專利名稱：徑向色譜柱用金屬螯合親和膜色譜介質(zhì)的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種以短棉纖維為基質(zhì)，通過某種活性高分子聚合物與纖維接枝后，再引入可螯合過渡金屬離子的配體---亞氨二乙酸，制成適于生物大分子分離純化用的金屬螯合膜色譜介質(zhì)的方法。
生物工程和基因工程的迅速發(fā)展為社會(huì)提供了越來越多的生物產(chǎn)品，然而只有經(jīng)過分離純化并達(dá)到一定純度的生物產(chǎn)品才能為人們所利用，特別是用于臨床的生化藥品。以軟凝膠為基質(zhì)的經(jīng)典的生物大分子分離純化技術(shù)由于流速慢、壓降大、分離時(shí)間長(zhǎng)、大規(guī)模處理時(shí)不易放大等缺點(diǎn)，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)當(dāng)今發(fā)展的需要。80年代中期推出了徑向膜色譜技術(shù)，它是將膜色譜技術(shù)與色譜分離原理結(jié)合起來，采用徑向流動(dòng)技術(shù)，克服了傳統(tǒng)色譜技術(shù)的缺點(diǎn)，可以在較小床層高度時(shí)，獲得較大的處理量，還可以達(dá)到較大流速，另外，它可以進(jìn)行線性放大，即在保持柱徑不變而只增加柱長(zhǎng)時(shí)，可按比例增加樣品的處理量，因此，徑向膜色譜技術(shù)是一種較理想的生物工程大規(guī)模分離提純的有效工具。
親和色譜技術(shù)是分離純化生物大分子的重要手段，其特點(diǎn)是選擇性好、純化倍數(shù)高。以過渡金屬離子為通用性配體的金屬螯合親和色譜以其制造成本低、通用性好、純化倍數(shù)較高而被廣泛用于生物產(chǎn)品的分離純化。把親和色譜技術(shù)與上述徑向膜色譜技術(shù)結(jié)合起來將會(huì)形成一種新型的分離技術(shù)，我們稱之為徑向親和膜色譜技術(shù)，它兼有徑向膜色譜技術(shù)流速快、處理量大、易線性放大和親和色譜技術(shù)高選擇性的優(yōu)點(diǎn)。是一種非常有潛力的分離技術(shù)。纖維素的非特異性吸附較小，有合適的孔徑結(jié)構(gòu)，它可以通過酯化、醚化、氧化等方法，把活性基團(tuán)或親和配基引入纖維素骨架上而制成纖維素親和介質(zhì)，但這幾種方法只能在不破壞纖維素結(jié)構(gòu)的情況下得到很有限的結(jié)合容量，使得相應(yīng)的柱子的柱容量很小，給這類介質(zhì)在徑向色譜柱中的應(yīng)用帶來困難。
本發(fā)明的目的是提供一種適于生物大分子的選擇性分離純化采用的徑向色譜柱填料一金屬螯合型親和介質(zhì)的合成方法，該合成方法利用的原料便宜易得、反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，易控制。
本發(fā)明的徑向色譜柱用金屬螯合色譜介質(zhì)的合成方法，是采用以甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯或丙烯酸環(huán)氧丙酯進(jìn)行自聚反應(yīng)得到聚合物，再與纖維素進(jìn)行接枝反應(yīng)，然后加入亞氨二乙酸作為螯合配基進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)，最后加入金屬離子溶液進(jìn)行反應(yīng)的過程，自聚和接枝反應(yīng)在水介質(zhì)中進(jìn)行，反應(yīng)溫度為50～90℃。并在上述反應(yīng)中加入引發(fā)劑，例如偶氮二異丁腈，正丁基鋰或過硫酸銨與硫代硫酸鈉，引發(fā)劑加入量為聚合單體重量的1～5％。此外，上述反應(yīng)中螯合配基亞氨二乙酸酸開環(huán)反應(yīng)控制在pH為8～13，反應(yīng)溫度為40～80℃，并可通過加入無機(jī)鹽，例如氯化鈉或硫酸鈉作為開環(huán)反應(yīng)促進(jìn)劑來提高開環(huán)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，以提高所合成的螯合介質(zhì)上的配基濃度。開環(huán)反應(yīng)的母液可循環(huán)套用。上述反應(yīng)過程中的其它過程，勻可參照公知的技術(shù)進(jìn)行。具體地說，本發(fā)明的合成方法按下步驟進(jìn)行1.甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯或丙烯酸環(huán)氧丙酯進(jìn)行自聚反應(yīng)合成聚合物；2.纖維素與聚合物進(jìn)行接枝反應(yīng)3.加入螯合試劑進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)；4.加入過渡金屬離子(如Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ni2+等)溶液進(jìn)行螯合反應(yīng)。
在上述1，2反應(yīng)中，控制反應(yīng)溫度為50～90℃，自聚反應(yīng)時(shí)間0.5～2小時(shí)，接枝反應(yīng)時(shí)間為0.5～2.5小時(shí)。反應(yīng)在去離子水中進(jìn)行。在反應(yīng)過程中，為提高聚合產(chǎn)物與纖維素的接枝反應(yīng)產(chǎn)物上的環(huán)氧含量，(甲基)丙烯酸環(huán)氧丙酯的用量應(yīng)當(dāng)過量，反應(yīng)物按(重量)纖維素(甲基)丙烯酸環(huán)氧丙酯＝1∶2～10加入。同時(shí)為加速反應(yīng)，可加入引發(fā)劑以誘發(fā)反應(yīng)，如可采用陰離子聚合反應(yīng)的引發(fā)劑偶氮異丁腈、正丁基鋰或硫代硫酸鈉與過硫酸銨，引發(fā)劑的加入量為聚合單體的1～5％。開環(huán)反應(yīng)溫度控制在40～80℃，反應(yīng)時(shí)間可根據(jù)所需獲得的配基濃度控制在0.5～8小時(shí)。開環(huán)反應(yīng)在弱堿性介質(zhì)中進(jìn)行，pH值控制在8～13。開環(huán)物即螯合配基，如亞氨二乙酸(IDA)的加入量應(yīng)超過聚合接枝后改性纖維素上的環(huán)氧基團(tuán)的量，以1～5∶1為宜。為進(jìn)一步提高連接到改性纖維素上的螯合配基的濃度，可向反應(yīng)混合物中加入適量的無機(jī)鹽，如氯化鈉，硫酸鈉等，無機(jī)鹽的加入重量為纖維素量的1～10％，反應(yīng)后的母液經(jīng)過濾后可循環(huán)套用，以降低成本。下面通過實(shí)例對(duì)本發(fā)明的合成反應(yīng)給予進(jìn)一步的說明。
實(shí)例1.亞氨二乙酸型(IDA)金屬螯合介質(zhì)的制備亞氨二乙酸型金屬螯合介質(zhì)的合成過程按下述化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行
在上述開環(huán)反應(yīng)3中，開環(huán)反應(yīng)物為亞氨二乙酸(IDA)，反應(yīng)中以2mol/1的碳酸鈉溶液控制反應(yīng)混合物的pH＝8～13，反應(yīng)溫度控制在40～80℃，無機(jī)鹽的加入量為反應(yīng)液總體積的1～5％。實(shí)驗(yàn)過程為，在裝有攪拌器，溫度計(jì)及冷凝器的5立升三口燒瓶中加入65克短棉纖維，3000毫升去離子水，攪拌下升溫至80℃，充分?jǐn)嚢杈鶆?，隨后加入300毫升的甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯，攪拌10分鐘后，再加入含過硫酸銨和硫代硫酸鈉各10克的混合溶液作引發(fā)劑，保溫反應(yīng)2小時(shí)，然后降溫至70℃，加入亞氨二乙酸溶液進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)，并用碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的pH＝8～13，保溫反應(yīng)1～8小時(shí)，停止反應(yīng)后，用大量去離子水洗至中性，然后用丙酮或乙醇浸泡，洗去改性纖維素表面的殘余物，再用大量去離子水洗。加入2％(重量/體積)的硫酸銅溶液，攪拌～2小時(shí)，過濾，用大量去離子水洗至無銅離子。真空干燥，所得改性纖維素的接枝率為140％(重量)，用氮元素分析法或原子吸收光譜法測(cè)定金屬螯合介質(zhì)的配基濃度為150μmol/g干介質(zhì)。螯合反應(yīng)4也可以在纖維素介質(zhì)做成膜以后再進(jìn)行。
實(shí)例2金屬螯合介質(zhì)的應(yīng)用將實(shí)例1中所制備的IDA型銅離子螯合介質(zhì)用造紙技術(shù)制成紙狀膜，填充到徑向(或軸向)色譜分離柱中，用含1mol/l氯化鈉的0.05mol/l磷酸鹽緩沖液(pH＝7.0)平衡柱子，對(duì)牛肝過氧化氫酶粗品溶液(1000U/mg蛋白)上樣進(jìn)行分離，用含1mol/l氯化鈉的0.01mol/l咪唑洗脫，純化后的牛肝過氧化氫酶的純度提高了7倍，回收率達(dá)70％。螯合介質(zhì)經(jīng)0.005mol/l EDTA-NaCl再生后，可多次反復(fù)使用，分離性能保持穩(wěn)定。
由上述實(shí)例，采用本發(fā)明提供的合成方法可以方便地制備徑向(或軸向)色合成的螯合介質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)或酶的結(jié)合容量大，易于再生，可反復(fù)多次使用。應(yīng)用該螯合介質(zhì)填充的徑向(或軸向)色譜柱可對(duì)許多表面富有組氨酸、半光氨酸、色氨酸等殘基的蛋白質(zhì)或酶，例如，血清白蛋白，免疫球蛋白、尿激酶、過氧化物酶等進(jìn)行選擇性分離純化，不僅處理量大、流速快、保持活性好，而且選擇性較好，純化倍較高。本發(fā)明為徑向色譜介質(zhì)增添了新的種類，所提供的徑向金屬螯合親和膜色譜介質(zhì)的合成方法是一種很有工業(yè)應(yīng)用前景的生化分離技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種徑向色譜柱用金屬螯合色譜介質(zhì)的合成方法，其特征在于是采用以甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯或丙烯酸環(huán)氧丙酯進(jìn)行自聚反應(yīng)得到聚合物，再與纖維素進(jìn)行接枝反應(yīng)，然后加入亞氨二乙酸作為螯合配基進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)，最后加入金屬離子溶液進(jìn)行反應(yīng)的過程，自聚和接枝反應(yīng)在水介質(zhì)中進(jìn)行，反應(yīng)溫度為50～90℃。
2.按權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于反應(yīng)物甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯或丙烯酸環(huán)氧丙酯的用量應(yīng)當(dāng)過量，反應(yīng)物重量按甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯或丙烯酸環(huán)氧丙酯，纖維素＝2～10∶1比例。
3.按照權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于反應(yīng)中加入引發(fā)劑，偶氮二異丁腈、正丁基鋰或過硫酸銨與硫代硫酸鈉，引發(fā)劑加入量為聚合單體重量的1～5％。
4.按照權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于螯合配基亞氨二乙酸酸開環(huán)反應(yīng)控制在pH為1～13，反應(yīng)溫度為40～80℃。并可通過加入無機(jī)鹽，例如氯化鈉或硫酸鈉作為開環(huán)反應(yīng)促進(jìn)劑來提高開環(huán)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，以提高所合成的螯合介質(zhì)上的配基濃度，開環(huán)反應(yīng)的母液可循環(huán)套用。
5.按照權(quán)利要求4所述的合成方法，其特征在于螯合配基亞氨二乙酸的加入量應(yīng)超過聚合按枝后改性纖維素上的環(huán)氧基的量，其比值為1～5∶1。
6.按照權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于開環(huán)反應(yīng)加入無機(jī)鹽氯化鈉或硫酸鈉作開環(huán)反應(yīng)促進(jìn)劑，其加入重量為纖維素量的1～10‰。
7.按照權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于加入過渡金屬離子Cu2+，Zn2+，F(xiàn)e3+或Ni2+溶液進(jìn)行螯合反應(yīng)。
全文摘要
徑向色譜柱用金屬螯合親和膜色譜介質(zhì)的合成方法是利用甲基丙燃酸環(huán)氧丙酯進(jìn)行自聚反應(yīng)制得聚合物后與棉纖維進(jìn)行接枝反應(yīng),然后與亞氨二乙酸進(jìn)行開環(huán)反應(yīng),最后過渡金屬離子進(jìn)行螯合反應(yīng)。該方法利用的原料便宜易得,反應(yīng)條件簡(jiǎn)單,易控制,制得的螯合介質(zhì)的結(jié)合容量大。應(yīng)用該介質(zhì)填充的徑向色譜柱對(duì)人血清白蛋白、過氧化氫酶、尿激酶等生物大分子進(jìn)行分離純化處理,具有處理量大、流速快、純化倍數(shù)高、便于線性放大等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N30/38GK1188681SQ9710505
公開日1998年7月29日 申請(qǐng)日期1997年1月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月24日
發(fā)明者楊利, 賈凌云, 郭玉夙, 鄒漢法, 張玉奎 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所