(yōu)選的產(chǎn)胞外水不溶性多糖的溫度為20 56°C， 更優(yōu)選為40 56°C。本發(fā)明的基因工程菌GJ具有較高的產(chǎn)胞外水不溶性多糖的能力，且 所產(chǎn)胞外水不溶性多糖比野生菌JD所產(chǎn)水不溶性多糖更難以水解，在驅(qū)油過程中將更優(yōu) 于野生菌的效果。本發(fā)明還提供了一種水不溶性多糖，其是利用本發(fā)明所述基因工程菌GJ或基因 工程菌制劑得到的。本發(fā)明還提供了所述的耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程菌，或所述的基因工 程菌制劑，或所述的水不溶性多糖，在微生物采油中的應(yīng)用。
具體地，本發(fā)明提供了所述的耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程菌，或所述的 基因工程菌制劑，或所述的水不溶性多糖，在選擇性封堵高溫油藏的高滲透層中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述的耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程菌，或所述的基因工 程菌制劑，或所述的水不溶性多糖，在提高原油采收率特別是高溫油藏的高滲透層的原油 采收率中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述的耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程菌，或所述的基因工 程菌制劑，在高溫調(diào)剖中的應(yīng)用。本發(fā)明的基因工程菌具有良好的耐高溫特性，可以用作高 溫油藏調(diào)剖菌。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在具體應(yīng)用時(shí)，以所述基因工程菌GJ的發(fā)酵液(培 養(yǎng)至對數(shù)生長期)的5%的稀釋菌液計(jì)，是向高滲透層中注入0. 5 2PV的稀釋菌液，培養(yǎng) M小時(shí)以上，達(dá)到所述的選擇性封堵高溫油藏的高滲透層、提高高溫油藏的高滲透層的原 油采收率的效果。在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，利用本發(fā)明的基因工程菌GJ對人造巖芯進(jìn)行選 擇性封堵的物理模擬試驗(yàn)，具體操作為(1)地層水驅(qū)人造巖芯，測封堵前巖芯的驅(qū)替壓 力；( 注入用發(fā)酵培養(yǎng)基稀釋5%濃度的菌液(培養(yǎng)至對數(shù)生長期后稀釋)0. 5 2PV左 右，20 56°C恒溫培養(yǎng)至少M(fèi)小時(shí)，通常是培養(yǎng)7 左右；C3)再次以地層水驅(qū)巖芯，測封 堵后巖芯的驅(qū)替壓力。通過基因工程菌GJ作用前后巖芯驅(qū)替壓力的變化得出基因工程菌 GJ對高滲透層的封堵效果，試驗(yàn)證明本發(fā)明的基因工程菌GJ可選擇性封堵高溫油藏的高 滲透層，具有良好的封堵效果。在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方案中，利用本發(fā)明的基因工程菌GJ進(jìn)行提高原油采 收率的物理模擬試驗(yàn)，具體操作為(1)巖芯抽真空，飽和地層水；(2)將巖芯飽和油，至巖 芯中的束縛水飽和，記錄排出的水的體積，置于20 56°C恒溫箱中老化M小時(shí)；(3)用地 層水驅(qū)油至含水量達(dá)到98%，記錄該過程中的壓力變化，及排出液體的總液量和其中的含 水量；(4)向巖芯中注菌液，活化的GJ菌液(培養(yǎng)至對數(shù)生長期)用發(fā)酵液體培養(yǎng)基稀釋 20倍后注入到巖芯中，注入體積約0. 5 2PV，20 56°C恒溫培養(yǎng)至少M(fèi)小時(shí)，通常培養(yǎng) 7 左右；( 后續(xù)水驅(qū)至連續(xù)含水率98%以上。記錄該過程中的壓力變化，及排出液體的 總液量和其中的含水量，以此計(jì)算基因工程菌GJ提高原油采收率的效率。試驗(yàn)證明本發(fā)明 的基因工程菌GJ可有效提高高溫油藏的高滲透層的原油采收率。綜上所述，本發(fā)明通過電擊轉(zhuǎn)化法將GW菌的基因組DNA轉(zhuǎn)移至JD菌中，得到可在 500C以上高溫條件下產(chǎn)生胞外水不溶性多糖的基因工程菌，該基因工程菌可用于高溫油藏 的調(diào)剖，通過對高滲透層進(jìn)行選擇性封堵，達(dá)到提高原油采收率的目的，本發(fā)明還為微生物 采油所用菌株適用范圍的擴(kuò)大提供了有效的方法。


圖1為JD胞外水不溶性多糖酶解液液相色譜圖。圖2為GJ胞外水不溶性多糖酶解液液相色譜。圖3為JD及GJ在不同鹽濃度條件下所產(chǎn)胞外水不溶性多糖干重圖表。圖4為GJ在不同pH條件下所產(chǎn)胞外水不溶性多糖干重圖表。圖5為GJ在不同溫度條件下所產(chǎn)胞外水不溶性多糖干重圖表。
圖6為人造巖芯物理模擬試驗(yàn)裝置示意圖。圖7為GJ封堵試驗(yàn)驅(qū)替過程中壓力變化圖表。圖8為GJ提高采收率試驗(yàn)過程中采收率和含水率變化圖表。用于專利程序的微生物保存保藏日期2010年6月4日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)；保藏編號CGMCCNo. 3909 ；分類命名腸桿菌屬(Enterobacter sp.)。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明的基因工程菌GJ及特點(diǎn)和應(yīng)用中所 具有的技術(shù)效果，但本發(fā)明并不因此而受到任何限制。實(shí)施例1、基因工程菌的構(gòu)建第一步親本菌株的篩選受體菌JD的篩選方法為按照常規(guī)的菌株篩選方法，將從吉林油田采集的水樣稀 釋10000倍后，涂布到含4% (ν/ν)糖蜜的瓊脂平板上，30°C培養(yǎng)Mh，將分離的各種微生物 單菌落接到裝有50mL 4%糖蜜液體培養(yǎng)基中，30°C靜置厭氧培養(yǎng)1天，判斷不溶性聚合物 的產(chǎn)生狀況，經(jīng)過多次分離、純化，獲得一株產(chǎn)水不溶性聚合物的JD菌。該菌株可以在溫度 低于37°C條件下利用單糖合成胞外水不溶性多糖。供體菌GW的篩選方法為按照常規(guī)的菌株篩選方法，將大慶高溫油田采出水稀釋 10000倍后涂布LB平板，70°C培養(yǎng)Mh，平板上獲得的單菌落經(jīng)多次分離純化后的到一株耐 高溫的菌株GW，該菌株可在60 V 70 V溫度范圍內(nèi)生長。第二步GW基因組DNA的提取以-70°C保存的GW菌株涂布LB平板培養(yǎng)基，70°C培養(yǎng)12h后挑平板上的單菌落接 種5mL的LB液體培養(yǎng)基，700C、150rpm振蕩培養(yǎng)1 后取1. 5mL的發(fā)酵液，12000rpm離心 Imin0沉淀物加入567 μ L的TE緩沖液，用吸管反復(fù)吹打使之重懸。加入30 μ L 10%的SDS 禾口 3μ L 20mg .mL—1的蛋白酶k，混勻后于37°C溫育Ih0然后加入100 μ L 5mol -L^1NaCl充 分混勻，再加入80 μ L CTAB/NaCl溶液，混勻，于65°C溫育lOmin。加入等體積的氯仿/異 戊醇04 1)混勻，12000rpm離心5min。將上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新離心管中，加入等體積的酚 /氯仿/異戊醇05 24 1)后混勻，12000rpm離心5min。將上清液轉(zhuǎn)入新離心管中，加 入0. 6倍體積的異丙醇，混勻，_20°C放置30min。12000rpm離心lOmin，棄上清，每管加入 ImL預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀2次。12000rpm離心5min，棄上清，室溫自然干燥5min。每 管加入50 μ L滅菌的TE緩沖夜，溶解DNA。第三步JD感受態(tài)細(xì)胞的制備以-70°C保存的JD菌株接種完全培養(yǎng)基平板，37°C靜止培養(yǎng)24h后挑單菌落接種 LB液體培養(yǎng)基，37°C、220rpm培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6。將10%的甘油、菌液置于冰上冰浴30min。 取ImL菌液于13000rpm離心30s，棄上清，加入ImL 10%的甘油混勻，冰浴5min。13000rpm 離心30s,棄上清，加入ImLlO %的甘油混勻，冰浴5min。13000rpm離心30s,棄上清，加入 ImLlO%的甘油混勻，冰浴5min。13000rpm離心30s,棄上清，加入300 μ LlO%的甘油，冰浴
第四步基因工程菌的獲得60 μ L新鮮制備(或凍融)的JD感受態(tài)細(xì)胞中加入1 μ L GW染色體DNA(濃度 150ng · μ L—1 200ng · μ L—1)，吹打懸浮，冰上放置備用。取出浸泡在70 %乙醇中的電轉(zhuǎn)杯， 紫外線照射池，冰上預(yù)冷lOmin。將細(xì)菌與DNA混合物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，擦干電轉(zhuǎn) 杯外的冷凝水和霧氣。2mm電轉(zhuǎn)杯采用2. 8kV 3. OkV, 4. Oms 5. 9ms電擊一次。立即向杯 中加入600yL LB+1%葡萄糖培養(yǎng)液，吹吸數(shù)次，轉(zhuǎn)移至無菌的1. 5mL離心管，37°C IOOrpm 預(yù)培養(yǎng)池后轉(zhuǎn)至在含Amp的LB平板上，50 0C正置池后倒置培養(yǎng)。挑選單菌落接種含有1 % 葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基，50°C靜置培養(yǎng)，以液體培養(yǎng)基中是否產(chǎn)生胞外水不溶性多糖為評 價(jià)條件，篩選獲得一株耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖的基因工程菌，本發(fā)明中命名為GJ。該基 因工程菌菌株GJ已于2010年6月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心(CGMCC，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，保藏 編號為 CGMCC No. 3909。實(shí)施例2、JD菌與基因工程菌胞外水不溶性多糖水解產(chǎn)物比較將JD菌與基因工程菌GJ接種含有1 % (M/V)葡萄糖的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至產(chǎn)胞外 水不溶性多糖結(jié)束時(shí)，將發(fā)酵液在以3000rpm速度離心20min后去上清，取離心沉淀物加入 2mL 4% NaOH溶液，吹打懸浮，100°C沸水浴30min去除菌體蛋白，再離心取沉淀，加入適量 中性洗滌液在100°C的水浴中加熱Ih以除去沉淀物質(zhì)中的雜糖和脂類等雜質(zhì)，用去離子水 反復(fù)沖洗，干燥后加入三分之一胞外水不溶性多糖重量的纖維素酶，加入IOmL檸檬酸緩沖 液懸浮，置于50°C水浴中水解48h。取水解液以IOOOOrpm離心5min，取ImL上清液作液相 色譜，分析二者的胞外水不溶性多糖組成差異。JD菌胞外水不溶性多糖水解產(chǎn)物液相色譜結(jié)果見圖1 ；實(shí)施例1獲得的基因工程 菌GJ所產(chǎn)的胞外水不溶性多糖水解產(chǎn)物液相色譜結(jié)果見圖2。從結(jié)果的對比可知，二者胞 外水不溶性多糖組成成分大致相同，且基因工程菌GJ的胞外水不溶性多糖比JD菌更難以 水解，在驅(qū)油過程中將更優(yōu)于野生菌的效果。實(shí)施例3、鹽濃度對基因工程菌GJ產(chǎn)胞外水不溶性多糖的影響培養(yǎng)基為糖蜜4% (V/V)，(NH4) 2ΗΡ04 0. 1 % (ff/V)，NaCl濃度梯度分別為 15000mg/L、20000mg/L、25000mg/L、30000mg/L，接種已活化的 JD、GJ，接種量為 4%，基因工 程菌GJ的培養(yǎng)溫度為50°C，JD的培養(yǎng)溫度為37°C，靜止培養(yǎng)5天。培養(yǎng)結(jié)束后，濾紙過濾獲得胞外水不溶性多糖，干燥后稱重。鹽濃度對基因工程菌 GJ產(chǎn)胞外水不溶性多糖的影響結(jié)果見圖3，基因工程菌GJ在30000mg/L高鹽濃度下仍可以 產(chǎn)多糖，且產(chǎn)糖量較高，平均胞外水不溶性多糖產(chǎn)量是37°C培養(yǎng)JD菌的三倍。實(shí)施例4、pH對基因工程菌GJ產(chǎn)胞外水不溶性多糖的影響發(fā)酵培養(yǎng)基為糖蜜4% (V/V)，(NH4)2HPO4 0. 1% (W/V),NaCl 15000mg/L。以 20g/ L 的 NaOH 溶液和 5mol/L 的鹽酸調(diào) pH 值分別為 3. 96,5. 00,6. 06,7. 07,7. 98,8. 96,9. 76， 每個(gè)梯度設(shè)兩個(gè)平行樣，30mL發(fā)酵液體系，培養(yǎng)溫度為50°C，接種已活化的GJ，接種量為 2.5% (V/V)，靜止培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束后，濾紙過濾獲得胞外水不溶性多糖，干燥后稱重。pH對基因工程菌GJ 產(chǎn)胞外水不溶性多糖的影響結(jié)果見圖4，GJ對酸堿的耐受范圍較大，pH5. OO和9. 76時(shí)胞外水不溶性多糖量均可達(dá)到最適條件的一半，其最適產(chǎn)胞外水不溶性多糖的酸堿條件為 pH7. 0 8. 0。實(shí)施例5、溫度對基因工程菌GJ產(chǎn)胞外水不溶性多糖的影響發(fā)酵培養(yǎng)基組分糖蜜4% (V/V)，(NH4)2HPO4 0. 1% (ff/V), NaCl 15000mg/L。接 種已活化的GJ，每個(gè)梯度分別有兩個(gè)平行樣，40mL發(fā)酵液體系，接種量為2. 5 % (V/V)，靜止 培養(yǎng) 4 天，培養(yǎng)溫度分別為 47°C、50°C、51 °C、54°C、56 V、59°C。培養(yǎng)結(jié)束后，濾紙過濾獲得胞外水不溶性多糖，干燥后稱重。溫度對基因工程菌GJ 產(chǎn)胞外水不溶性多糖的影響結(jié)果見圖5，基因工程菌GJ最大產(chǎn)胞外水不溶性多糖的溫度為 M°C，當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到56°C時(shí)胞外水不溶性多糖的產(chǎn)量仍較高。實(shí)施例6、基因工程菌GJ對高溫油藏高滲透巖芯的選擇性封堵基因工程菌GJ對人造巖芯選擇性封堵的物理模擬試驗(yàn)，試驗(yàn)裝置見圖6圖中， 1為恒溫箱，2為液體收集器，3為巖心夾持器，4、5為壓力表，6、7、8為中間容器，9、10為 六通閥，11為平流泵。具體操作為人造巖芯(尺寸為025mmX71.2mm，氣測滲透率為 910. 559X 10_3 μ m2，孔隙體積為13. OmL,孔隙度為38. 69% )抽真空，飽和地層水(模擬地 層水水型為CaCl2水型)，將人造巖芯放入巖芯夾持器3后，再通過平流泵11將中間容器6 中的地層水驅(qū)人造巖芯(驅(qū)替速度為lmL/min)，通過壓力表4、5測封堵前巖芯驅(qū)替過程中 壓力的變化，至壓力恒定不變時(shí)停止水驅(qū)。注入中間容器8中的發(fā)酵培養(yǎng)基(糖蜜4% (V/ V)，(MM)2HPO4 0. 1% (W/V)，NaCl 15000mg/L)稀釋 5%濃度的菌液 1. 82PV，于恒溫箱 1 中 50°C恒溫培養(yǎng)72h。再次以地層水驅(qū)巖芯，至壓力恒定不變時(shí)停止水驅(qū)，記錄整個(gè)驅(qū)替過程 中壓力的變化，利用液體收集器2計(jì)量驅(qū)出液體的體積。通過工程菌作用前后驅(qū)替壓力的 變化得出其對高滲透層的封堵效果。GJ封堵試驗(yàn)驅(qū)替過程中壓力變化見圖7，調(diào)剖前水驅(qū)穩(wěn)定壓力為0. 0019MPa,經(jīng)GJ 作用后水驅(qū)穩(wěn)定壓力增加至0. llMPa，增加了 478. 95%。巖芯水驅(qū)穩(wěn)定壓力的增加證明基 因工程菌GJ對高溫油藏高滲透層具有高效的選擇性封堵作用。實(shí)施例7、基因工程菌GJ提高原油采收率的物理模擬試驗(yàn)基因工程菌提高原油采收率的物理模擬試驗(yàn)，試驗(yàn)裝置同實(shí)施例6，見圖6，具體 操作為人造巖芯(尺寸為Φ25πιπιΧ73. 5mm，氣測滲透率為858. 073 X 10_3 μ m2，孔隙體積為 14. 6mL，孔隙度為40. 53% )抽真空，飽和地層水(模擬地層水水型為CaCl2水型)。將人造 巖芯放入巖芯夾持器3后，再通過平流泵11將中間容器7中的原油注入至人造巖芯中使其 飽和油，直至人造巖芯中的束縛水飽和，利用液體收集器2記錄排出的水的體積，置于50°C 恒溫箱1中老化M小時(shí)。用地層水驅(qū)油至含水量達(dá)到98% (驅(qū)替速度為lmL/min)，通過 壓力表4、5記錄該過程中的壓力變化，以及液體收集器2測量的排出液體總液量和其中的 含水量。向巖芯中注菌液，活化的GJ菌液用發(fā)酵液體培養(yǎng)基(糖蜜4% (V/V)，(NH4)2HPO4 0. 1 % (W/V)，NaCl 15000mg/L)稀釋20倍后注入到巖芯中，注入體積1. 78PV，于恒溫箱1中 50°C恒溫培養(yǎng)72h。后續(xù)水驅(qū)至連續(xù)含水率98%以上。記錄該過程中的壓力變化，及排出 液體的總液量和其中的含水量，以此計(jì)算基因工程菌GJ提高原油采收率的效率。GJ提高采收率試驗(yàn)過程中采收率和含水率變化見圖8，GJ采收率由作用前的 67. 49 %上升到75. 53 %，采收率分別提高了 8. 04 %，含水率的從作用前的96 %降低到 75%。
權(quán)利要求
1.保藏編號為CGMCCNo. 3909的耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程菌，該基因工程菌是通 過電擊轉(zhuǎn)化法將嗜熱菌Geobacillus kaustophilus的基因組DNA轉(zhuǎn)移至產(chǎn)胞外多糖的腸 桿菌屬Enterobacter sp.菌中而得到的。
3.一種耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程菌制劑，該基因工程菌制劑中含有保藏編 號為CGMCC No. 3909的耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程菌，為固態(tài)或液態(tài)菌制劑。
4.利用權(quán)利要求1所述的基因工程菌或權(quán)利要求3所述的基因工程菌制劑生產(chǎn)胞外水 不溶性多糖的方法，該方法包括將權(quán)利要求1所述的基因工程菌或權(quán)利要求3所述的基因 工程菌制劑在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生胞外水不溶性多糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述基因工程菌產(chǎn)糖最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組分為廢 糖蜜 2% 4% (V/V)，(NH4)2PO4O. 05% 0. (ff/V),NaCl 5000 30000mg/L ；產(chǎn)胞外多 糖條件為PH 6 8，溫度低于58°C。
6.一種水不溶性多糖，其是按照權(quán)利要求4或5所述的方法制備得到的。
7.權(quán)利要求1所述的基因工程菌，或權(quán)利要求3所述的基因工程菌制劑，或權(quán)利要求6 所述的水不溶性多糖，在微生物采油中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的基因工程菌，或權(quán)利要求3所述的基因工程菌制劑，或權(quán)利要求6 所述的水不溶性多糖，在選擇性封堵高溫油藏的高滲透層中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的基因工程菌，或權(quán)利要求3所述的基因工程菌制劑，或權(quán)利要求6 所述的水不溶性多糖，在提高高溫油藏的高滲透層的原油采收率中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其中，以所述基因工程菌的發(fā)酵液的5%的稀釋 菌液計(jì)，是向高滲透層中注入0. 5 2PV的稀釋菌液，培養(yǎng)M小時(shí)以上。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程菌及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)在微生物采油中的應(yīng)用。本發(fā)明的基因工程菌是保藏編號為CGMCC No.3909的耐高溫產(chǎn)胞外水不溶性多糖基因工程菌，該基因工程菌的受體菌株為一株不耐高溫、可在37℃時(shí)產(chǎn)胞外水不溶性多糖的JD菌(Enterobacter sp.)，供體菌為嗜熱菌GW菌(Geobacillus kaustophilus)，本發(fā)明通過電擊轉(zhuǎn)化法將GW菌的基因組DNA轉(zhuǎn)移至JD菌中，得到可在50℃以上高溫條件下產(chǎn)生胞外水不溶性多糖的基因工程菌，該基因工程菌可用于高溫油藏的調(diào)剖，通過對高滲透層進(jìn)行選擇性封堵，達(dá)到提高原油采收率的目的，本發(fā)明還為微生物采油所用菌株適用范圍的擴(kuò)大提供了有效的方法。
文檔編號C12N15/87GK102127519SQ201010597680
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者喬瑋, 孫珊珊, 岳湘安, 張忠智, 張立娟, 羅一菁 申請人:中國石油大學(xué)(北京)