一種全細(xì)胞催化制備(s)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種全細(xì)胞催化制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其中以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）為底物，利用生物催化劑在以異丙醇為氫供體的條件下，然后加入CaCl2、重組酮還原酶的大腸桿菌全細(xì)胞，于溫度25℃～40℃下攪拌，在pH為6.0～8.0的水相中不對稱還原反應(yīng)生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯；利用細(xì)胞本身的輔酶再生體系，無需添加外源性的輔酶，解決了傳統(tǒng)生物法中催化效率低以及成本高的問題，該方法反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)效率高、操作簡便，特別是催化反應(yīng)過程不用加還原性輔酶因子，大大提高了效率和降低了反應(yīng)的成本，具有廣闊的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用前景。
【專利說明】一種全細(xì)胞催化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物合成領(lǐng)域，尤其涉及一種全細(xì)胞催化制備（S) -4-氯-3-羥基丁酸 乙酯的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] (S)-4_氯-3-羥基丁酸乙酯（（S)-CHBE)是一種重要的有機合成中間體，可用于 很多活性藥物的合成，如他汀類降血脂藥HMG-CoA還原酶抑制劑類、Slagenins B和C以及 P-1，4-二氫吡啶型鈣離子通道阻斷劑等。他汀類藥物是目前最暢銷的降血脂類藥物，隨著 阿托伐他汀專利的到期，市場對其中間體（S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯的需求量會進一步加 大。
[0003] 以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE)為底物合成（S)-CHBE是非常有效經(jīng)濟的制備途徑， COBE易于合成且價格低廉。目前關(guān)于COBE不對稱手性還原制備（S)-CHBE以進行了很多的 研究報道，概括起來主要有化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)法催化的不對稱還原，所用的催化劑包括 銠、釕等昂貴金屬，最關(guān)鍵的是采用化學(xué)法合成的（S)-CHBE立體選擇性不夠高，催化還原 反應(yīng)需要很高的氫氣壓，耗能高，污染尤其嚴(yán)重，對環(huán)境影響很大。
[0004] 生物法以其所具有的反應(yīng)條件溫和、立體專一性強、轉(zhuǎn)化率高等特點被廣泛 地研究和應(yīng)用。中國發(fā)明專利申請例如申請?zhí)?00810124754. 2、201010213724. 6、 201110225388. 1等公開了數(shù)種酮還原酶生產(chǎn)（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，然 而這些方法的酶和輔因子用量較高，并需要添加葡萄糖作為氫供體。國內(nèi)專利申請?zhí)?201210465009. 0公開了一種異丙醇作為氫供體的催化方法，所用的為酮還原酶凍干粉，酶 凍干粉的生產(chǎn)成本較高，而且在反應(yīng)中也需加入價格昂貴的輔因子，反應(yīng)體系中添加了有 機溶劑，不僅成本較高，不符合綠色化學(xué)催化的理念。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種反應(yīng)步驟簡單、成 本較低、產(chǎn)品光學(xué)純度高、的（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的制備方法。
[0006] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種全細(xì)胞催化制備 (S)-4_氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其中以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，利用生物催化劑 在以異丙醇為氫供體的條件下，在水相中不對稱還原反應(yīng)生成（S)-4_氯-3-羥基丁酸乙 酯，所述不對稱還原反應(yīng)在pH為6. 0?8. 0的水相緩沖液中進行，在反應(yīng)容器中加入配 制好的所述水相緩沖液，然后依次加入底物C0BE、異丙醇、CaCl2、重組酮還原酶的大腸桿菌 全細(xì)胞，于溫度25°C?40°C下攪拌反應(yīng)，利用氣相色譜方法檢測反應(yīng)進程，至轉(zhuǎn)化率達到 80 %?100%，分批加入底物C0BE;繼續(xù)進行反應(yīng)，至反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達到95%?100 %時結(jié)束 反應(yīng)，加入二氯甲烷多次萃取，合并有機相并蒸發(fā)脫去溶劑，即得（S) -4-氯-3-羥基丁酸乙 酯；本發(fā)明的催化方法綠色無污染，無需添加有機溶劑和還原性輔因子，效率高、成本低、步 驟少，簡便易操作。
[0007] 本發(fā)明所述的底物COBE和其他基本的化學(xué)試劑由市售購得，所述的含有重組酮 還原酶的大腸桿菌由本公司專利201310345823. 3中所制得。

【權(quán)利要求】
1. 一種全細(xì)胞催化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其中以4-氯乙酰乙酸 乙酯（COBE)為底物，利用生物催化劑在以異丙醇為氫供體的條件下，在水相中不對稱還原 反應(yīng)生成（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，其特征在于：所述不對稱還原反應(yīng)在pH為6. 0? 8. 0的水相緩沖液中進行，在反應(yīng)容器中加入配制好的所述水相緩沖液，然后依次加入底 物COBE、異丙醇、CaCl2、重組酮還原酶的大腸桿菌全細(xì)胞，于溫度25°C?40°C下攪拌反應(yīng)， 利用氣相色譜方法檢測反應(yīng)進程，至轉(zhuǎn)化率達到80 %?100%，分批加入底物COBE ;繼續(xù)進 行反應(yīng)，至反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達到95%?100%時結(jié)束反應(yīng)，加入二氯甲烷多次萃取，合并有機相 并蒸發(fā)脫去溶劑，即得（S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全細(xì)胞催化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其 特征在于，所述含有重組酮還原酶的大腸桿菌細(xì)胞的制備方法為： 1) 將含有酮還原酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng) 基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養(yǎng)4?8小時； 2) 將培養(yǎng)得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30?38°C下，搖 床180-220rpm振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至0D6(I(I值達到0. 8?1. 2時，加入誘導(dǎo)劑，于22?32°C下繼 續(xù)培養(yǎng)16?20小時； 3) 培養(yǎng)完成后在4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體兩遍，再次離心收集菌體 即得含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1和所述的一種全細(xì)胞催化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法， 其特征在于，所述的反應(yīng)體系中底物COBE的終濃度為20%?30% (w/v)，重組酮還原酶的 大腸桿菌細(xì)胞的用量為底物質(zhì)量的1.0%?4.0% (w/w)，異丙醇的濃度為8%?13% (w/ v)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全細(xì)胞催化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法， 其特征在于，所述的水相緩沖液為磷酸鹽緩沖液，所述的水相緩沖液濃度為50?200mM， pH6. 2 ?6. 8。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全細(xì)胞催化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，其 特征在于，所述的反應(yīng)體系中所用的為CaCl2，濃度為2. 0-20mM。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全細(xì)胞催化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法， 其特征在于，所述底物COBE根據(jù)反應(yīng)情況分1?5批補加，每批次補加量為反應(yīng)體積的 3%-15%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全細(xì)胞催化制備（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法， 其特征在于，所述的誘導(dǎo)劑為異丙基-0 -D-硫代半乳糖苷（IPTG)，其誘導(dǎo)終濃度為0. 2? 1. OmM。
【文檔編號】C12P7/62GK104372041SQ201310348621
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月12日
【發(fā)明者】陳令偉 申請人:南京朗恩生物科技有限公司