專利名稱：大生物分子流通純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明至少部分涉及新的及改良的用于使樣品中大生物分子如例如包囊的病毒、病毒樣顆粒以及結(jié)合疫苗(conjugate vaccine)與一或多種污染物分離的流通 (flow-through)純化方法。
背景技術(shù)：
在大生物分子如例如包囊的病毒、感染的宿主細(xì)胞或卵中的病毒樣顆?；蛘呓Y(jié)合疫苗產(chǎn)生后，希望將所述生物分子與感染的宿主細(xì)胞或者卵的其它成分例如DNA、RNA及宿主細(xì)胞蛋白分離以獲得所述生物分子的基本純的群體。此外，所產(chǎn)生的生物分子需要與通常用于促進(jìn)該生物分子產(chǎn)生的一些添加劑分離，因?yàn)樗鎏砑觿┏Ｄ芘c該生物分子共純化。常規(guī)地，許多技術(shù)如超速離心、層析和膜過濾已經(jīng)用于純化濃縮大生物分子如包囊的病毒和病毒樣顆粒(見例如PCT公開W02008/073490和W02004/112707)。用于純化這種生物分子的各種類型的層析技術(shù)包括例如大小排阻層析(SEC)、陰離子交換層析(AEX) 和親和層析(見例如 W02004/112707 ;Transfiguracuin et al.，J Virol Methods 142 21-28(2007)和 Kalbfuss et al. Biotech. Bioeng. 96 :932-944 (2007))。雖然前述技術(shù)在一定程度上用于純化大分子如包囊的病毒和病毒樣顆粒，但是所有這些層析技術(shù)一般以結(jié)合和洗脫模式使用。特別地，由于這種生物分子的大尺寸(例如 15-400nM)，其不能穿透大多數(shù)可商購(gòu)的介質(zhì)的孔，且因此其通常與該介質(zhì)的外部結(jié)合并隨后被洗脫。然而，污染物和雜質(zhì)一般結(jié)合至顆粒的內(nèi)表面，但有時(shí)部分地與所述大生物分子一起洗脫。此外，一或多種這些技術(shù)有時(shí)以非連續(xù)模式使用，然而總產(chǎn)量一般較差。發(fā)明概述本發(fā)明至少部分提供了改良的用于使樣品中大生物分子如例如包囊的病毒、病毒樣顆粒及結(jié)合疫苗與一或多種污染物分離的流通方法。本發(fā)明利用一或多種層析技術(shù)以流通模式純化大生物分子如包囊的病毒、病毒樣顆粒、結(jié)合疫苗以及細(xì)菌細(xì)胞表面多糖，所述層析技術(shù)包括例如陰離子交換層析(AEX)、陽離子交換層析(CEX)及疏水性相互作用層析 (HIC)。本發(fā)明的方法通常使用單一連續(xù)流通方法致使大生物分子如病毒、病毒樣顆?；蛘呓Y(jié)合疫苗的回收改良，這種方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于本領(lǐng)域目前常用的一般為結(jié)合和洗脫模式且非連續(xù)的常規(guī)方法。本發(fā)明的方法至少部分基于使用至少一種類型的層析顆粒(例如固體多孔珠)，其每單位體積外表面積被最小化而相對(duì)于通常用于層析方法中而其每單位體積外表面積未被最小化的相似層析顆粒，其每單位體積內(nèi)表面積未降低25%以上。一般而言，本發(fā)明至少部分依賴于反向模式操作，即通過以流通模式使用一或多種AEX、CEX和HIC層析介質(zhì)，其中至少一種這樣的介質(zhì)包含致使回收改良的特性，例如最小化的每單位體積外表面積以及未降低25%以上的每單位體積內(nèi)表面積。本發(fā)明的方法使得可以在單一步驟中回收大生物分子以及提供了與需要許多純化前和純化后步驟的常規(guī)層析方法相比最少的進(jìn)料(feed)和產(chǎn)物流的上游和下游處理。 此外，本發(fā)明的方法在含有大生物分子的樣品中存在和不存在宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的情況下均導(dǎo)致所述大生物分子回收的改良。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于從包含大生物分子和一或多種污染物的樣品中對(duì)所述大生物分子的回收進(jìn)行改良的流通方法。這種方法包括使樣品與具有小于所回收的大生物分子的分子量截?cái)嘀档囊换蚨喾N固體多孔顆粒群接觸，其中所述流通方法中使用的至少一種固體多孔顆粒群的每單位體積外表面積是最小化的并且其中每單位體積內(nèi)表面積相對(duì)于不包含最小化的每單位體積外表面積的固體多孔顆粒群未降低25%以上，從而改良所述大生物分子的回收。在一些實(shí)施方案中，將所述一或多種固體多孔顆粒群填充在層析柱中。與不使用包含最小化的每單位體積外表面積以及每單位體積內(nèi)表面積未降低 25%以上的至少一種固體多孔顆粒群的流通方法的大生物分子的回收相比，本發(fā)明的流通方法導(dǎo)致大生物分子的回收改良例如至少10 %、或至少20 %、或至少30 %、或至少40 %、或至少50 %、或至少60 %、或至少70 %、或至少80 %、或至少90 %。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的流通方法導(dǎo)致大生物分子的純度改良至少20%。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的流通方法導(dǎo)致一或多種污染物減少至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%或更多。在一些實(shí)施方案中，所述一或多種固體多孔顆粒群選自用于陰離子交換層析、陽離子交換層析和疏水性相互作用層析的一或多種珠。可以使用本發(fā)明的方法回收的大生物分子選自由包囊的病毒、病毒樣顆粒和結(jié)合疫苗組成的組。在一些實(shí)施方案中，所述一或多種污染物選自由核酸、蛋白質(zhì)、賦形劑和細(xì)胞培養(yǎng)添加劑組成的組。在一些實(shí)施方案中，所述一或多種污染物是宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的流通方法用于將病毒樣顆粒與一或多種污染物分離。示例的病毒樣顆粒包括但不限于BSA包被的苯乙烯顆粒。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的流通方法用于將包囊的病毒與一或多種污染物分離。示例的包囊的病毒包括但不限于流感病毒(例如Hmi株)、腺病毒和噬菌體。在一些實(shí)施方案中，所述大生物分子在細(xì)胞培養(yǎng)物或者卵中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含MDCK細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，包含大生物分子和一或多種污染物的樣品是細(xì)胞培養(yǎng)上清，對(duì)其進(jìn)行本發(fā)明的流通方法。在本發(fā)明的流通方法的各種實(shí)施方案中，所述方法中包括的至少一種固體多孔顆粒群包含在200 μ m-600 μ m范圍的平均直徑。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的流通方法使得能夠從樣品中回收至少50 %、或至少 55 %、或至少60 %、或至少65 %、或至少70 %、或至少75 %、或至少80 %、或至少85 %、或至少90%的大生物分子。附圖簡(jiǎn)述
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圖1是對(duì)通過0. 5ml柱的Wii6與BSA的溶液混合物中的噬菌體Wii6的流通效價(jià)進(jìn)行測(cè)量的示例性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖，所述柱含有如下之一 S4FF(對(duì)照)珠、QS4FF(90ym)珠、 或QSBBQOOym)珠。X軸表示經(jīng)過每個(gè)柱處理的進(jìn)料的柱體積而Y軸表示每個(gè)柱的流通液中的Wii6效價(jià)。圖2是對(duì)通過Iml柱的含有B型流感病毒、宿主細(xì)胞DNA、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、胎牛血清及其它細(xì)胞培養(yǎng)添加劑的溶液混合物中B型流感病毒的流通效價(jià)進(jìn)行測(cè)量的示例性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖，所述柱含有如下之一Qkpharose HP (30 μ m)珠、Qkpharose 4FF(90ym) 珠、或QS印harose BB (200 μ m)珠。X軸表示經(jīng)過每個(gè)柱處理的進(jìn)料的柱體積而Y軸表示每個(gè)柱的流通液中的B型流感病毒效價(jià)。圖3是對(duì)通過0. 8ml柱的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)與DNA的混合物中A型流感病毒的臨界點(diǎn)(breakthrough)進(jìn)行測(cè)量的示例性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖，所述柱含有如下之一 S4FF(對(duì)照) 珠、QS4FF(90 μ m)珠、或QSBB (200 μ m)珠。X軸表示經(jīng)過每個(gè)柱處理的進(jìn)料的體積而Y軸表示每個(gè)柱的流通液中的A型流感病毒效價(jià)。圖4是對(duì)通過0. 8ml柱的A型流感病毒與DNA的溶液混合物中宿主細(xì)胞蛋白質(zhì) (HCP)的臨界點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量的示例性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖，所述柱含有如下之一S4FF(對(duì)照)珠、 QS4FF(90ym)珠、或QSBB QOO μ m)珠。X軸表示經(jīng)過每個(gè)柱處理的進(jìn)料的體積而Y軸表示每個(gè)柱的流通液中的HCP效價(jià)。圖5是對(duì)通過柱的HCP與宿主細(xì)胞DNA的溶液混合物中A型流感病毒的臨界點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量的示例性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖，所述柱含有如下之一 0. 8ml的QS4FF(90ym)珠；0. 8ml 的 QSBB (200 μ m)珠；連續(xù)的 0. 8ml 的 QSBB 和 0. 8ml 的 SP Sepharose 大珠(200 μ m) (AC)； 連續(xù)的 0. 8ml 的 QSBB 和 0. 8ml 的 Phenyl Sepharose 大珠(200 μ m) (AH)；連續(xù)的 0. 8ml 的 QSBB、0. 8ml 的 SP Sepharose 大珠和 0. 8ml 的 Phenyl Sepharose 大珠(ACH)；或者 2. 4ml 的QSBB、SP S印harose大珠和Phenyl S印harose大珠的混合物(MACH)。X軸表示經(jīng)過每個(gè)柱處理的進(jìn)料的體積而Y軸表示每個(gè)柱的流通液中的B型流感病毒效價(jià)。圖6是對(duì)通過柱的A型流感病毒與宿主細(xì)胞DNA的溶液混合物中HCP的臨界點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量的示例性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖，所述柱含有如下之一 0. 8ml的QS4FF(90ym)珠；0. 8ml 的 QSBB (200 μ m)珠；連續(xù)的 0. 8ml 的 QSBB 和 0. 8ml 的 SP Sepharose 大珠(200 μ m) (AC)； 連續(xù)的 0. 8ml 的 QSBB 和 0. 8ml 的 Phenyl Sepharose 大珠(200 μ m) (AH)；連續(xù)的 0. 8ml 的 QSBB、0. 8ml 的 SP Sepharose 大珠和 0. 8ml 的 Phenyl Sepharose 大珠(ACH)；或者 2. 4ml 的QSBB、SP S印harose大珠和Phenyl S印harose大珠的混合物(MACH)。X軸表示經(jīng)過每個(gè)柱處理的進(jìn)料的體積而Y軸表示每個(gè)柱的流通液中HCP的效價(jià)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了改良的將樣品中大生物分子(例如包囊的病毒、病毒樣顆?；蛘呓Y(jié)合疫苗)與一或多種污染物分離的流通方法，其使用至少一種類型的層析珠，該層析珠包含最小化的每單位體積外表面積且相對(duì)于相似類型的層析珠每單位體積內(nèi)表面積未降低 25%以上，所述相似類型的層析珠不包含最小化的每單位體積外表面積且每單位體積內(nèi)表面積未降低。I.定義為了使本公開更易于理解，首先定義某些術(shù)語。另外的定義在詳細(xì)描述中闡述。
術(shù)語“流通方法”、“流通模式”和“流通層析”在本文可互換使用，是指產(chǎn)物分離技術(shù)，其中與一或多種污染物一起包含于樣品中的至少一種產(chǎn)物(例如大生物分子如本文描述的那些)流經(jīng)層析樹脂或者介質(zhì)，而至少一種潛在的污染物或者雜質(zhì)結(jié)合所述層析樹脂或者介質(zhì)。所述“流通模式”通常是無梯度操作(即期間移動(dòng)相的組成成分不變的層析方法)。這種流通層析方法可以使用單一柱、連續(xù)或者平行的多個(gè)柱、串聯(lián)柱、模擬移動(dòng)床 (SMB)及其組合來進(jìn)行操作。術(shù)語“結(jié)合及洗脫模式”及“結(jié)合及洗脫方法”在本文可互換使用，是指產(chǎn)物分離技術(shù)，其中樣品中包含的至少一種產(chǎn)物(例如大生物分子，如本文描述的那些)結(jié)合層析樹脂或者介質(zhì)并隨后被洗脫。術(shù)語“污染物”、“雜質(zhì)”和“碎片”在本文可互換使用，是指任何異種或者不適宜的分子，包括生物大分子如DNA、RNA，一或多種宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，內(nèi)毒素，脂質(zhì)及一或多種添加劑，其可存在于含有感興趣的大生物分子的樣品中，所述感興趣的大生物分子使用本發(fā)明的流通方法與一或多種異種或者不適宜的分子分離。此外，這種污染物可包括可在分離方法之前進(jìn)行的步驟中使用的任何試劑。通常，含有所述大生物分子的樣品中存在的污染物的大小小于所述大生物分子。例如，大多數(shù)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的范圍在大約3KD到150KD，其小于使用本文所述方法分離的大多數(shù)大生物分子的大小。如本文所用，術(shù)語“大生物分子”是指感興趣的生物材料，其具有的平均直徑為至少15nm，或者至少20nm，或者至少25nm，或者至少30nm，或者至少35nm，或者至少40nm， 或者至少45nm,或者至少50nm,或者至少55nm,或者至少60nm,或者至少65nm,或者至少 70nm,或者至少75nm，或者至少80nm，或者至少90nm，或者至少lOOnm，或者至少1 IOnm,或者至少120nm，或者至少130nm，或者至少140nm，或者至少150nm，或者至少160nm，或者至少 170nm,或者至少180nm，或者至少190nm，或者至少200nm，或者至少210nm，或者至少220nm， 或者至少230nm，或者至少M(fèi)Onm，或者至少250nm，或者至少沈0歷，或者至少270nm，或者至少觀0歷，或者至少四0歷，或者至少300nm，或者至少310nm，或者至少320nm，或者至少 330nm,或者至少340nm，或者至少350nm，或者至少360nm，或者至少370nm，或者至少380nm， 或者至少390nm，或者至少400nm，使用本文所述的流通方法將其與含有所述生物材料的樣品中存在的一或多種污染物分離。示例性的大生物分子包括例如包囊的病毒、病毒樣顆粒及結(jié)合疫苗。在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的方法分離的大生物分子從層析珠的孔中排出或者僅結(jié)合至珠的外表面。如本文所用，術(shù)語“包囊的病毒”是指包括殼體內(nèi)核酸分子(例如DNA或者RNA)且通常僅結(jié)合至層析珠外表面的任何病毒。在一些實(shí)施方案中，所述殼體在殼體周圍有脂質(zhì)包膜。在一些實(shí)施方案中，包囊的病毒包括封閉在復(fù)雜膜結(jié)構(gòu)內(nèi)的RNA或者DNA分子(例如來自痘病毒科的天花病毒)。通常，大多數(shù)包膜的病毒具有15-400nm的大小范圍。如本文所用，術(shù)語“病毒樣顆?！笔侵钙浯笮『?或免疫原性類似于病毒但缺乏如病毒那樣復(fù)制能力的顆粒或者物質(zhì)(例如人乳頭瘤病毒(HPV)疫苗)。如本文所用，術(shù)語“結(jié)合疫苗”是指通過將細(xì)菌細(xì)胞表面多糖與蛋白質(zhì)或者毒素反應(yīng)產(chǎn)生的疫苗。示例性的結(jié)合疫苗包括但不限于肺炎球菌(Pneumococcal)疫苗和肺炎鏈球菌(Streptococcal pneumoniase)疫苗。如本文所用，術(shù)語“層析”是指將感興趣的大生物分子(例如包囊的病毒，病毒樣顆?；蛘呓Y(jié)合疫苗)與樣品中與所述感興趣的大生物分子一起存在的一或多種污染物分離的任何種類的技術(shù)。如本文所用，術(shù)語“陰離子交換層析”或者“ACE”是指使用帶正電的珠將感興趣的生物分子(例如大生物分子如包囊的病毒、病毒樣顆?；蛘呓Y(jié)合疫苗)與樣品中的一或多種污染物分離的層析方法。示例性的可商購(gòu)的AEC介質(zhì)包括購(gòu)自GE Healthcare的 Q SepharoseFF、Q Sepharose XL、CaptoQ、Q Sepharose HP;購(gòu)自 EMD Chemicals Inc 的 Fractogel EMD TMAE^Fractogel EMD DEAE 以及購(gòu)自 TOSH Bioscience 的 Toyopearl DEAE> Toyopearl QAE 禾口 Toyopearl SuperQ0AEC已常規(guī)用于使用珠、膜和塊體(monolith)的病毒純化。AEC通?；谶@樣的原理，即包囊的病毒如例如流感病毒和腺病毒在大于5.5的pH是帶負(fù)電的。因此，在高于 5. 5的pH下，其可以使用帶正電的樹脂通過離子相互作用結(jié)合及洗脫。通常，由于大多數(shù)包囊的病毒的大小，其不能透過大多數(shù)可商購(gòu)的AEC介質(zhì)且僅可以結(jié)合至介質(zhì)的外表面，從而限制層析柱的病毒容量。因此，克服柱容量問題的一般方法是降低AEC介質(zhì)的大小(見例如 PCT 出版物 W02004112707)。如本文所用，術(shù)語“陽離子交換層析”或者“CEC”是指層析方法，其使用帶負(fù)電的珠將感興趣的生物分子(例如大生物分子如包囊的病毒、病毒樣顆?；蛘呓Y(jié)合疫苗)與樣品中的一或多種污染物分離。示例性的可商購(gòu)CEC介質(zhì)包括得自GE Healthcare的SP Sepharose> SP Sepharose HP，得自 EMD Chemicals Inc 的 Fractogel EMD SO” 以及得自 TOSH Bioscience 的 Toyopearl SP 禾口 Toyopearl CM0如本文所用，術(shù)語“疏水性相互作用層析”或者“HIC”是指層析方法，其使用固定有芳香族或者脂肪族碳?xì)浠衔镒鳛槭杷曰鶊F(tuán)的珠來分離感興趣的生物分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，HIC用于將大生物分子如例如結(jié)合疫苗與樣品中的一或多種污染物分離。示例性的可商購(gòu)的HIC介質(zhì)包括得自GE Healthcare的Phenyl S印harose，得自EMD Chemicals Inc^FractogelEMD Propyl 650、Fractogel EMD Phenyl 650,g TOSH Bioscience 白勺 Toyoperal Phenyls Toyopearl Butyl> Toyopearl Hexyl 禾口 Toyopearl Ether。如本文所用，術(shù)語“大小排阻層析”或者“SEC”是指層析方法，其基于這樣的原理，即當(dāng)含有不同大小溶質(zhì)的溶液經(jīng)過具有適當(dāng)孔大小的多孔介質(zhì)時(shí)，較小的溶質(zhì)花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間在介質(zhì)中擴(kuò)散并因此具有較長(zhǎng)的保留時(shí)間，而較大的溶質(zhì)迅速擴(kuò)散，從而使得可以將其與所述較小溶質(zhì)分離。示例性的可商購(gòu)的SEC介質(zhì)包括Toyopearl HW, Sepharose, Sephacryl 禾口 Fractogel EMD BioSEC0由于大多數(shù)病毒的大小，其不能透過大多數(shù)可商購(gòu)的SEC介質(zhì)并通常在SEC層析柱的空隙體積中洗脫。然而，SEC—般有一些缺點(diǎn)，例如通常SEC層析需要長(zhǎng)的柱長(zhǎng)度，最大荷載容量不可超過20%，處理時(shí)間非常長(zhǎng)且經(jīng)常導(dǎo)致感興趣產(chǎn)物的稀釋。術(shù)語“混合模式層析”或者“雙模(bimodal)層析”或者“多模(multimodal)層析”在本文可互換使用，是指使用在單一珠上具有一個(gè)以上官能團(tuán)和/或不同官能團(tuán)組合的珠的層析方法。這種珠可以稱作為混合模式樹脂或珠、雙模樹脂或珠或者多膜樹脂或珠。 例如，單一珠可在同一珠上具有帶正電的基團(tuán)和帶負(fù)電的基團(tuán)或者具有帶正電的基團(tuán)和疏水性基團(tuán)或者具有帶負(fù)電的基團(tuán)和疏水性基團(tuán)或者具有帶正電的基團(tuán)、帶負(fù)電的基團(tuán)和疏水性基團(tuán)的每一個(gè)。這種珠可用于使感興趣的生物分子與樣品中的一或多種雜質(zhì)分離。示例性的可商購(gòu)的混合模式介質(zhì)包括例如得自GE healthcare的Captoadhere，得自I^all Corporation 的 HPA 和 PPA HyperCel 。如本文所用，術(shù)語層析介質(zhì)的“動(dòng)態(tài)結(jié)合容量”是指在未結(jié)合的生物分子的顯著臨界點(diǎn)發(fā)生之前在流通方法中所述介質(zhì)結(jié)合的靶生物分子的量。層析介質(zhì)的動(dòng)態(tài)容量反映隨著流速增加可發(fā)生的傳質(zhì)限制(mass transfer limitations)的影響且其可用于預(yù)測(cè)與介質(zhì)的飽和或者靜態(tài)結(jié)合容量確定相比的實(shí)時(shí)進(jìn)程情況。一般，介質(zhì)的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量低于靜態(tài)結(jié)合容量。如本文可互換使用的術(shù)語層析介質(zhì)的“靜態(tài)結(jié)合容量”和“飽和結(jié)合容量”是指如果珠上每一可用結(jié)合位點(diǎn)均被利用時(shí)，介質(zhì)(例如填充在柱中的珠)在靜態(tài)平衡條件下可結(jié)合的靶生物分子的量。靜態(tài)結(jié)合容量可以通過例如以非常慢的流速或者在柱中珠的密閉系統(tǒng)中延長(zhǎng)時(shí)間溫育之后加載大量過量的靶生物分子而確定。實(shí)際上，靜態(tài)結(jié)合容量在使用填充柱的處理?xiàng)l件下是從不可得的。如本文所用，術(shù)語“每單位體積外表面積”是指可用于結(jié)合感興趣的生物分子的層析顆粒群(例如珠)的外表面的總面積。例如，在一些實(shí)施方案中，每單位體積外表面積定義為填充在柱中的固體多孔顆粒群可用于結(jié)合大生物分子的外表面的總面積。評(píng)估珠的每單位體積外表面積可以通過數(shù)學(xué)或者經(jīng)驗(yàn)計(jì)算。例如，從數(shù)學(xué)上，可以使用如下等式估計(jì)每單位體積外表面積4^= (等式 I)
α其中，Aes7v =每單位體積外表面積；d =使用的珠的直徑；而η =柱的填充密度。 對(duì)于充分填充的柱，假設(shè)珠是六方密填充(HCP)，其等于0. 74。此外，η =1-空隙體積。柱的空隙體積可以使用與珠不相互作用且從珠的孔排出的分子實(shí)驗(yàn)確定(見例如 Gel filtration-Principles and Methods, Amersham Biosciences)。經(jīng)驗(yàn)上，如下所述估計(jì)每單位體積外表面積。通常，使用與所述大生物分子相同大小和電荷的球形納米粒子進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)計(jì)算。所獲得的納米粒子的濃度通常由廠商指定或者可以通過使用用于確定病毒顆粒的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如動(dòng)態(tài)光散射或者UV-Vis 光譜學(xué)(見例如Wolfgang Haiss et al. ,Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra，2007，79，4215-4221)。所述納米粒子與固定體積的珠的結(jié)合通過使用例如本文所述的靜態(tài)結(jié)合容量實(shí)驗(yàn)來研究。與珠結(jié)合的納米粒子的量可以使用如下公式估算Nn= (Cin-Cf) ν (等式 II)其中，Ns =飽和時(shí)與珠結(jié)合的納米粒子的量；Cin =測(cè)量為單位體積顆粒的溶液中納米粒子的初始濃度；Cf =測(cè)量為單位體積顆粒的溶液中納米粒子的終濃度；ν =使用的溶液的體積。含有納米粒子的柱的每單位體積外表面積可以如下確定J =AT xix丄(等式 III)
es/v4 V其中，dn =納米粒子的直徑；而V =柱體積。
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如本文所用，術(shù)語層析顆粒(例如珠)群的“每單位體積內(nèi)表面積”可以定義為顆粒的每單位體積總表面積減去顆粒的每單位體積外表面積并可以如下估算
權(quán)利要求
1.一種改良從包含大生物分子及一或多種污染物的樣品中回收所述大生物分子的流通方法，所述方法包括使所述樣品與一或多種固體多孔顆粒群接觸，所述顆粒具有小于待回收大生物分子的分子量截?cái)嘀?，其中所述流通方法中使用的至少一種固體多孔顆粒群包含最小化的固體多孔顆粒群每單位體積外表面積以及相對(duì)于不具有最小化的每單位體積外表面積的固體多孔顆粒群，其固體多孔顆粒群的每單位體積內(nèi)表面積未降低25%以上， 從而改良所述大生物分子的回收。
2.權(quán)利要求1的流通方法，其中將所述一或多種固體多孔顆粒群填充在層析柱中。
3.權(quán)利要求1的流通方法，其中與未使用包含最小化的顆粒群的每單位體積外表面積且顆粒群的每單位體積內(nèi)表面積未降低的至少一種固體多孔顆粒群的流通方法的大生物分子的回收相比，所述大生物分子的回收改良至少10%、或者至少20%、或者至少30%、 或者至少40%、或者至少50%、或者至少60%、或者至少70%、或者至少80%、或者至少 90%。
4.權(quán)利要求3的流通方法，其中所述改良的回收包括大生物分子的純度改良至少 10%。
5.權(quán)利要求3的流通方法，其中所述改良的回收包括一或多種污染物減少至少10%、 或者至少20%、或者至少30%、或者至少40%或者更多。
6.權(quán)利要求1的流通方法，其中所述一或多種固體多孔顆粒群選自用于陰離子交換層析、陽離子交換層析和疏水性相互作用層析的一或多種珠。
7.權(quán)利要求1的流通方法，其中所述一或多種固體多孔顆粒群包含混合模式層析珠。
8.權(quán)利要求1的流通方法，其中所述大生物分子選自由包囊的病毒、病毒樣顆粒以及結(jié)合疫苗所組成的組。
9.權(quán)利要求1的流通方法，其中所述一或多種污染物選自由核酸、蛋白質(zhì)、賦形劑和細(xì)胞培養(yǎng)添加劑所組成的組。
10.權(quán)利要求8的流通方法，其中所述蛋白質(zhì)是宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。
11.權(quán)利要求7的流通方法，其中所述病毒樣顆粒是用BSA包被的苯乙烯顆粒。
12.權(quán)利要求7的流通方法，其中所述包囊的病毒是流感病毒。
13.權(quán)利要求7的流通方法，其中所述包囊的病毒是腺病毒。
14.權(quán)利要求7的流通方法，其中所述包囊的病毒是噬菌體。
15.權(quán)利要求11的流通方法，其中所述流感病毒是Hmi病毒。
16.權(quán)利要求1的流通方法，其中所述大生物分子在細(xì)胞培養(yǎng)物或者在卵中產(chǎn)生。
17.權(quán)利要求1的流通方法，其中所述樣品是細(xì)胞培養(yǎng)上清。
18.權(quán)利要求15的流通方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含MDCK細(xì)胞。
19.權(quán)利要求1的流通方法，其中所述至少一種固體多孔顆粒群具有的平均直徑在 200ym-600ym^;g。
20.權(quán)利要求1的流通方法，其中所述方法使得可以回收樣品中至少50%、或者至少 55 %、或者至少60 %、或者至少65 %、或者至少70 %、或者至少75 %、或者至少80 %、或者至少85%、或者至少90%的所述大生物分子。
全文摘要
本發(fā)明至少部分涉及新的和改良的用于將樣品中的大生物分子如包囊的病毒、病毒樣顆粒以及結(jié)合疫苗與一或多種污染物分離的流通純化方法，其中所述方法利用至少一種固體多孔顆粒群，該顆粒群包含最小化的顆粒每單位體積外表面積以及相對(duì)于不具有最小化外表面積的相似顆粒群未降低25％以上的每單位體積內(nèi)表面積。
文檔編號(hào)C12N7/02GK102154228SQ20101059777
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者G·耶爾, K-S·鄭, S·拉馬斯瓦米 申請(qǐng)人:米利波爾公司