專(zhuān)利名稱：一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發(fā)酵方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種硬毛栓孔菌胞外多糖的發(fā)酵方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
硬毛栓孔菌是中藥和食品中用途廣泛的真菌之一，含有十分豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇的特點(diǎn)，還富含有多種維生素和礦質(zhì)元素等成分，如鉀、鈉、鈣、鐵、鋅、鎂、磷等。卷煙中添加一定的香料成分可以改善其吸食品質(zhì)，目前很多天然提取物對(duì)煙草的加香作用引起了人們的重視。從硬毛栓孔菌菌絲體和發(fā)酵液中提取的多糖均具有極強(qiáng)烈的抑制癌細(xì)胞活性，抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)功能，是良好的免疫增強(qiáng)劑，可提高動(dòng)物機(jī)體IgM的量等作用。目前很多天然提取物對(duì)煙草的加香作用引起了人們的重視，真菌多糖作為煙草添加剤，經(jīng)高溫裂解或梅拉德反應(yīng)將會(huì)產(chǎn)生一定的香氣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發(fā)酵方法，將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中達(dá)到加香的效果。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發(fā)酵方法，氮源5. 5飛g/L胰蛋白胨，碳源50 55 g/L麥芽糖，接種量為3 5%，起始pH為5，溫度25 30で，攪拌發(fā)酵轉(zhuǎn)速140 160轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵6 10天。所述的硬毛栓孔菌胞外多糖的發(fā)酵方法優(yōu)選為氮源5. 870 g/L胰蛋白胨，碳源53. 120g/L麥芽糖，接種量為4%，起始pH為5，溫度28°C，攪拌發(fā)酵轉(zhuǎn)速150 r/min,發(fā)酵8天。一種硬毛栓孔菌胞外多糖的應(yīng)用，將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 02、. 1%。一種硬毛栓孔菌胞外多糖的應(yīng)用，將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)優(yōu)選為O. 04、. 6%。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明硬毛栓孔菌胞外多糖得率可達(dá)10. 0982g /し煙絲中硬毛栓孔菌胞外多糖添加量在O. 02% O. 10%內(nèi)變動(dòng)時(shí)，其在卷煙煙氣中的轉(zhuǎn)移率也從
I.58%到3. 39%逐漸增加；硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙中起到到了烘托香氣、増加煙氣濃度風(fēng)格的作用，有助于提高卷煙的品質(zhì)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發(fā)酵方法，氮源6 g/L胰蛋白胨，碳源55 g/L麥芽糖，接種量為5%，起始pH為5，溫度30で，攪拌發(fā)酵轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵10天。將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 1%。、
實(shí)施例2
一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發(fā)酵方法，氮源5. 5 g/L胰蛋白胨，碳源50 g/L麥芽糖，接種量為3%，起始pH為5，溫度25で，攪拌發(fā)酵轉(zhuǎn)速140轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵6天。將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 02%。實(shí)施例3
一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發(fā)酵方法，氮源5. 5飛g/L胰蛋白胨,碳源5(T55 g/L麥芽糖，接種量為3 5%，起始pH為5，溫度25 30で，攪拌發(fā)酵轉(zhuǎn)速14(Tl60轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵6^10天。將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 02、. 1%。實(shí)施例4
一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發(fā)酵方法，氮源5. 870 g/L胰蛋白胨，碳源53. 120g/L麥 芽糖，接種量為4%，起始pH為5，溫度28°C，攪拌發(fā)酵轉(zhuǎn)速150 r/min，發(fā)酵8天。將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)優(yōu)選為
O.04、. 6%。本發(fā)明菌株為硬毛栓孔菌，菌株保藏編號(hào)200800，購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)菌種保藏中心ATCC0單料煙絲云南宣威HClF ;散花成品煙重量O. 83g，煙支吸阻1050Pa，煙支規(guī)格84mmX 24. 5mm,濾嘴長(zhǎng)30 mm ;重蒸酹(> 98%,索來(lái)寶科技有限責(zé)任公司);無(wú)水こ醇(北京化エ廠)、葡萄糖(索來(lái)寶科技有限責(zé)任公司)、氯化鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠)和硫酸(北京化エ廠)等均為分析純。Bruker TENSOR 27紅外光譜儀(FT-IR，德國(guó))；CXG-1電腦恒溫層析柜(上海青浦瀘西儀器廠)；WaterS 2487紫外檢測(cè)器(美國(guó)water公司)；UV1700PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Phenix公司);METTLER 4E200電子分析天平(上海沛歐分析儀器有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；LM5+吸煙機(jī)(德國(guó)Borgwaldt)。I.硬毛栓孔菌發(fā)酵時(shí)間的確定
(I)斜面菌種培養(yǎng)配制改良的PDA固體培養(yǎng)基，改良的PDA固體培養(yǎng)基配方為250g/L 土豆，葡萄糖10g/L，蛋白胨4g/L，瓊脂2%，瓊脂的質(zhì)量為土豆、葡萄糖和蛋白胨總質(zhì)量的2%，分裝試管，滅菌后制備斜面，劃線接種硬毛栓孔菌后，在25 28で的條件下培養(yǎng)3飛天，冷凍保藏，得到硬毛栓孔菌株菌種；
從保存硬毛栓孔菌株菌種的試管中，使用接種鉤在試管斜面取出O. 5平方厘米的一塊，接種到PDA固體平板培養(yǎng)基中，PDA固體平板培養(yǎng)基的配方為葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，2%瓊脂，瓊脂的質(zhì)量為葡萄糖和酵母粉總質(zhì)量的2% ;接種時(shí)要使接種塊上包含盡量少的培養(yǎng)基，ー個(gè)平板接兩塊，放入恒溫培養(yǎng)箱，在25 28 V的條件下培養(yǎng)61天；
使用直徑O. 5cm的打孔器，從PDA固體平板培養(yǎng)基上取下兩片位于菌落邊緣的菌體，接種于液體種子培養(yǎng)基中(250ml三角瓶,50毫升培養(yǎng)液),液體種子培養(yǎng)基的配方為葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L，在25 28°C，140 160 r/min條件下培養(yǎng)3 5天，然后以4%的接種量將種子培養(yǎng)液接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L ；每?jī)商鞙y(cè)定一次菌絲和EPS含量，確定硬毛栓孔菌最佳發(fā)酵時(shí)間。當(dāng)發(fā)酵到第8d時(shí)，發(fā)酵液中胞外多糖含量為2. 50g/L。2.發(fā)酵產(chǎn)硬毛栓孔菌胞外多糖的分離純化
硬毛栓孔菌發(fā)酵結(jié)束后，將50mL的發(fā)酵物通過(guò)真空抽濾法分離菌絲與發(fā)酵液，發(fā)酵液通過(guò)旋蒸儀濃縮至原體積的1/4-1/5,然后加入4倍體積的無(wú)水こ醇，4°C過(guò)夜。10000r/min離心lOmin，得沉淀為粗多糖；稱取O. Ig粗多糖，溶于IOmL蒸餾水，用苯酚硫酸法可測(cè)定計(jì)算發(fā)酵液中多糖含量(g/L)。Sevag法脫蛋白稱取Ig的粗多糖樣品，室溫下加入50mL蒸懼水溶解,加入1/4體積的氯仿一正丁醇(預(yù)先配制成體積比為4 I混合液)溶液，置于具塞容器中，充分振搖30 min后,經(jīng)離心機(jī)1000r/min離心5 min,然后將水相與氯仿相分開(kāi)。將水相再加入相當(dāng)于其體積1/4的氯仿一正丁醇溶液，重復(fù)上述過(guò)程，共計(jì)重復(fù)二次。用硫酸-苯酚法對(duì)胞外多糖進(jìn)行檢測(cè)。純化出的胞外多糖成分用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10mL，透析(透析袋分子量8000-14000Da)除去NaCl，得精制硬毛栓孔菌胞外多糖純品①和多糖純品②，真空冷凍干燥保存。3.硬毛栓孔菌胞外多糖的紅外和核磁分析
取多糖組分①和②各lmg，用溴化鉀(KBr)壓片后進(jìn)行紅外(IR)分析。對(duì)硬毛栓孔菌 胞外多糖組分①和②進(jìn)行紅外光譜監(jiān)測(cè)得紅外光譜圖。從硬毛栓孔菌胞外多糖組分①和②的特征吸收波數(shù)可知，在3412CHT1有ー特征峰，因?yàn)镺-H的伸縮振動(dòng)在3600-3200 cnT1出現(xiàn)ー寬峰，在該糖中應(yīng)存在-OH ;在波數(shù)2929CHT1處有ー特征峰，是C-H鍵的伸縮振動(dòng)，是糖類(lèi)的特征吸收；在I. 73 X IO3 cnT1和I. 25 X IO3 cnT1左右有吸收峰，說(shuō)明有こ?；拇嬖冢欢嗵窃?646 cnT1為C=O非対稱伸縮振動(dòng)，在1646 cnT1和1085 cnT1左右存在吸收峰，說(shuō)明有羧酸存在，為酸性多糖，在796 cm—1處存在吸收峰，為甘露糖結(jié)構(gòu)；910和880 cm—1處有吸收峰，說(shuō)明多糖①和②有α和β糖
苷鍵。由硬毛栓孔菌胞外多糖的1H-NMR可知δ 5. 00及5. 03的共振信號(hào)，即Cl質(zhì)子區(qū)的信號(hào)峰在5. O以上，進(jìn)ー步證明糖苷鍵為α型；中心在δ 3. 78處的重峰表明存在一個(gè)亞甲基CH2，δ 3. 85為CH3-0的質(zhì)子氫信號(hào)，說(shuō)明在硬毛栓孔菌胞外多糖中可能存在著甲氧基的取代。經(jīng)過(guò)紅外光譜與核磁共振光譜分析可知，多糖①可能是ー種具有α-糖苷鍵的部分こ酰化的酸性多糖，多糖②可能是ー種具有β -糖苷鍵的酸性甘露聚糖，并具有甲氧基的取代。4.精制硬毛栓孔菌胞外多糖在煙氣中轉(zhuǎn)移率的測(cè)定
稱取0. Ig精制EPS溶于IOmL蒸餾水中，配成10mg/mL精制EPS儲(chǔ)備液；取不同體積精制胞外多糖儲(chǔ)備液(并加蒸餾水補(bǔ)充到0. 5mL，注射進(jìn)散花成品煙中，使煙支中胞外多糖含量分別達(dá)到煙支質(zhì)量的0. 02%,0. 04%,0. 06%,0. 08%,0. 1%，并做注射0. 5mL蒸餾水的空白對(duì)照，每組10支；放入恒溫恒濕箱(溫度22°C，濕度60%)平衡48 h ;然后用吸煙機(jī)對(duì)煙支進(jìn)行抽吸；將抽吸后的劍橋?yàn)V片放入150mL三角瓶中，加入50mL無(wú)水こ醇超聲lh，倒掉こ醇，然后加入50mL無(wú)水こ醇超聲0. 5h,倒掉こ醇,再加入50mL蒸懼水超聲兩次,姆次Ih,合并濾液，用硫酸-苯酚法測(cè)定多糖含量，計(jì)算其在煙氣中轉(zhuǎn)移率在2. 3% 3. 3%之間變動(dòng)，確定了硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙中使用的可行性。轉(zhuǎn)移率=(實(shí)驗(yàn)組劍橋?yàn)V片上多糖量-対照組劍橋?yàn)V片上多糖量)/多糖添加量。多糖在煙氣中的轉(zhuǎn)移率隨其在多糖中濃度的増加而增カロ，在多糖添加量為0. 02%時(shí)，轉(zhuǎn)移率為I. 58%，在多糖添加量為0. 08%時(shí)，轉(zhuǎn)移率為3. 28%。而多糖添加量超過(guò)0. 08%達(dá)到0. 1%時(shí)，多糖在煙氣中的轉(zhuǎn)移率為3. 39%。5.精制硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙中的感官評(píng)價(jià) 表I硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙的感官評(píng)價(jià)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發(fā)酵方法，其特征在干氮源5. 5飛g/L胰蛋白胨，碳源50 55 g/L麥芽糖，接種量為3 5%，起始pH為5，溫度25 30で，攪拌發(fā)酵轉(zhuǎn)速140 160轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵6 10天。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的硬毛栓孔菌胞外多糖的發(fā)酵方法，其特征在于氮源5.870g/L胰蛋白胨，碳源53. 120g/L麥芽糖，接種量為4%，起始pH為5，溫度28°C，攪拌發(fā)酵轉(zhuǎn)速150 r/min,發(fā)酵 8 天。
3.—種硬毛栓孔菌胞外多糖的應(yīng)用，其特征在于將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 02、. 1%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的硬毛栓孔菌胞外多糖的應(yīng)用，其特征在于將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 04、. 06%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發(fā)酵方法，氮源5.5~6g/L胰蛋白胨，碳源50~55g/L麥芽糖，接種量為3~5%，起始pH為5，溫度25~30℃，攪拌發(fā)酵轉(zhuǎn)速140~160轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵6~10天。本發(fā)明硬毛栓孔菌胞外多糖得率可達(dá)10.0982g／L。煙絲中硬毛栓孔菌胞外多糖添加量在0.02%～0.10%內(nèi)變動(dòng)時(shí)，其在卷煙煙氣中的轉(zhuǎn)移率也從1.58%到3.39%逐漸增加；硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙中起到到了烘托香氣、增加煙氣濃度風(fēng)格的作用，有助于提高卷煙的品質(zhì)。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102690848SQ201210197839
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月15日
發(fā)明者楊琛琛, 毛多斌, 耿盧靖, 許春平 申請(qǐng)人:鄭州輕工業(yè)學(xué)院