專利名稱：新型慢性乙肝治療性dc疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用重組乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)和重組乙肝病毒核心抗原(hepatitis Bvirus core antigen，HBcAg)同時負(fù)載單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞(monocytederived-DC，moDC)，使該樹突狀細(xì)胞得以負(fù)載抗原而成熟從而制成的HBV特異性DC疫苗。
背景技術(shù)：
乙型病毒性肝炎是由HBV引起的，以肝臟炎癥核壞死病變?yōu)橹鞯囊唤M傳染病，是當(dāng)前嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球范圍內(nèi)HBV感染者高達(dá)20億以上，其中4億為慢性感染者。慢性感染者中有10～20％可發(fā)展為肝硬化，肝硬化的1～5％可演變?yōu)楦渭?xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。因此肝細(xì)胞癌的發(fā)生與慢性HBV感染高度相關(guān)，慢性感染者發(fā)生肝細(xì)胞癌的機率是非感染者的100倍。我國是HBV慢性感染的高流行區(qū)，一般人群的HBsAg陽性率為9.09％(近1.2億人為HBV攜帶者)，慢性乙型肝炎(chronicalhepatitis B，CHB)現(xiàn)癥患者達(dá)3000萬，每年因治療慢性乙型肝炎及其相關(guān)的肝臟疾病(如肝硬化、肝癌等)約花費1000億元人民幣。慢性乙型肝炎已嚴(yán)重威脅國人健康，給患者個人與家庭帶來了沉重負(fù)擔(dān)，甚至影響國民經(jīng)濟的發(fā)展，因此，對病毒性肝炎的預(yù)防、控制、治療的研究有著重大意義，國務(wù)院剛發(fā)布的《國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要(2006-2020年)》已將“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”列入16個重大專項之中。
乙型肝炎病毒屬嗜肝DNA病毒科，基因組長約3.2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。完整的HBV顆粒直徑為42nm，又名Dane顆粒，分為包膜與核心兩部分。包膜厚約7nm，內(nèi)含HBsAg、糖蛋白與細(xì)胞脂肪。包膜內(nèi)為直徑28nm的核心或核殼體。HBsAg在肝細(xì)胞內(nèi)合成，大量釋出于血液循環(huán)中，在電鏡下呈球形，直徑22nm，分子量24KD；或管狀[(20～30)nm×(200～400)nm]，沒有感染性。在血液中HBsAg的數(shù)量遠(yuǎn)多于Dane顆粒，可超過100～1000倍。核心部分含有環(huán)狀雙股DNA、DNA聚合酶(DNApolymerase，DNAP)和HBcAg，是病毒復(fù)制的主體。HBcAg是由HBV DNA負(fù)鏈上的開放讀碼區(qū)C區(qū)編碼的核心(核衣殼)多肽，分子量21KD，在外周血中無游離的HBcAg存在。
HBV引起肝臟損傷的主要原因是宿主針對感染了HBV的肝細(xì)胞的免疫反應(yīng)，即機體免疫系統(tǒng)釋放出大量非溶細(xì)胞性的細(xì)胞因子所致的肝細(xì)胞損害。持續(xù)的HBV感染是造成乙型肝炎慢性化的主要原因，因此，抗病毒治療是慢性HBV感染的一項基本治療措施，但療效不夠滿意，治療后HBV DNA難以徹底清除，復(fù)發(fā)率高，最終清除病毒還須機體的特異性免疫功能。病毒特異性T細(xì)胞反應(yīng)是機體抗病毒感染最主要的獲得性免疫反應(yīng)，其中CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在機體排斥、清除肝炎病毒的過程中具有關(guān)鍵作用，CD4+輔助T細(xì)胞(helper T lymphocyte，Th)也是體內(nèi)有效調(diào)節(jié)抗病毒免疫反應(yīng)不可缺少的因素。在急性自限性HBV感染的患者中，HBV特異性的CTL細(xì)胞反應(yīng)在造成肝組織損傷的同時，可清除機體的病毒，使患者獲得痊愈，Th細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在清除病毒中也扮演了重要角色。但是，大部分的HBV感染者不能徹底清除病毒而導(dǎo)致慢性感染。大量研究表明，慢性HBV感染患者免疫應(yīng)答水平低下或缺失，病毒特異性T細(xì)胞的數(shù)量和功能都降低，這種現(xiàn)象稱為免疫耐受。加之病毒容易發(fā)生變異，更促使免疫耐受的形成。慢性肝炎患者體內(nèi)HBV特異性的CTL反應(yīng)和Th細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)微弱，甚至檢測不到針對HBV的特異性的CTL反應(yīng)，因此機體不能有效清除病毒，這就是HBV持續(xù)存在的原因之一。
目前常用的抗病毒治療、保肝降酶治療、抗纖維化治療以及免疫學(xué)治療(主要是細(xì)胞因子等)雖有一定療效，但由于免疫耐受、病毒變異等原因，往往不能徹底清除體內(nèi)病毒。因此有效控制病毒復(fù)制對抑制疾病的進展十分重要。預(yù)防性乙肝疫苗的接種，對保護易感人群免受HBV的感染以及HBV引起的疾病起十分重要作用。隨著免疫學(xué)理論的發(fā)展和生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的進步，治療性乙肝疫苗的開發(fā)和應(yīng)用為慢性乙肝的治療帶來了新的希望。目前治療性疫苗主要有以下幾類有核酸疫苗、基因工程疫苗、合成肽疫苗、乙肝病毒表面抗原-抗體復(fù)合物疫苗、抗體化抗原疫苗等。目前我國進入臨床試驗階段的疫苗有乙肝病毒表面抗原-抗體復(fù)合物疫苗、合成肽疫苗和蛋白疫苗，有的已進入臨床III期。由于以上疫苗均為蛋白或多肽產(chǎn)物，接種體內(nèi)后必須由抗原提呈細(xì)胞處理、加工和提呈后才能有效激活機體的免疫系統(tǒng)，因此抗原提呈的效率直接影響疫苗的療效，其療效和安全性問題還有待于進一步驗證，在臨床上的推廣應(yīng)用還有待于觀察。
樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是體內(nèi)分布廣泛的抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)，具有激活CD8+CTL和CD4+Th的能力，處于免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，在機體抗病毒、腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。DC可以通過激活體內(nèi)特異性的CTL前體細(xì)胞或未致敏的T細(xì)胞、Th細(xì)胞，使機體產(chǎn)生擴增、放大的CTL效應(yīng)，同時產(chǎn)生高水平、高親合力的抗體反應(yīng)。因此，在慢性乙肝或慢性乙肝合并肝細(xì)胞癌的治療中，通過上調(diào)DC介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)來清除HBV已經(jīng)成為目前的研究熱點。近年研究表明，慢性HBV感染患者的體內(nèi)HBV特異性T細(xì)胞免疫耐受的形成，其機制可能是DC的表型不成熟和DC的免疫調(diào)節(jié)和抗原提呈功能有特異性的缺陷。我們實驗室的研究也發(fā)現(xiàn)慢性HBV感染者外周血中DC的增殖數(shù)量較正常人明顯降低；表達(dá)于慢性乙肝患者DC表面的CD1a、CD86、CD80和HLA-DR的水平明顯低于正常；在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction，MLR)中乙肝患者的DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力亦低于健康人；在MLR上清及純的DC培養(yǎng)上清液中其產(chǎn)生IL-12的水平下降而NO水平升高，NO被認(rèn)為可通過抑制多種酶的作用而損傷健康組織，由此可見慢性乙型肝炎患者不僅DC表型不成熟同時也存在功能缺陷。Kakumu在研究HBV、HCV感染的肝癌患者的外周血DC功能時，也認(rèn)為DC功能的降低與HBV或HCV感染有一定關(guān)系。
DC疫苗是指負(fù)載了特異性抗原的成熟樹突狀細(xì)胞疫苗。隨著對DC生物學(xué)特征的深入了解及其在抗病毒、抗腫瘤免疫反應(yīng)中機理的研究，體外大量制備DC疫苗的方法日益成熟，將DC用抗原肽和蛋白抗原體外負(fù)載后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，在體內(nèi)可誘導(dǎo)出抗原特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答和特異性抗體的生成。DC作為一種免疫佐劑在治療黑色素瘤、前列腺癌、胃腸腺癌、肺腺癌、乳腺癌和肝癌中都發(fā)揮了較好的作用，而且作為預(yù)防性和治療性的疫苗也是安全有效的。關(guān)于HBV治療性的DC疫苗國外也已進入臨床實驗階段，但是多用HBsAg負(fù)載DC以制備疫苗。Chisari研究組發(fā)現(xiàn)，DC經(jīng)過HBsAg負(fù)載后可打破HBV轉(zhuǎn)基因鼠(HBV-Tg)的免疫耐受，誘導(dǎo)抗HBV的CTL反應(yīng)(Shimizu Y，Guidotti LG，F(xiàn)owler P，Chisari FV.Dendritic cell immunization breaks cytotoxic T lymphocyte tolerance in hepatitis Bvirus transgenic mice.J.Immunol.1998，1614520-4529)。Akbar等應(yīng)用HBsAg負(fù)載處于免疫抑制狀態(tài)的HBV-Tg鼠的DC，再注射入HBV-Tg小鼠后能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生anti-HBs(Akbar SMF，F(xiàn)urukawa S，Hasebe A，Horiike N，Michitaka K，Onji M.Production and efficacy of a dendritic cell-based therapeutic vaccine for murinechronic hepatitis B virus carrierer.Int.J.Mol.Med.2004，14295-299)。之后他們應(yīng)用HBsAg負(fù)載正常自愿者DC后回輸自愿者體內(nèi)，結(jié)果表明能有效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生anti-HBs，并且有很好的安全性(Akbar SMF，F(xiàn)urukawa S，Onji M，Murata Y，Niya T，Kanno S，Murakami H，Horiike N.Safety and efficacy of hepatitis B surfaceantigen-pulsed dendritic cells in human volunteers.Hepatol Res，2004，29136-141)。國內(nèi)研究者應(yīng)用CHB病人自體的PBMC誘導(dǎo)DC，經(jīng)HBsAg負(fù)載后回輸病人體內(nèi)后病人HBV-DNA明顯下降，52.6％發(fā)生HBeAg/anti-HBe血清轉(zhuǎn)換，部分病人ALT復(fù)常，總反應(yīng)率達(dá)57.9％(Chen M，Li YG，Zhang DZ，Wang ZY，Zeng WQ，Shi XF，Guo Y，Guo SH，Ren Hong.Therapeutic effect of autologous dendritic cell vaccine onpatients with chronic hepatitis BA clinical study.World J Gastroenterol 2005，11(12)1806-1808)。由于HBV的HBcAg對于不同的病毒亞型是高度保守的，且在急性自限性和慢性肝炎中HBcAg是CD4+T細(xì)胞應(yīng)答最躍的HBV蛋白，被認(rèn)為是較理想的免疫治療靶位，HBcAg具有多處T細(xì)胞識別表位，有保護性功能，還具有直接刺激B細(xì)胞應(yīng)答的作用，現(xiàn)在認(rèn)為還起佐劑作用，與其他保護性抗原融合可增強其免疫原性。
本發(fā)明在此基礎(chǔ)上，提供HBsAg和HBcAg兩種抗原聯(lián)合負(fù)載的DC疫苗，該疫苗能有效誘導(dǎo)同時針對s181-193表位及c18-27表位的多特異性CTL反應(yīng)，并且分泌細(xì)胞因子如IL-12也顯著高于單純HBcAg或HBsAg負(fù)載的DC。HBcAg的c18-27肽表位是HBV特異性CD8+T細(xì)胞的識別靶位，共負(fù)載HBsAg和HBcAg的DC能有效誘導(dǎo)針對HBV不同表位的多克隆特異性CTL，產(chǎn)生更強的抗HBV特異性和非特異性的免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用HBsAg和HBcAg共負(fù)載單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞，使該樹突狀細(xì)胞得以負(fù)載抗原而成熟從而制成HBV特異性DC疫苗。
本發(fā)明的特征在于用HBsAg和HBcAg共同負(fù)載未成熟的moDC，負(fù)載濃度5～100μg/ml，優(yōu)選為20μg/ml，負(fù)載時間為HBsAg與HBcAg和未成熟的moDC細(xì)胞共同孵育12～48小時。此疫苗能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對HBsAg和HBcAg的特異性免疫。
本發(fā)明的特征在于從單核細(xì)胞誘導(dǎo)moDC，在moDC未成熟階段即5～6天時加入HBsAg與HBcAg各20μg/ml，共培養(yǎng)12～48小時，收集成熟moDC即為HBV特異性的DC疫苗。
本發(fā)明的疫苗使用時可以制成藥物制劑，如注射劑，該注射劑是單位劑量形式，如每制劑單位含有DC數(shù)1×104～1×107個。該注射劑必要時可以加入藥物可接受的載體，如稀釋劑，賦型劑，穩(wěn)定劑等藥物學(xué)常規(guī)的輔料。
本發(fā)明的疫苗制劑，可通過皮下、肌肉或淋巴結(jié)內(nèi)注射。
本發(fā)明的疫苗制劑，可與其他細(xì)胞因子治療方法合用。
本發(fā)明的疫苗制劑，可與治療慢性乙肝的其他治療方法(如抗病毒治療，中醫(yī)中藥治療、過繼細(xì)胞免疫治療)聯(lián)合應(yīng)用。
本發(fā)明的術(shù)語解釋如下HBsAg乙型肝炎病毒表面抗原，其來源屬于現(xiàn)有技術(shù)。
HBcAg乙型肝炎病毒核心抗原，其來源屬于現(xiàn)有技術(shù)。
DC樹突狀細(xì)胞，是體內(nèi)提呈抗原功能強的抗原提呈細(xì)胞，其來源屬于現(xiàn)有技術(shù)。
負(fù)載是抗原致敏細(xì)胞的過程，即將抗原加入DC的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，DC攝取抗原后，在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過加工處理，將蛋白抗原分解成多肽后與MHC分子結(jié)合而提呈于DC表面，從而被免疫細(xì)胞識別而誘發(fā)免疫反應(yīng)。
未成熟的moDC即未成熟的單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞，其表型和功能均不完善，不能誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)。不成熟的DC經(jīng)抗原致敏可成熟，表型和功能均得到明顯的改善，可有效誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
孵育即細(xì)胞的培養(yǎng)過程。細(xì)胞需要在一定的培養(yǎng)基中進行生長繁殖，并且需要保持一定的溫度、濕度和CO2的濃度。
成熟moDC即成熟的單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞，其表型和功能均完善，如負(fù)載了抗原后，其表面可呈現(xiàn)抗原肽與MHC分子結(jié)合的復(fù)合分子。
HBV特異性的DC疫苗即負(fù)載了HBV抗原、可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對HBV的特異性免疫活性細(xì)胞的DC疫苗。
本發(fā)明的疫苗的制備過程可描述如下1.HBsAg和HBcAg的獲得HBsAg來源于重組(酵母)乙肝疫苗不加免疫佐劑的半成品，HBcAg來源于本室構(gòu)建的攜帶HBcAg全基因序列的質(zhì)粒PMM2066，在大腸桿菌中表達(dá)后分離純化而得。
2.0dPBMC的分離取外周抗凝血50～100ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞，(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，用預(yù)冷的PBS稀釋成15～20ml，分置于2個滅菌10ml離心管中，離心10分鐘，離心兩次以去除細(xì)胞碎片和血小板，吸棄上清。將去除細(xì)胞碎片和血小板的PBMC用PBS稀釋。在2個滅菌的離心管中加入預(yù)先恢復(fù)至室溫的淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋后的PBMC沿管壁輕輕加在淋巴細(xì)胞分離液液面上使形成界面，淋巴細(xì)胞分離液與稀釋PBMC的體積比為4∶6。離心20分鐘，由上至下分出稀釋液、PBMC帶、淋巴細(xì)胞分離液和紅細(xì)胞四條帶。收集界面單個核細(xì)胞于離心管中，用PBS稀釋至10～20ml，分別以1200rpm/10分鐘離心洗滌細(xì)胞2～3次。鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，如果細(xì)胞碎片和血小板較多，1200rpm/8分鐘再洗一次。將細(xì)胞合并到一個10ml離心管，以無血清AIM-V培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞濃度，用臺盼藍(lán)染色測定細(xì)胞存活比例，計算存活細(xì)胞總數(shù)，做好記錄。調(diào)整細(xì)胞濃度至2～5×106/ml，鋪于6孔板中，每孔2～3ml，37℃、5％的CO2孵箱中溫育1～2小時，使單核細(xì)胞貼壁。
3.0天DC培養(yǎng)當(dāng)孵育結(jié)束時，首先用培養(yǎng)皿中的液體沖洗貼壁細(xì)胞，吸出上層未貼壁細(xì)胞，加入預(yù)熱的培養(yǎng)基，再沖洗2次，以去除未貼壁細(xì)胞和大部分的貼壁的淋巴細(xì)胞。未洗盡的淋巴細(xì)胞比單核細(xì)胞小而圓亮。拍照記錄。置37℃、5％的CO2溫箱中培養(yǎng)3天。未貼壁細(xì)胞約占PBMC的50～80％，用含10％小牛血清的RPMA1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1～3×106/ml，加入維持劑量的IL-2(5～50U/ml)，于一潔凈培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每3天半量換液，并根據(jù)細(xì)胞狀況隨時調(diào)整培養(yǎng)基量，補加細(xì)胞因子，即為自體T淋巴細(xì)胞，待后續(xù)實驗用。貼壁細(xì)胞數(shù)量＝總PBMC-總未貼壁細(xì)胞數(shù)，記錄。沖洗時，用吸管上下吹吸幾次，輕輕振蕩培養(yǎng)皿。接著面向操作者傾斜培養(yǎng)皿，吸盡培養(yǎng)基。當(dāng)吸下面的液體時，滴管頭懸在液體中，沿培養(yǎng)皿四周邊移動滴管邊吸，不要用吸管刮培養(yǎng)皿的底面。按此法，吸出每個培養(yǎng)皿內(nèi)的液體。整個操作過程要迅速，以免細(xì)胞在洗滌過程中缺水干死。加入預(yù)熱的AIM-V培養(yǎng)基，內(nèi)含GM-CSF(100～1000U/ml)、IL-4(500～2000U/ml)。倒置顯微鏡下觀察貼壁的單核細(xì)胞，按照細(xì)胞狀態(tài)進行評分，由最差到最好劃分標(biāo)準(zhǔn)并評分0～5分。觀察的指標(biāo)包括細(xì)胞密度、細(xì)胞碎片、懸浮細(xì)胞的數(shù)量、大細(xì)胞的數(shù)量和樹枝狀突起的狀態(tài)。
4.3天半量換液倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，按照細(xì)胞狀態(tài)進行評分，由最差到最好劃分標(biāo)準(zhǔn)并評分0～5分。觀察的指標(biāo)包括細(xì)胞密度、細(xì)胞碎片、懸浮細(xì)胞的數(shù)量、大細(xì)胞的數(shù)量和樹枝狀突起的狀態(tài)。拍照記錄。收集(用吸管輕柔抽吸)每孔細(xì)胞于一個離心管中，及時在每孔中添加預(yù)熱的AIM-V培養(yǎng)液，以免貼壁細(xì)胞缺水干死。收集的細(xì)胞1200rpm/10分鐘離心，吸棄一半上層的舊培養(yǎng)液，補加入等量新鮮的含GM-CSF(100～1000U/ml)、IL-4(500～2000U/ml)的AIM-V培養(yǎng)液(補加培養(yǎng)液量應(yīng)除去孔中添加的每孔0.5ml的液體量，以便使換液前后培養(yǎng)液總體積保持不變)；置37℃、5％的CO2溫箱中培養(yǎng)。
5.5天半量換液倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，按照細(xì)胞狀態(tài)進行評分，由最差到最好劃分標(biāo)準(zhǔn)并評分0～5分。觀察的指標(biāo)包括細(xì)胞密度、細(xì)胞碎片、懸浮細(xì)胞的數(shù)量、大細(xì)胞的數(shù)量和樹枝狀突起的狀態(tài)。拍照記錄。收集每孔的懸浮細(xì)胞(用吸管輕柔抽吸)，取出10μl細(xì)胞懸液用臺盼藍(lán)染色，測定DC細(xì)胞存活比例，細(xì)胞計數(shù)(計數(shù)時，只計數(shù)典型的DC，不要將淋巴細(xì)胞計數(shù)在內(nèi))。計算出第5天存活的DC細(xì)胞占第0天收集貼壁細(xì)胞總數(shù)的比例，記錄。半量換液，操作如3天半量換液。換液的細(xì)胞因子濃度減半(GM-CSF 50～500U/ml、IL-4250～1000U/ml)。置37℃、5％的CO2溫箱中培養(yǎng)。
6.6天收集未成熟DC(immature DC，iDC)和抗原負(fù)載倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，按照細(xì)胞狀態(tài)進行評分，包括細(xì)胞密度、細(xì)胞碎片、懸浮細(xì)胞的數(shù)量、大細(xì)胞的數(shù)量和樹枝狀突起的狀態(tài)。拍照記錄。然后吸取2～5×105細(xì)胞懸液，離心，搜集上清，留-20℃冰箱備測細(xì)胞因子IL-10、IL-12等，因子濃度可換算成/24小時/10000細(xì)胞，以利于比較。細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞iDC表型(表型包括CD11c，CD14，CD80，CD86，CD1a，HLA DR，CD40，CD83等)，iDC純度通過光散射角G1門中的％加DC標(biāo)志CD11c染色決定。吸取iDC培養(yǎng)液100μl作無菌試驗(包括細(xì)菌和真菌培養(yǎng)，支原體，LPS檢驗)?？變?nèi)加入HBV抗原按5～100μg/ml的濃度加入HBsAg和HBcAg，置37℃、5％的CO2溫箱中培養(yǎng)4～6小時。
7.7天成熟的HBV特異性DC(mature DC，mDC)疫苗的收獲倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞，按照細(xì)胞狀態(tài)進行評分，包括細(xì)胞密度、細(xì)胞碎片、懸浮細(xì)胞的數(shù)量、大細(xì)胞的數(shù)量和樹枝狀突起的狀態(tài)。拍照記錄。取出10μl細(xì)胞懸液用臺盼藍(lán)染色，測定細(xì)胞存活比例，細(xì)胞計數(shù)。計算出第7天存活細(xì)胞分別占第0天收集的PBMC總數(shù)和貼壁細(xì)胞的比例，記錄。分別取對照組和抗原組1～5×105細(xì)胞懸液，離心，搜集上清，留-20℃冰箱(細(xì)胞因子可換算成/24小時/10000細(xì)胞)。細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞mDC表型(表型包括CD11c，CD14，CD80，CD86，CD1a，HLADR，CD40，CD83等)，mDC純度通過光散射角G1門中的％加DC標(biāo)志CD11c染色決定；細(xì)菌和真菌培養(yǎng)陰性、支原體、LPS檢驗陰性的HBcAg和HBsAg共同負(fù)載的成熟mDC即為HBV特異性DC疫苗。病人注射劑量為1～2×107/次，前臂皮下或淋巴結(jié)內(nèi)注射。
8.HBV特異性DC疫苗的凍存收集成熟的DC疫苗凍存，以備1周、2周、4周后加強免疫。按5×106/ml加入凍存液(含10％DMSO)，凍存管放入預(yù)冷的乙醇中，首先置于-20℃2～4小時，-80℃24小時，再置于液氮中凍存。
9.凍存的HBV特異性DC疫苗的復(fù)蘇分別在凍存后的1周、2周、4周將凍存的mDC解凍復(fù)蘇。凍存管由液氮中取出后直接放入37℃水浴中。一旦細(xì)胞懸液融化后馬上加入AIM-V(含1％AB血清)進行稀釋。稀釋液應(yīng)逐滴加入，并且輕輕地?fù)u動凍存管，使DMSO從mDC中釋放出來。否則，太快加入稀釋液，mDC細(xì)胞內(nèi)的DMSO由于其滲透壓會使水分很快滲入細(xì)胞，使mDC細(xì)胞腫漲裂解而死亡。用AIM-V培養(yǎng)基(含1％AB血清)洗滌3次，取出10μl細(xì)胞懸液用臺盼藍(lán)染色，測定細(xì)胞存活比例，細(xì)胞計數(shù)。計算存活細(xì)胞在凍存細(xì)胞中比例，記錄。吸取各組解凍的mDC 100ul作無菌試驗(包括細(xì)菌和真菌培養(yǎng)，支原體，LPS檢驗)。分別用解凍細(xì)胞進行①流式細(xì)胞儀測mDC表型；②mDC介導(dǎo)HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生；③混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)；④mDC介導(dǎo)自體T細(xì)胞分泌IFN-γ等實驗(自體T細(xì)胞與mDC同步凍存，在mDC解凍前兩天解凍培養(yǎng))。
對本發(fā)明的疫苗進行了以下效果觀察1.不同成熟階段的DC表型測定結(jié)果應(yīng)用以上技術(shù)方法可以有效誘導(dǎo)DC表型的成熟，這為HBV特異性DC疫苗的制備提供了技術(shù)保障，見表1。
表1成熟與未成熟DC的表型測定結(jié)果(％)

*與iDC組比較，p＜0.052.不同劑量HBV抗原負(fù)載后DC疫苗表型的變化應(yīng)用不同劑量的HBsAg、HBcAg負(fù)載DC的效果是不一樣的。但無論是HBsAg、HBcAg，當(dāng)劑量為20μg/ml時其促進DC成熟的作用強于10μg/ml的劑量，當(dāng)提高負(fù)載劑量時，并未能進一步提高DC的表型，故20μg/ml為最適宜的負(fù)載劑量，見表2。應(yīng)用20μg/ml劑量的HBsAg聯(lián)合HBcAg負(fù)載DC，其促進DC表型的功能均強于單獨應(yīng)用HBsAg和HBcAg，見表3。
表2不同劑量的HBsAg和HBcAg負(fù)載DC后表型的變化(％)

a與0μg/ml組比較，p＜0.05，b與10μg/ml組比較，p＜0.05
表3HBsAg和HBcAg單獨應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用對DC表型的影響(％)

a與No-Ag組比較，p＜0.05；b與HBsAg組比較，p＜0.05；c與HBcAg組比較，p＜0.053.HBV特異性DC疫苗誘導(dǎo)自體T細(xì)胞分泌IFN-γ不同抗原負(fù)載的HBV特異性DC疫苗誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力不一樣，見圖1，HBcAg或HBcAg聯(lián)合HBsAg負(fù)載的HBV特異性DC疫苗誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力要優(yōu)于HBsAg。
4.應(yīng)用HBV特異性DC疫苗的適應(yīng)癥對不同免疫狀態(tài)的病人研究結(jié)果如圖2。從結(jié)果可知，HBVDNA＞105copies/ml，并且ALT＞80U/L時，HBV特異性DC疫苗產(chǎn)生IL-12以及誘導(dǎo)自體T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力均強于ALT＜80U/L的病人，因此HBV特異性DC疫苗在免疫激活期病人應(yīng)用較為有效。
5.HBV特異性DC疫苗的特點HBcAg和HBsAg聯(lián)合負(fù)載的HBV特異性DC疫苗能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的自體T細(xì)胞中產(chǎn)生針對s181-193、c18-27表位的特異性CD8+T細(xì)胞。說明應(yīng)用HBV特異性DC疫苗可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對HBV的多克隆特異性CTL，更有利于HBV的清除，見圖3。
本發(fā)明的DC疫苗較其它疫苗有如下特點DC可采用患者自身的PBMC誘導(dǎo)而成，避免交叉感染，安全性好，同時也可用HLA配型相同的健康獻(xiàn)血者的PBMC誘導(dǎo)而成；HBV感染的病人由于DC功能的數(shù)量減少和功能的受損，不能有效提呈抗原，經(jīng)體外處理后可恢復(fù)或增強抗原提呈功能，且分泌細(xì)胞因子的功能增強，可有效激活機體的免疫狀態(tài)；另外DC在體外已經(jīng)過抗原的負(fù)載，抗原加工及提呈已完成，故可極大的提高疫苗的效率和免疫效果，有效地激活初始的T細(xì)胞和靜息狀態(tài)的記憶性T細(xì)胞，以及B細(xì)胞，少量DC疫苗即可誘發(fā)強烈的細(xì)胞免疫和體液免疫。本發(fā)明提供的疫苗不僅可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對HBsAg的細(xì)胞免疫反應(yīng)，還可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對HBcAg的免疫反應(yīng)，兩者結(jié)合，相互促進，具有協(xié)同作用，抗病毒效果優(yōu)于單純HBsAg負(fù)載的DC疫苗。由于血液來源充分，可大規(guī)模分離PBMC制備樹突狀細(xì)胞，通過體外誘導(dǎo)以及HBsAg和HBcAg負(fù)載后可獲得通用型HBV特異性DC疫苗，可供HLA配型相同廣大的CHB患者使用，應(yīng)用前景廣闊。


圖1不同類型的HBV特異性DC疫苗誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的結(jié)果圖2HBV特異性DC疫苗對不同免疫狀態(tài)T細(xì)胞的作用圖3HBV特異性DC疫苗誘導(dǎo)表位特異性CD8+T細(xì)胞的比例檢測結(jié)果(▲HBV-s183-191-specific CTL的頻率；●HBV-c18-27-specific CTL的頻率；■HBV-pol575-583-specific CTL的頻率)
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實施例1，制備1.HBsAg和HBcAg的來源HBsAg來源于重組(酵母)乙肝疫苗不加免疫佐劑的半成品。HBcAg來源于本室構(gòu)建的攜帶HBcAg全基因序列的質(zhì)粒PMM2066，在大腸桿菌中表達(dá)后分離純化而得。
2、0天PBMC的分離取外周抗凝血100ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC，用預(yù)冷的PBS將分離出的PBMC稀釋成20ml，分置于2個滅菌10ml離心管中，離心10分鐘，共兩次以去除細(xì)胞碎片和血小板，吸棄上清。將去除細(xì)胞碎片和血小板的PBMC再用PBS稀釋。在2個滅菌的離心管中加入預(yù)先恢復(fù)至室溫的淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋后的PBMC沿管壁輕輕加在淋巴細(xì)胞分離液液面上使形成界面，淋巴細(xì)胞分離液與稀釋PBMC的體積比為4∶6。離心20分鐘，由上至下分出稀釋液、PBMC帶、淋巴細(xì)胞分離液和紅細(xì)胞四條帶。收集界面單個核細(xì)胞于離心管中，用PBS稀釋至10ml，分別以1200rpm/10分鐘離心洗滌細(xì)胞3次。將細(xì)胞合并到一個10ml離心管，以無血清AIM-V培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞數(shù)為6×107，用臺盼藍(lán)染色測定細(xì)胞存活比例為99％，存活細(xì)胞總數(shù)約為6×107。調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/ml，鋪于6孔板中，每孔2.5ml，37℃、5％的CO2孵箱中溫育2小時，使單核細(xì)胞貼壁。
3、0天DC培養(yǎng)當(dāng)孵育結(jié)束時，首先用培養(yǎng)皿中的液體沖洗貼壁細(xì)胞，吸出上層未貼壁細(xì)胞，加入預(yù)熱的培養(yǎng)基，再沖洗2次，收集未貼壁細(xì)胞和大部分的貼壁(但可被沖洗下來)的淋巴細(xì)胞，計數(shù)為4×107。用含10％FCS的RPMA1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，加入維持劑量的IL-2(5～50U/ml)，于一潔凈培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每3天半量換液，并根據(jù)細(xì)胞狀況隨時調(diào)整培養(yǎng)基量，補加細(xì)胞因子，即為自體T淋巴細(xì)胞，待后續(xù)實驗用。剩余細(xì)胞加入預(yù)熱的AIM-V培養(yǎng)基，內(nèi)含GM-CSF(100～1000U/ml)、IL-4(500～2000U/ml)。倒置顯微鏡下觀察貼壁的單核細(xì)胞，按照細(xì)胞狀態(tài)評分為5分，拍照記錄。置37℃、5％的CO2溫箱中培養(yǎng)3天。
4、3天半量換液倒置顯微鏡下觀察DC細(xì)胞，按照細(xì)胞狀態(tài)進行評分為5分。收集每孔細(xì)胞于一個離心管中，及時在每孔中添加預(yù)熱的AIM-V培養(yǎng)液，以免貼壁細(xì)胞缺水干死。收集的細(xì)胞1200rpm/10分鐘離心，吸棄一半上層的舊培養(yǎng)液，補加入等量新鮮的含GM-CSF(100～1000U/ml)、IL-4(500～2000U/ml)的AIM-V培養(yǎng)液，置37℃、5％的CO2溫箱中培養(yǎng)。
5、5d半量換液倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，按照細(xì)胞狀態(tài)進行評分為5分。收集每孔的懸浮細(xì)胞，取出10μl細(xì)胞懸液用臺盼藍(lán)染色，測定DC細(xì)胞存活比例為95％，細(xì)胞計數(shù)5×107，半量換液，操作如3d半量換液。換液的細(xì)胞因子濃度減半(GM-CSF 50～500U/ml、IL-4 250～1000U/ml)。置37℃、5％的CO2溫箱中培養(yǎng)。
6、6天收集未成熟DC(immature DC，iDC)和抗原負(fù)載倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，按照細(xì)胞狀態(tài)進行評分為5分，吸取2×106細(xì)胞懸液，離心，搜集上清，留-20℃冰箱備測細(xì)胞因子IL-10、IL-12等，細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞iDC表型(表型包括CD11c，CD14，CD80，CD86，CD1a，HLADR，CD40，CD83等)。吸取iDC培養(yǎng)液100μl作無菌試驗(包括細(xì)菌和真菌培養(yǎng)，支原體，LPS檢驗)。孔內(nèi)加入HBV抗原按5～1000μg/ml的濃度加入HBsAg和HBcAg，置37℃、5％的CO2溫箱中培養(yǎng)6小時。
7、7天成熟的HBV特異性DC(mature DC，mDC)疫苗的收獲倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞，按照細(xì)胞狀態(tài)進行評分為5分，取出10μL細(xì)胞懸液用臺盼藍(lán)染色，測定細(xì)胞存活比例為95％，細(xì)胞計數(shù)為5.7×107。分別取對照組和抗原組2×106細(xì)胞懸液，離心，留上清-20℃冰箱保存。細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞mDC表型(表型包括CD11c，CD14，CD80，CD86，CD1a，HLADR，CD40，CD83等)。細(xì)菌和真菌培養(yǎng)陰性，支原體、LPS檢驗陰性的HBcAg和HBsAg共同負(fù)載的成熟mDC即為HBV特異性DC疫苗。
8、HBV特異性DC疫苗的凍存收集成熟的DC疫苗凍存，以備1周、2周、4周后加強免疫。按5×106/ml加入凍存液(含10％DMSO)2.0ml，分裝成10個凍存管凍存。凍存管先放入預(yù)冷的乙醇中，首先置于-20℃2～4小時，-80℃24小時，再置于液氮中凍存。
9、HBV特異性DC疫苗的復(fù)蘇分別在凍存后的1周、2周、4周將凍存的mDC解凍復(fù)蘇。復(fù)蘇時將1個凍存管由液氮中取出后直接放入37℃水浴中。一旦細(xì)胞懸液融化后馬上加入AIM-V(含1％AB血清)進行稀釋。用AIM-V培養(yǎng)基(含1％AB血清)洗滌3次，取出10μl細(xì)胞懸液用臺盼藍(lán)染色，測定細(xì)胞存活比例為85％，細(xì)胞計數(shù)4.5×106。吸取復(fù)蘇后的mDC 100ul作無菌試驗(包括細(xì)菌和真菌培養(yǎng)，支原體，LPS檢驗)。分別用復(fù)蘇細(xì)胞進行如下實驗(1)流式細(xì)胞儀測mDC表型復(fù)蘇后HBV特異性DC疫苗取6×105的量，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的表型。結(jié)果見表4。從表4可知凍存后1周、2周和4周表型DC的表型幾乎無改變，說明凍存4周內(nèi)對DC疫苗的表型無影響，保證的疫苗的質(zhì)量。
表4HBV特異性DC疫苗在不同時間復(fù)蘇后的表型檢測(％)

(2)mDC誘導(dǎo)HBV特異性CD8+T細(xì)胞的產(chǎn)生將復(fù)蘇HBV特異性DC疫苗與自體T細(xì)胞(自體T細(xì)胞與mDC同步凍存，在DC疫苗復(fù)蘇前兩天復(fù)蘇培養(yǎng))按1∶20混合培養(yǎng)7天后用Tetramer檢測T細(xì)胞中HBV特異性CD8+T細(xì)胞的比例，3次復(fù)蘇的結(jié)果混合培養(yǎng)之前，T細(xì)胞含特異性HBV-c18-27CD8+T細(xì)胞的比例均由0.01％上升到培養(yǎng)后的0.13％、0.15％、0.12％，特異性HBV-s183-191CD8+T細(xì)胞的比例由0.01％上升到培養(yǎng)后的0.08％、0.10％、0.09％，因此HBV特異性DC疫苗可誘導(dǎo)T細(xì)胞中HBV特異性CTL的產(chǎn)生。
(3)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)復(fù)蘇后的DC疫苗經(jīng)絲裂霉素C滅活后按1∶25的比例與自體T細(xì)胞(自體T細(xì)胞與DC疫苗同步復(fù)蘇，在DC疫苗復(fù)蘇前兩天解凍培養(yǎng))混合培養(yǎng)，同時取相同數(shù)量的T細(xì)胞不加DC疫苗作為對照進行培養(yǎng)，4天后應(yīng)用細(xì)胞增殖檢測試劑盒(美國Promega公司產(chǎn)品)檢測細(xì)胞的增殖情況，3次結(jié)果為經(jīng)DC疫苗刺激的T細(xì)胞數(shù)量是未用DC疫苗刺激的T細(xì)胞數(shù)量的1.5倍、1.7倍和1.6倍。說明經(jīng)HBV特異性DC疫苗刺激后可明顯促進T細(xì)胞的增殖。
(4)HBV特異性DC疫苗誘導(dǎo)自體T細(xì)胞分泌IFN-γ取復(fù)蘇后的HBV特異性DC疫苗2×104的量與T細(xì)胞按1∶12.5的比例(T細(xì)胞數(shù)為2.5×105)在ELISpot檢測系統(tǒng)的96孔培養(yǎng)板中進行混合培養(yǎng)，以不與DC疫苗混合培養(yǎng)的相同數(shù)量的T細(xì)胞作為對照，48小時后檢測分泌IFN-γ細(xì)胞的頻率。3次復(fù)蘇后實驗的結(jié)果為，經(jīng)HBV特異性DC疫苗刺激的T細(xì)胞分泌IFN-γ細(xì)胞的數(shù)量分別為35、31和38，而不經(jīng)DC疫苗刺激的T細(xì)胞分泌IFN-γ細(xì)胞的數(shù)量分別為11、9和10。說明HBV特異性DC疫苗可誘導(dǎo)分泌IFN-γ的細(xì)胞產(chǎn)生，從而增強對病毒的抑制作用。
實施例2注射劑的制備取實施例1步驟7或9得到的疫苗按以下配方溶解在注射用水中，按照常規(guī)技術(shù)制備成注射液。
疫苗 1×107氯化鉀 0.04mg磷酸二氫鉀 0.04mg氯化鈉 1.6mg磷酸氫二鈉.7H2O0.432mg用蒸餾水配制成終體積為200μl注射液。
權(quán)利要求
1.一種HBV特異性DC疫苗，其特征在于，所述疫苗是用HBsAg和HBcAg負(fù)載單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞，使該樹突狀細(xì)胞負(fù)載抗原并培養(yǎng)成熟后得到的。
2.權(quán)利要求1的疫苗，其特征在于，所述致敏的單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞是用HBsAg和HBcAg共同負(fù)載未成熟的moDC。
3.權(quán)利要求2的疫苗，其特征在于，所述負(fù)載未成熟的moDC是在未成熟的moDC細(xì)胞液中加入5～100μg/ml的濃度的HBsAg和HBcAg，共同孵育。
4.權(quán)利要求3的疫苗，其特征在于，所述共同孵育時間為12～48小時。
5.權(quán)利要求4的疫苗，其特征在于，共同孵育后得到的成熟的致敏的樹突狀細(xì)胞即權(quán)利要求1的疫苗。
6.含有權(quán)利要求5的疫苗的疫苗制劑。
7.權(quán)利要求6的疫苗制劑是注射劑。
8.權(quán)利要求7的疫苗的制備方法，其特征在于，經(jīng)過用HBsAg和HBcAg共同負(fù)載未成熟的moDC的步驟。
9.權(quán)利要求8的制備方法，其特征在于，經(jīng)過以下步驟1)HBsAg和HBcAg的獲得HBsAg來源于重組乙肝疫苗不加免疫佐劑的半成品，HBcAg來源于本室構(gòu)建的攜帶HBcAg全基因序列的質(zhì)粒PMM2066，在大腸桿菌中表達(dá)后分離純化而得；2)0天PBMC的分離取外周抗凝血50～100ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS稀釋成15～20ml，分置于2個滅菌10ml離心管中，離心10分鐘，離心兩次以去除細(xì)胞碎片和血小板，吸棄上清；將去除細(xì)胞碎片和血小板的PBMC用PBS稀釋；在2個滅菌的離心管中加入預(yù)先恢復(fù)至室溫的淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋后的PBMC沿管壁輕輕加在淋巴細(xì)胞分離液液面上使形成界面，淋巴細(xì)胞分離液與稀釋PBMC的體積比為4∶6；離心20分鐘，由上至下分出稀釋液、PBMC帶、淋巴細(xì)胞分離液和紅細(xì)胞四條帶；收集界面單個核細(xì)胞于離心管中，用PBS稀釋至10～20ml，分別以1200rpm/10分鐘離心洗滌細(xì)胞2～3次；鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，如果細(xì)胞碎片和血小板較多，1200rpm/8分鐘再洗一次；將細(xì)胞合并到一個10ml離心管，以無血清AIM-V培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞濃度，用臺盼藍(lán)染色測定細(xì)胞存活比例，計算存活細(xì)胞總數(shù)，做好記錄；調(diào)整細(xì)胞濃度至2～5×106/ml，鋪于6孔板中，每孔2～3ml，37℃、5％的CO2孵箱中溫育1～2小時，使單核細(xì)胞貼壁；3)0天DC培養(yǎng)當(dāng)孵育結(jié)束時，首先用培養(yǎng)皿中的液體沖洗貼壁細(xì)胞，吸出上層未貼壁細(xì)胞，加入預(yù)熱的培養(yǎng)基，再沖洗2次，以去除未貼壁細(xì)胞和大部分的貼壁的淋巴細(xì)胞；未洗盡的淋巴細(xì)胞比單核細(xì)胞小而圓亮；拍照記錄；置37℃、5％的CO2溫箱中培養(yǎng)3天；未貼壁細(xì)胞約占PBMC的50～80％，用含10％小牛血清的RPMA1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1～3×106/ml，加入維持劑量的IL-2，于一潔凈培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每3天半量換液，并根據(jù)細(xì)胞狀況隨時調(diào)整培養(yǎng)基量，補加細(xì)胞因子，即為自體T淋巴細(xì)胞，待后續(xù)實驗用；貼壁細(xì)胞數(shù)量＝總PBMC-總未貼壁細(xì)胞數(shù)，記錄；沖洗時，用吸管上下吹吸幾次，輕輕振蕩培養(yǎng)皿；接著面向操作者傾斜培養(yǎng)皿，吸盡培養(yǎng)基；當(dāng)吸下面的液體時，滴管頭懸在液體中，沿培養(yǎng)皿四周邊移動滴管邊吸，不要用吸管刮培養(yǎng)皿的底面；按此法，吸出每個培養(yǎng)皿內(nèi)的液體；整個操作過程要迅速，以免細(xì)胞在洗滌過程中缺水干死；加入預(yù)熱的AIM-V培養(yǎng)基，內(nèi)含GM-CSF、IL-4；倒置顯微鏡下觀察貼壁的單核細(xì)胞，按照細(xì)胞狀態(tài)進行評分，由最差到最好劃分標(biāo)準(zhǔn)并評分0～5分；觀察的指標(biāo)包括細(xì)胞密度、細(xì)胞碎片、懸浮細(xì)胞的數(shù)量、大細(xì)胞的數(shù)量和樹枝狀突起的狀態(tài)；4)3天半量換液倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，按照細(xì)胞狀態(tài)進行評分，由最差到最好劃分標(biāo)準(zhǔn)并評分0～5分；觀察的指標(biāo)包括細(xì)胞密度、細(xì)胞碎片、懸浮細(xì)胞的數(shù)量、大細(xì)胞的數(shù)量和樹枝狀突起的狀態(tài)；拍照記錄；收集每孔細(xì)胞于一個離心管中，及時在每孔中添加預(yù)熱的AIM-V培養(yǎng)液，以免貼壁細(xì)胞缺水干死；收集的細(xì)胞1200rpm/10分鐘離心，吸棄一半上層的舊培養(yǎng)液，補加入等量新鮮的含GM-CSF、IL-4的AIM-V培養(yǎng)液；置37℃、5％的CO2溫箱中培養(yǎng)；5)5天半量換液倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，按照細(xì)胞狀態(tài)進行評分，由最差到最好劃分標(biāo)準(zhǔn)并評分0～5分；觀察的指標(biāo)包括細(xì)胞密度、細(xì)胞碎片、懸浮細(xì)胞的數(shù)量、大細(xì)胞的數(shù)量和樹枝狀突起的狀態(tài)；拍照記錄；收集每孔的懸浮細(xì)胞，取出10μl細(xì)胞懸液用臺盼藍(lán)染色，測定DC細(xì)胞存活比例，細(xì)胞計數(shù)；計算出第5天存活的DC細(xì)胞占第0天收集貼壁細(xì)胞總數(shù)的比例，記錄；半量換液，操作如3天半量換液；換液的細(xì)胞因子濃度減半；置37℃、5％的CO2溫箱中培養(yǎng)；6)6天收集未成熟DC和抗原負(fù)載倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，按照細(xì)胞狀態(tài)進行評分，包括細(xì)胞密度、細(xì)胞碎片、懸浮細(xì)胞的數(shù)量、大細(xì)胞的數(shù)量和樹枝狀突起的狀態(tài)；拍照記錄；然后吸取2～5×105細(xì)胞懸液，離心，搜集上清，留-20℃冰箱備測細(xì)胞因子IL-10、IL-12等，因子濃度可換算成/24小時/10000細(xì)胞，以利于比較；細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞iDC表型，iDC純度通過光散射角G1門中的％加DC標(biāo)志CD11c染色決定；吸取iDC培養(yǎng)液100μl作無菌試驗；孔內(nèi)加入HBV抗原按5～100μg/ml的濃度加入HBsAg和HBcAg，置37℃、5％的CO2溫箱中培養(yǎng)4～6小時；7)7天成熟的HBV特異性DC疫苗的收獲倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞，按照細(xì)胞狀態(tài)進行評分，包括細(xì)胞密度、細(xì)胞碎片、懸浮細(xì)胞的數(shù)量、大細(xì)胞的數(shù)量和樹枝狀突起的狀態(tài)；拍照記錄；取出10μl細(xì)胞懸液用臺盼藍(lán)染色，測定細(xì)胞存活比例，細(xì)胞計數(shù)；計算出第7天存活細(xì)胞分別占第0天收集的PBMC總數(shù)和貼壁細(xì)胞的比例，記錄；分別取對照組和抗原組1～5×105細(xì)胞懸液，離心，搜集上清，留-20℃冰箱；細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞mDC表型，mDC純度通過光散射角G1門中的％加DC標(biāo)志CD11c染色決定；細(xì)菌和真菌培養(yǎng)陰性、支原體、LPS檢驗陰性的HBcAg和HBsAg共同負(fù)載的成熟mDC即為HBV特異性DC疫苗；病人注射劑量為1～2×107/次，前臂皮下或淋巴結(jié)內(nèi)注射；8)HBV特異性DC疫苗的凍存收集成熟的DC疫苗凍存，以備1周、2周、4周后加強免疫；按5×106/ml加入凍存液，凍存管放入預(yù)冷的乙醇中，首先置于-20℃2～4小時，-80℃24小時，再置于液氮中凍存；9)凍存的HBV特異性DC疫苗的復(fù)蘇分別在凍存后的1周、2周、4周將凍存的mDC解凍復(fù)蘇；凍存管由液氮中取出后直接放入37℃水浴中；一旦細(xì)胞懸液融化后馬上加入AIM-V進行稀釋；稀釋液應(yīng)逐滴加入，并且輕輕地?fù)u動凍存管，使DMSO從mDC中釋放出來；否則，太快加入稀釋液，mDC細(xì)胞內(nèi)的DMSO由于其滲透壓會使水分很快滲入細(xì)胞，使mDC細(xì)胞腫漲裂解而死亡；用AIM-V培養(yǎng)基洗滌3次，取出10μl細(xì)胞懸液用臺盼藍(lán)染色，測定細(xì)胞存活比例，細(xì)胞計數(shù)；計算存活細(xì)胞在凍存細(xì)胞中比例，記錄；吸取各組解凍的mDC 100ul作無菌試驗；分別用解凍細(xì)胞進行①流式細(xì)胞儀測mDC表型；②mDC介導(dǎo)HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生；③混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)；④mDC介導(dǎo)自體T細(xì)胞分泌IFN-γ等實驗。
10.權(quán)利要求9的疫苗在制備用于誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對HBsAg和HBcAg的特異性免疫反應(yīng)的疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種HBsAg和HBcAg共負(fù)載的乙肝特異性DC疫苗，該疫苗是用重組乙型肝炎病毒表面抗原和重組乙肝病毒核心抗原同時負(fù)載單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞，使該樹突狀細(xì)胞得以負(fù)載抗原而成熟從而制成的HBV特異性DC疫苗。
文檔編號A61P31/00GK1981866SQ200610078028
公開日2007年6月20日 申請日期2006年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月30日
發(fā)明者王福生, 施明, 金磊, 陳威巍 申請人:解放軍三○二醫(yī)院生物治療研究中心