專利名稱：：一種以染料為配基的纖維素親和膜的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬纖維素親和膜領(lǐng)域，特別是涉及以染料為配基的纖維素親和膜的制備方法及其應(yīng)用。技術(shù)背景近年來，隨著生命科學(xué)、生物技術(shù)、藥學(xué)以及醫(yī)療技術(shù)的日益發(fā)展，人們對生物大分子的分離、提取和精制的要求也越來越高。親和色譜是實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)中常用的一種生物大分子分離純化技術(shù)。它是根據(jù)生物大分子與特定的固載化配基之間的親和力，即特異性的可逆結(jié)合和解離而使生物大分子得到分離。它具有操作條件溫和、無污染、無相變等特點(diǎn)，膜分離過程設(shè)備簡單、易于放大、成本低、分離速度快、可連續(xù)操作，在許多方面都得到了應(yīng)用。膜基質(zhì)材料在親和膜的制備中具有重要的作用，因?yàn)樗坏珱Q定著所鍵合的間隔臂和配基種類，而且還直接決定著分離的效果。纖維素是自然界中含量最多的天然高分子，也是最早用于親和分離的介質(zhì)之一，由于纖維素分子含有大量的-OH，從而賦予纖維素良好的親水性、生物相容性和可反應(yīng)性，而且纖維素膜價格低廉，用于親和分離時成本低，適合工業(yè)化應(yīng)用。近年來，將纖維素運(yùn)用于生化分離中越來越引起人們的廣泛注意。到目前為止，許多材料(如生物大分子、金屬離子、染料)作為配基被結(jié)合到固體載體上，用于生物大分子的分離純化。活性染料是一種常用的基團(tuán)專一親和配體，用染料做配基進(jìn)行親和色譜不僅克服了生物配體的不穩(wěn)定性、洗脫條件苛刻、成本較高等局限性，而且具有穩(wěn)定性好，價格便宜，易于制備和存儲，應(yīng)用范圍廣，與蛋白質(zhì)的相互作用有很好的專一性等優(yōu)點(diǎn)，又比金屬螯和離子的吸附效率高，只需要一個步驟就可以把目標(biāo)蛋白純化。目前CibacronBlueF3GA，ReactiveRed,ProcionBrownMX5BR等一大批活性染料以用于親和色譜分離。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種以染料為配基的纖維素親和膜的制備方法及其應(yīng)用，該方法快速、簡便、廉價、高效，可高效吸附木瓜蛋白酶，適用于規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明的以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜的制備方法，包括下列步驟(l)活化后的纖維素膜，用熱水洗數(shù)次后，放入到染料CibacronBlueF3GA溶液中反應(yīng)；(2)加入NaCl溶液處理，使染料吸附到纖維素膜上；(3)調(diào)節(jié)水浴溫度，加入Na2C03進(jìn)行固色反應(yīng)；(4)冷卻，依次用熱水、甲醇、NaCl、尿素、雙蒸水充分洗滌后，或保存于Tris-HCl緩沖液，得以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜。所述的纖維素膜是普通纖維素濾紙；所述活化是纖維素膜在60'C5MNaOH中水解，用體積比為5:4環(huán)氧氯丙烷、二甲亞砜進(jìn)行活化；所述染料CibacronBlueF3GA的濃度是10mg/ml;所述的步驟(1)中的反應(yīng)是40-8(TC水浴振蕩反應(yīng)20-45min;所述步驟(2)中的NaCl溶液處理是用20wt。/。的NaCl溶液在40-80'C水浴振蕩處理20-45min;所述步驟(3)中的Na2C03固色反應(yīng)是用25wt。/。Na2C03在60-9(TC水浴振蕩反應(yīng)3-6h;所述步驟(4)中的洗滌是用40。C-50'C熱水、含量為99.5-100%的甲醇、2MNaCl、6M尿素洗滌，洗滌程度是所洗后的洗滌液為無色；所述步驟(5)中的保存是保存于4'C的0.05MpH7-8Tris-HCl緩沖液。本發(fā)明的以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜可應(yīng)用于木瓜蛋白酶的吸附。本發(fā)明的有益效果(1)本發(fā)明的方法操作簡單，耗時較少，吸附量大；(2)本發(fā)明所使用的原材料廉價易得，本身含有豐富的可反應(yīng)功能基團(tuán)，無需改性處理，省時省力，減少了制備成本；(3)原料來源方便，便于大規(guī)模提取純化。圖1是親和膜和普通濾紙膜對不同濃度木瓜蛋白酶的吸附曲線，A代表親和膜，B代表普通濾紙膜；圖2是反應(yīng)pH的變化對木瓜蛋白酶吸附的影響曲線；圖3是反應(yīng)離子強(qiáng)度的變化對木瓜蛋白酶吸附的影響曲線；圖4是Langmuir吸附等溫式模型。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1取30張纖維素濾紙，用5M的NaOH6(TC水浴振蕩處理30min，用熱水洗數(shù)次后，放入體積比是4:5的二甲亞砜、環(huán)氧氯丙垸混合液中60'C活化4h。用熱水洗數(shù)次后將活化后的膜放入到200ml10mg/ml的CibacronBlueF3GA溶液當(dāng)中60'C水浴振蕩；30min后加入50ml20wt。/。的NaCl溶液6(TC水浴振蕩處理30min，以使染料吸附到纖維素膜上；加入20ml25wtn/。Na2CO3進(jìn)行固色，繼續(xù)反應(yīng)4h后冷卻，依次用4(TC-50'C熱水、含量為99.5-100%的甲醇、2MNaCl、6M尿素、去離子水充分洗滌，直到洗滌液為無色，(C保存于0.05MpH8.0Tris-HCl緩沖液。實(shí)施例2以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜的應(yīng)用，具體步驟如下(1)吸附木瓜蛋白酶濃度的確定稱取6組各0.1g纖維素親和膜，加入的緩沖液和濃度分別為0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0mg/ml的酶液中，25'C水浴振蕩3h，測定吸附前后在280nm處的吸光度；算出吸附量最大的那個木瓜蛋白酶的濃度，用作下面實(shí)驗(yàn)。相同條件下用未經(jīng)任何處理的纖維素膜作平行對比實(shí)驗(yàn)，測出非特異性吸附量，與親和膜吸附量作對比。發(fā)現(xiàn)最適給酶量為2.0mg/ml。圖1是親和膜和普通濾紙膜對不同濃度木瓜蛋白酶的吸附曲線。(2)反應(yīng)pH值的確定稱取6組各0.1g纖維素親和膜，加入的緩沖液和酶液的pH值分別為5.0，6.0，7.0，8.0，8.5，9.0，10.0，進(jìn)行固定吸附。圖2是反應(yīng)pH的變化對木瓜蛋白酶吸附的影響曲線，當(dāng)反應(yīng)體系的pH值為8.5時，吸附量最高。G)反應(yīng)離子強(qiáng)度的確定準(zhǔn)確稱取O.lg制備好的干燥的親和膜，放入用pH8.5的Tris-HCl緩沖液陪配制的一定濃度的木瓜蛋白酶溶液，用不同濃度的NaCl調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度(OM、0.2M、0.5M、l.OM、2.0M)，25'C水浴振蕩3h，測定吸附前后在280nm處的吸光度。圖3是反應(yīng)離子強(qiáng)度的變化對木瓜蛋白酶吸附的影響曲線，發(fā)現(xiàn)親和膜對木瓜蛋白酶的吸附隨離子強(qiáng)度的增加而減小。(4)Langmuir吸附等溫式模型的驗(yàn)證Langmuir吸附模型代表了最簡單的蛋白質(zhì)吸附形式，該模型假設(shè)如下可逆吸附；被吸附分子性能無變化；分子間無吸附；一個吸附位吸附一個分子；所有的吸附位對蛋白質(zhì)有相同的親和性。在這種假設(shè)下，蛋白質(zhì)在固載化配基上的吸附可用式1表達(dá)=(《mCe)/(Kd+Ce)(式1)式3-l可轉(zhuǎn)化為式2:Ce/《eq=Ce7《m+Kd/《m(式2)此處，Ce(mg/ml)是蛋白質(zhì)平衡時的濃度，？eq(mg/g)是平衡吸附量，《m(mg/g)是飽和吸附量，Kd是解離常數(shù)。在4、25、37'C下，考察不同濃度的木瓜蛋白酶在尼龍親和膜上的吸附情況，按照Langmuir模型的表達(dá)式，Langmuir模型參數(shù)見表l，以Ce"eq-Ce作圖，得到圖4。由結(jié)果可推出，在所有溫度下，對Langmuir吸附等溫式模型都基本呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)都接近l，說明溫度的升高對吸附是有利的，這與實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象保持一致。表lLangmuir模型參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1.以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜的制備方法，包括下列步驟(1)活化后的纖維素膜，用熱水洗滌數(shù)次后，放入到染料CibacronBlueF3GA溶液中反應(yīng)；(2)加入NaCl溶液處理，使染料吸附到纖維素膜上；(3)調(diào)節(jié)水浴溫度，加入Na2CO3進(jìn)行固色反應(yīng)；(4)冷卻，依次用熱水、甲醇、NaCl、尿素、雙蒸水充分洗滌后，或保存于Tris-HCl緩沖液，得到以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜的制備方法，其特征在于所述的纖維素膜是普通纖維素濾紙。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜的制備方法，其特征在于所述活化是纖維素膜在60'C5MNaOH中水解，用體積比為5:4環(huán)氧氯丙垸、二甲亞砜進(jìn)行活化。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜的制備方法，其特征在于所述染料CibacronBlueF3GA的濃度是10mg/ml。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜的制備方法，其特征在于所述的步驟(1)中的反應(yīng)是40-6(TC水浴振蕩反應(yīng)20-45min。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的NaCl溶液處理是用20wt。/。的NaCl溶液在40-8(TC水浴振蕩處理20-45min。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的Na2CO3固色反應(yīng)是用25wt。/。Na2CO3在60-90'C水浴振蕩反應(yīng)3-6h。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中的洗漆是用40。C-5(TC熱水、含量為99.5-100%的甲醇、2MNaCl、6M尿素洗滌，洗滌程度是所洗后的洗滌液為無色。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中的保存是保存于4'C的0.05MpH7-8Tris-HCl緩沖液。10.以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜可應(yīng)用于木瓜蛋白酶的吸附。全文摘要本發(fā)明涉及一種以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜的制備方法及其應(yīng)用，制備(1)活化后的纖維素膜，用熱水洗數(shù)次后，放入到染料CibacronBlueF3GA溶液中反應(yīng)；(2)加入NaCl溶液處理，使染料吸附到纖維素膜上；(3)調(diào)節(jié)水浴溫度，加入Na₂CO₃進(jìn)行固色反應(yīng)；(4)冷卻，依次用熱水、甲醇、NaCl、尿素、雙蒸水充分洗滌后，或保存于Tris-HCl緩沖液，得到以染料CibacronBlueF3GA為配基的纖維素親和膜。應(yīng)用該膜可應(yīng)用于木瓜蛋白酶的吸附。該方法快速、簡便、廉價、高效，適用于規(guī)模化生產(chǎn)。文檔編號B01J20/24GK101224410SQ20071004727公開日2008年7月23日申請日期2007年10月19日優(yōu)先權(quán)日2007年10月19日發(fā)明者張海濤,朱利民,聶華麗申請人:東華大學(xué)