專利名稱：土傳病害鑒定病圃的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物病害防治領(lǐng)域，具體涉及土傳病害鑒定病圃的建立方法。
背景技術(shù)：
對(duì)植物病害防治的研究，尤其是植物土傳病害防治的研究，建立合適的病圃對(duì)于研究植物的抗病性鑒定和抗病育種意義非常重大。病圃的設(shè)置與利用是進(jìn)行抗病性鑒定的基本條件，沒有重而均勻的發(fā)病條件就難以對(duì)植物品種資源的抗病性做出可靠的鑒定。合適均勻病圃的建立，一方面關(guān)系到對(duì)植物的抗病性鑒定是否準(zhǔn)確可靠，鑒定結(jié)論是否可信，能否用于指導(dǎo)科研生產(chǎn)；另一方面，對(duì)于植物的抗病育種也至關(guān)重要，它能對(duì)育種材料或品種的抗性進(jìn)行最全面、嚴(yán)格的考驗(yàn)，鑒定 出適合在生產(chǎn)中應(yīng)用的材料或品種，合適均勻的病圃可以利于促進(jìn)抗病育種的選育步伐。病圃的建立可分為天然病圃和常規(guī)人工病圃。天然病圃是指在連年耕作的常規(guī)農(nóng)田中，局部或部分面積地塊病原菌逐年積累，自然形成的重病塊或重病區(qū)，人們選擇這部分田塊作為天然病圃。天然病圃的選擇建立有其特定的缺點(diǎn)和不足①發(fā)病不均勻天然病圃土壤中病原菌含量不均勻、相差較大，表現(xiàn)為局部地塊發(fā)病很重、局部地塊發(fā)病很輕的情況，這無論對(duì)抗病性鑒定還是抗病品種選育都不準(zhǔn)確，容易造成偏差。②病原菌生理小種不可控很多土傳病害，存在不同的生理小種，各生理小種之間，致病力有所不同，所以，無論選擇致病力極強(qiáng)的生理小種還是選擇致病力極弱的生理小種，都不能很好地反映出植物的抗病性，而天然病圃中病原菌的生理小種存在不確定性，致病力過強(qiáng)或過弱都不適宜植物的抗病性鑒定和抗病品種的選育。③病圃位置存在隱患絕大多數(shù)土傳病害都屬于檢疫性病害，因?yàn)榭蒲泄ぷ鞯男枰?，建立土傳病圃時(shí)，一般都遵循植物檢疫的原則，做到有效杜絕病原物的外傳，保持農(nóng)業(yè)生產(chǎn)區(qū)的純凈。而天然病圃大多都在農(nóng)田區(qū)域范圍內(nèi)，具有潛在擴(kuò)散傳播的危險(xiǎn)性，使得機(jī)耕、灌溉等農(nóng)事操作及農(nóng)產(chǎn)品種子、苗木、莖桿及果實(shí)的運(yùn)輸帶來不便。常規(guī)人工病圃是指人為把病原菌從病株上分離出來，經(jīng)純化后在特定培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)，待長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基后，將病原菌和培養(yǎng)基一同撒施到規(guī)劃好的區(qū)域內(nèi)，建立土傳病害病圃的ー種方法。常規(guī)的人工病圃建立也有其缺點(diǎn)和不足的地方①常規(guī)人工病圃費(fèi)時(shí)耗力，耗費(fèi)大量物資。常規(guī)人工病圃需要制作大量的培養(yǎng)基，常見培養(yǎng)基有大麥、小麥、棉子殼、麥麩等的混合物，需要把這些物質(zhì)進(jìn)行浸泡處理、裝袋密封及高壓滅菌工作，用量大，費(fèi)エ費(fèi)時(shí)，消耗水電。②操作過程容易污染，對(duì)環(huán)境要求高整個(gè)培養(yǎng)基制作、滅菌、接種以及存放等均需要無菌的環(huán)境，ー不小心容易造成雜菌感染，培養(yǎng)基接種后還要需要大量潔凈的空間存放培養(yǎng)，對(duì)環(huán)境要求高。③常規(guī)人工病圃效率低下，エ效不高，エ期較長(zhǎng)。常規(guī)人工病圃的建立需要大量的接種物，如果建立面積較大的病圃，處理起來非常麻煩，功效很低，需要連續(xù)多年才能建造成比較成熟的病圃。④常規(guī)人工病圃也存在不均勻的現(xiàn)象。人エ培養(yǎng)的培養(yǎng)基及病原菌混合物雖然可以在撒入土壌中做到盡量均勻，但是，因?yàn)槿斯づ囵B(yǎng)基多為固體團(tuán)粒狀，無法均勻撒開，且病原菌的菌絲體或孢子生長(zhǎng)不一致，所以常規(guī)人工病圃也存在局部很重，局部很輕的情況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中運(yùn)用方法繁復(fù)、成本偏高、費(fèi)エ費(fèi)時(shí)、病圃均勻性低等缺陷，提供了一種土傳病害鑒定病圃的建立方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為土傳病害鑒定病圃的建立方法，包括以下步驟
1)病原物的分離純化將病原物從植物病株中分離出來后，進(jìn)行單孢分離并純化后得到病原物單菌落；
2)菌落培養(yǎng)將步驟I)得到的培養(yǎng)好的病原物單菌落，用打孔器沿菌落邊緣打取直徑 為IOmm的菌塊，接種于馬鈴薯PDA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)5_7天，之后將培養(yǎng)好的病原物菌落連同馬鈴薯PDA培養(yǎng)基全部接入查氏培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，并于28°C搖床培養(yǎng)4-5天，搖床轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分，得到孢子懸浮液，再以無菌水配制成濃度為I X IO7個(gè)/ml的病原物孢子懸浮液；
3)二次培養(yǎng)將步驟2)得到的病原物孢子懸浮液按照1:40體積比例接入到查氏培養(yǎng)液中，靜置培養(yǎng)10天，以監(jiān)測(cè)孢子量大于等于I X IO7個(gè)/ml為達(dá)到所需標(biāo)準(zhǔn)，得到可接種孢子液；
4)接入病圃將步驟3)得到的可接種孢子液按照每畝地IOOkg接種量施入病圃中，分別在植物生長(zhǎng)的第30、50、70和90天施入。進(jìn)ー步的，所述步驟I)中，病原物為土壤習(xí)居菌，屬于土傳病害可以利用此方法。進(jìn)ー步的，所述步驟2)中，馬鈴薯PDA培養(yǎng)基中各組分比例為按照質(zhì)量比馬鈴薯甸甸糖:瓊月旨:水為100 9 9 :382。進(jìn)ー步的，所述步驟2)中，病原物單菌落接種于馬鈴薯PDA培養(yǎng)基上，280C培養(yǎng)6天。進(jìn)ー步的，所述步驟2)中，查氏培養(yǎng)液中各組分比例為按照質(zhì)量比硝酸鉀磷酸~-氣鐘:硫fe續(xù)氣化鐘硫Ife亞鐵庶糖水為2 I 0. 5 0. 5 0. 01 30 :1000。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明提供的技術(shù)方案，具有以下效果
1、以前的常規(guī)人工建立病圃的方法是費(fèi)時(shí)耗力，耗費(fèi)大量物資，本技術(shù)方案可以節(jié)省大量的培養(yǎng)基物質(zhì)，省去固體培養(yǎng)基浸泡處理、裝袋密封、高壓滅菌以及人工接菌等繁瑣過程，直接接入液體查氏培養(yǎng)基中即可，省時(shí)省エ，可節(jié)省大量成本；
2、以前的常規(guī)人工建立病圃的方法容易引起雜菌的感染，本技術(shù)方案直接接入到液體培養(yǎng)基中，密封性好，不容易混入雜菌，減少了常規(guī)接種等復(fù)雜操作過程中不慎混入雜菌的感染的可能性；
3、本技術(shù)方案可以減少操作步驟，提高工作效率，可以大批量制備，液體查氏培養(yǎng)基易于制備，簡(jiǎn)單可行，無需復(fù)雜操作；
4、通過滴灌的方式隨水滴施進(jìn)入病圃的方法均勻性好，病原菌孢子可以均勻分布到土壌中，而且直接在土壌中定殖，利于侵染寄主植物，避免常規(guī)人工接種過程中在田間撒施時(shí)，因?yàn)轱L(fēng)吹日曬、紫外線輻射使部分病原菌菌絲及孢子死亡的現(xiàn)象發(fā)生。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :
棉花枯萎病病圃的建立
1)從棉花枯萎病株體中分離純化出枯萎病單菌落，編號(hào)為XH-I，保存?zhèn)溆茫?br> 2)將編號(hào)為XH-I的枯萎病單菌落接種于制備好的馬鈴薯PDA培養(yǎng)基上，置于28°C霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 7天，至菌落長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿；
3)沿菌落邊緣打成直徑IOmm的菌餅，在超凈工作臺(tái)上接到500ml三角錐形瓶的查氏培養(yǎng)液中，每IOOml培養(yǎng)液接入3片菌餅，每瓶接入10片菌餅(因每個(gè)三角錐形瓶裝入查氏培養(yǎng)液體積約為330ml)；
4)置于120轉(zhuǎn)/分，溫度設(shè)置為28°C的搖床上，搖培4-5天后，得到孢子懸浮液，用無·菌水調(diào)節(jié)成I X 107孢子懸浮液；
5)然后將其按1:40比例接到體積為20L密閉容器裝入4/5體積滅菌好的查氏培養(yǎng)液中，靜置培養(yǎng)10天，當(dāng)監(jiān)測(cè)孢子量ミI X IO7個(gè)/ml吋，即可接種；
6)按照姆畝地IOOkg接種量隨水滴施進(jìn)入病圃中,在整個(gè)棉花生長(zhǎng)季節(jié)的第30天、50天、70天和90天連續(xù)施入4次。查氏培養(yǎng)液中各組分比例為按照質(zhì)量比硝酸鉀磷酸ニ氫鉀硫酸鎂氯化鉀硫酸亞鐵蔗糖水為 2 1 :0. 5 :0. 5 :0. 01 30 =IOOO0實(shí)施例2:
棉花黃萎病病圃的建立
1)從棉花黃萎病株體中分離純化出黃萎病單菌落，編號(hào)為143T-5，保存?zhèn)溆茫?br> 2)將編號(hào)為143T-5的黃萎病單菌落接種于制備好的PDA培養(yǎng)基上，置于28°C霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 7天，至菌落長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿；
3)沿菌落邊緣打成直徑IOmm的菌餅，在超凈工作臺(tái)上接到500ml三角錐形瓶的查氏培養(yǎng)液中，每IOOml培養(yǎng)液接入3片菌餅，每瓶接入10片菌餅(因每個(gè)三角錐形瓶裝入查氏培養(yǎng)液體積約為330ml)；
4)置于120轉(zhuǎn)/分，溫度設(shè)置為28°C的搖床上，搖培4-5天后，得到孢子懸浮液，用無菌水調(diào)節(jié)成I X 107孢子懸浮液；
5)然后將其按1:40比例接到體積為20L密閉容器裝入4/5體積滅菌好的查氏培養(yǎng)液中，靜置培養(yǎng)10天，當(dāng)監(jiān)測(cè)孢子量彡IX 107個(gè)/ml吋，即可接種；
6)按照姆畝地IOOkg接種量隨水滴施進(jìn)入病圃中,在整個(gè)棉花生長(zhǎng)季節(jié)的第30天、50天、70天和90天連續(xù)施入4次。查氏培養(yǎng)液中各組分比例為按照質(zhì)量比硝酸鉀磷酸ニ氫鉀硫酸鎂氯化鉀硫酸亞鐵蔗糖水為 2 1 :0. 5 :0. 5 :0. 01 30 =IOOO0實(shí)施例3:
向日葵菌核病病圃的建立
1)從向日葵菌核病株體中分離純化出菌核病單菌落，編號(hào)為BTU-10，保存?zhèn)溆茫?br> 2)將編號(hào)為BTU-10的菌核病單菌落接種于制備好的PDA培養(yǎng)基上，置于28°C霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 7天，至菌落長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿；
3)沿菌落邊緣打成直徑IOmm的菌餅，在超凈工作臺(tái)上接到500ml三角錐形瓶的查氏培養(yǎng)液中，每IOOml培養(yǎng)液接入3片菌餅，每瓶接入10片菌餅(因每個(gè)三角錐形瓶裝入查氏培養(yǎng)液體積約為330ml)；
4)置于120轉(zhuǎn)/分，溫度設(shè)置為28°C的搖床上，搖培4-5天后，得到孢子懸浮液，用無菌水調(diào)節(jié)成I X 107孢子懸浮液；
5)然后將其按1:40比例接到體積為20L密閉容器裝入4/5體積滅菌好的查氏培養(yǎng)液中，靜置培養(yǎng)10天，當(dāng)監(jiān)測(cè)孢子量彡IX 107個(gè)/ml吋，即可接種；
6)按照姆畝地IOOkg接種量隨水滴施進(jìn)入病圃中,在整個(gè)向日葵生長(zhǎng)季節(jié)的第30天、50天、70天和90天連續(xù)施入4次。查氏培養(yǎng)液中各組分比例為按照質(zhì)量比硝酸鉀磷酸ニ氫鉀硫酸鎂氯化鉀硫酸亞鐵蔗糖水為 2 1 :0. 5 :0. 5 :0. 01 30 =IOOO0最后應(yīng)說明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.土傳病害鑒定病圃的建立方法，其特征在于，包括以下步驟 1)病原物的分離純化將病原物從植物病株中分離出來后，進(jìn)行單孢分離并純化后得到病原物單菌落； 2)菌落培養(yǎng)將步驟I)得到的培養(yǎng)好的病原物單菌落，用打孔器沿菌落邊緣打取直徑為IOmm的菌塊，接種于馬鈴薯PDA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)5_7天，之后將培養(yǎng)好的病原物菌落連同馬鈴薯PDA培養(yǎng)基全部接入查氏培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，并于28°C搖床培養(yǎng)4-5天，搖床轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分，得到孢子懸浮液，再以無菌水配制成濃度為I X IO7個(gè)/ml的病原物孢子懸浮液； 3)二次培養(yǎng)將步驟2)得到的病原物孢子懸浮液按照1:40體積比例接入到查氏培養(yǎng)液中，靜置培養(yǎng)10天，以監(jiān)測(cè)孢子量大于等于I X IO7個(gè)/ml為達(dá)到所需標(biāo)準(zhǔn)，得到可接種孢子液； 4)接入病圃將步驟3)得到的可接種孢子液按照每畝地IOOkg接種量施入病圃中，分別在植物生長(zhǎng)的第30、50、70和90天施入。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的土傳病害鑒定病圃的建立方法，其特征在于，所述步驟I)中，病原物為土壤習(xí)居菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的土傳病害鑒定病圃的建立方法，其特征在于，所述步驟2)中，馬鈴薯PDA培養(yǎng)基中各組分比例為按照質(zhì)量比馬鈴薯葡萄糖瓊脂 水為100 9 9 :382。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的土傳病害鑒定病圃的建立方法，其特征在于，所述步驟2)中，病原物單菌落接種于馬鈴薯PDA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)6天。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的土傳病害鑒定病圃的建立方法，其特征在于，所述步驟2)中，查氏培養(yǎng)液中各組分比例為按照質(zhì)量比硝酸鉀磷酸ニ氫鉀硫酸鎂氯化鉀硫酸亞鐵蔗糖 水為 2 1 :0. 5 :0. 5 :0. 01 30 =IOOO0
全文摘要
本發(fā)明公開了土傳病害鑒定病圃的建立方法，包括以下步驟1)病原物的分離純化；2)菌落培養(yǎng)；3)二次培養(yǎng)；4)接入病圃。本發(fā)明的有益效果為1、節(jié)省大量的培養(yǎng)基物質(zhì)，省去固體培養(yǎng)基浸泡處理、裝袋密封、高壓滅菌以及人工接菌等繁瑣過程，可節(jié)省大量成本；2、直接接入到液體培養(yǎng)基中，密封性好，不容易混入雜菌，減少了常規(guī)接種等復(fù)雜操作過程中不慎混入雜菌的感染的可能性；3、可以減少操作步驟，提高工作效率，可以大批量制備，液體查氏培養(yǎng)基易于制備，簡(jiǎn)單可行，無需復(fù)雜操作；4、通過滴灌的方式隨水滴施進(jìn)入病圃的方法均勻性好，利于侵染寄主植物。
文檔編號(hào)C12N3/00GK102835288SQ201210309640
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月28日
發(fā)明者劉政, 孫艷, 余渝, 林海, 劉麗, 陳兵, 韓煥勇, 王方勇, 董承光, 宿俊吉 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)墾科學(xué)院