專利名稱：評判α-干擾素治療慢性乙肝療效的基因位點(diǎn)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于評估治療慢性乙肝藥物的有效性的基因位點(diǎn)及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種評判α-干擾素治療慢性乙肝療效的基因位點(diǎn)及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙肝病毒檢測為陽性，病程超過半年或發(fā)病日期不明確而臨床有慢性肝炎表現(xiàn)者均可診斷為慢性乙肝。臨床表現(xiàn)為乏力、畏食、惡心、腹脹、肝區(qū)疼痛等癥狀。肝大，質(zhì)地呈 中度硬度，有輕壓痛。病情較重者可伴有慢性肝病面容、蜘蛛痣、肝掌、脾大，肝功能可時(shí)有異常或持續(xù)異常。慢性化因素有(1)免疫功能低下者。如腎移植、腫瘤、白血病、艾滋病、血液透析患者感染乙肝病毒后常易演變?yōu)槁愿窝?。乙型肝炎發(fā)病的急性期使用腎上腺糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑治療者，常能破壞患者體內(nèi)的免疫平衡，也容易使急性肝炎轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝住?2)既往有其它肝炎或肝病史者，或有并發(fā)病癥者，再感染乙型肝炎病毒時(shí)不僅容易急轉(zhuǎn)慢，而且預(yù)后較差。如原有酒精中毒性肝硬變或并發(fā)血吸蟲病、華支星吸蟲病、瘧疾、結(jié)核病、潰瘍病、糖尿病等。(3)急性或隱匿起病的無黃疸型肝炎患者比急性黃疸型肝炎患者容易發(fā)展為慢性。這與不能得到及時(shí)休息和治療有一定關(guān)系。(4)最初感染乙肝病毒時(shí)的患者年齡。資料表明新生兒感染乙肝病毒，約90% 95%要成為慢性攜帶者；兒童期感染乙肝病毒后約20%;成人約10%發(fā)展為帶毒狀態(tài)。(5)其它因素。如急性期的肝炎患者過度勞累、酗酒、性生活過度、吸毒、應(yīng)用損害肝臟的藥物、營養(yǎng)不良、有其它病原微生物的嚴(yán)重感染或?yàn)E用藥品等均可由急性轉(zhuǎn)為慢性。目前國內(nèi)外公認(rèn)有效的抗HBV藥物主要包括干擾素類和核苷(酸)類似物，并各有其優(yōu)缺點(diǎn)。前者的優(yōu)點(diǎn)是療程相對固定，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率較高，療效相對持久，耐藥變異較少，其缺點(diǎn)是需要注射給藥，不良反應(yīng)較明顯，不適于肝功能失代償者。后者的優(yōu)點(diǎn)是口服給藥，抑制病毒作用強(qiáng)，不良反應(yīng)少而輕微，可用于肝功能失代償者，其缺點(diǎn)是療程相對不固定，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率低，療效不夠持久，長期應(yīng)用可產(chǎn)生耐藥變異，停藥后可出現(xiàn)病情惡化等。臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)自己的專業(yè)知識和臨床經(jīng)驗(yàn)，在綜合考慮患者具體病情及其個(gè)人意愿的基礎(chǔ)上，在本《指南》的原則框架下確定個(gè)體化的治療方案。治療慢性乙肝的方法主要有口服核苷類藥物抗病毒和注射干擾素抗病毒，其中注射干擾素治療地位很重要，但是目前沒有相關(guān)手段預(yù)先評判注射干擾素的療效。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問題本發(fā)明提供一種評判α -干擾素治療慢性乙肝療效的基因位點(diǎn)及應(yīng)用。通過測定目標(biāo)基因位點(diǎn)的存在，預(yù)先評判注射干擾素治療慢乙肝的應(yīng)答效果。技術(shù)方案評判α-干擾素治療慢性乙肝療效的基因位點(diǎn)，該基因由以下方法制得基因組DNA提取樣本處理抽取靜脈全血5mL，由實(shí)驗(yàn)室提取純化DNA ;引物設(shè)計(jì)與合成以NCBI上序列為模板,運(yùn)用Primer premier5. O引物設(shè)計(jì)軟件；設(shè)計(jì)PCR引物正義引物如SEQ ID NO. I所示，反義引物如SEQ ID NO. I所示；PCR反應(yīng)條件50 μ L反應(yīng)體積中，含10倍反應(yīng)緩沖液5 μ L，氯化鎂溶液(25mmol/L) 4. 5 μ L，4種三磷酸脫氧核糖核酸(dNTP) (200mmol/L)4y L，兩種引物各 10pmol，Taq DNA 多聚酶(5 U/mL)0. 5 μ L，加入純化好的DNA模板IOyL,加水至50yL，混勻上機(jī)，94°C預(yù)變性3 min，94°C變性30 sec，54°C退火30sec，72°C延伸30 sec ;35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min ；擴(kuò)增產(chǎn)物的分析PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 5%瓊脂糖電泳，觀察結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物長246 bp。所述基因位點(diǎn)在制備評判α -干擾素治療慢性乙肝療效藥物中的應(yīng)用。有益效果本方案已經(jīng)找到相關(guān)的基因位點(diǎn)用來預(yù)先評判干擾素治療乙肝的療效，這樣只要預(yù)先對想要采用干擾素治療慢性乙肝的患者進(jìn)行采血檢測，就可以判斷治療方案的可行性，減少因盲目進(jìn)行干擾素治療中出現(xiàn)的經(jīng)濟(jì)和時(shí)間損失，未來我們將會制作出相關(guān)的試劑盒，這樣就可以快速、有效的給出檢測結(jié)果，費(fèi)用上也可大大減少，市場前景可觀。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例形式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I :
1.基因組DNA提取樣本處理抽取靜脈全血5mL，由實(shí)驗(yàn)室提取純化DNA；
2.引物設(shè)計(jì)與合成以NCBI上序列為模板,運(yùn)用Primerpremier5. O引物設(shè)計(jì)軟件；
3.設(shè)計(jì)PCR 引物正義引物(P1) 5’ -CACGTTTCTTGGAGTACTCTAC-3’，反義引物(P2)5’ -CACCAACCCCGTAGTTGTGTC-3’ ；
4.PCR反應(yīng)條件50 μ L反應(yīng)體積中，含10倍反應(yīng)緩沖液5 μ L，氯化鎂溶液(25mmol/L) 4. 5 μ L，4種三磷酸脫氧核糖核酸(dNTP) (200mmol/L) 4 μ L，兩種引物各lOpmol，TaqDNA多聚酶(5 U/mL) O. 5 μ L,加入純化好的DNA模板10 μ L，加水至50 μ L，混勻上機(jī)，94°C預(yù)變性3 min，94°C變性30 sec，54°C退火30sec，72°C延伸30 sec ;35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min ；
5.擴(kuò)增產(chǎn)物的分析PCR產(chǎn)物經(jīng)I.5%瓊脂糖電泳，觀察結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物長246 bp。本方案已經(jīng)找到相關(guān)的基因位點(diǎn)用來預(yù)先評判干擾素治療乙肝的療效，這樣只要預(yù)先對想要采用干擾素治療慢性乙肝的患者進(jìn)行采血檢測，就可以判斷治療方案的可行性，減少因盲目進(jìn)行干擾素治療中出現(xiàn)的經(jīng)濟(jì)和時(shí)間損失，未來我們將會制作出相關(guān)的試劑盒，這樣就可以快速、有效的給出檢測結(jié)果，費(fèi)用上也可大大減少，市場前景可觀。
權(quán)利要求
1.評判α-干擾素治療慢性乙肝療效的基因位點(diǎn)，其特征在于該基因由以下方法制得基因組DNA提取樣本處理抽取靜脈全血5mL，由實(shí)驗(yàn)室提取純化DNA ;引物設(shè)計(jì)與合成以NCBI上序列為模板,運(yùn)用Primer premier5. O引物設(shè)計(jì)軟件；設(shè)計(jì)PCR引物正義引物如SEQ ID NO. I所示，反義引物如SEQ ID NO. I所示；PCR反應(yīng)條件50 μ L反應(yīng)體積中，含10倍反應(yīng)緩沖液5 μ L，氯化鎂溶液(25mmol/L) 4. 5 μ L，4種三磷酸脫氧核糖核酸(dNTP) (200mmol/L)4y L，兩種引物各 10pmol，Taq DNA 多聚酶(5 U/mL)0. 5 μ L，加入純化好的DNA模板IOyL,加水至50yL，混勻上機(jī)，94°C預(yù)變性3 min，94°C變性30 sec，54°C退火30sec，72°C延伸30 sec ；35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min ；擴(kuò)增產(chǎn)物的分析PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 5%瓊脂糖電泳，觀察結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物長246 bp。
2.權(quán)利要求I所述基因位點(diǎn)在制備評判α-干擾素治療慢性乙肝療效藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
評判α-干擾素治療慢性乙肝療效的基因位點(diǎn)及其應(yīng)用，該基因由以下方法制得基因組DNA提取樣本處理；引物設(shè)計(jì)與合成；設(shè)計(jì)PCR引物正義引物如SEQIDNO.1所示，反義引物如SEQIDNO.1所示；PCR反應(yīng)； 擴(kuò)增產(chǎn)物的分析PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，觀察結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物長246bp。本方案已經(jīng)找到相關(guān)的基因位點(diǎn)用來預(yù)先評判干擾素治療乙肝的療效，這樣只要預(yù)先對想要采用干擾素治療慢性乙肝的患者進(jìn)行采血檢測，就可以判斷治療方案的可行性，減少因盲目進(jìn)行干擾素治療中出現(xiàn)的經(jīng)濟(jì)和時(shí)間損失，未來我們將會制作出相關(guān)的試劑盒，這樣就可以快速、有效的給出檢測結(jié)果，費(fèi)用上也可減少，市場前景可觀。
文檔編號C12N15/12GK102851298SQ20121031023
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月29日
發(fā)明者常家寶 申請人:南京市第二醫(yī)院