專利名稱：一種將木糖異構(gòu)酶基因用于花生遺傳轉(zhuǎn)化的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及花生分子育種領(lǐng)域，具體涉及一種將木糖異構(gòu)酶基因用于花生遺傳轉(zhuǎn)化的篩選方法。
背景技術(shù)：
花生是我國重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，在農(nóng)業(yè)乃至整個國民經(jīng)濟(jì)中均具有重要地位。然而，由于花生栽培種遺傳基礎(chǔ)狹窄、抗逆性差，尤其易感多種病蟲害，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來改進(jìn)花生栽培種受到研究者的廣泛重視。而在花生遺傳轉(zhuǎn)化過程中利用抗生素類基因和抗除草劑類基因進(jìn)行篩選，有可能會對環(huán)境及人類健康產(chǎn)生不良影響和損害。因此，利用無爭議的生物安全標(biāo)記基因來構(gòu)建表達(dá)載體，便逐漸成為新的研究熱點(diǎn)。木糖是半纖維素的主要組成部分，自然界中存在著某些利用木糖的絲狀真菌、酵母菌和細(xì)菌，但是許多植物細(xì)胞不能利用木糖，所以難以將木糖基因等安全標(biāo)記基因用于植物中以篩選轉(zhuǎn)化體。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中花生遺傳轉(zhuǎn)化過程中利用抗生素類基因和抗除草劑類基因進(jìn)行篩選存在的缺陷和不足，本發(fā)明提供了一種將木糖異構(gòu)酶基因用于花生遺傳轉(zhuǎn)化的篩選方法。本發(fā)明構(gòu)建了含有xylA基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-xylA，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化花生胚小葉外植體，在添加了蔗糖(5g/L)和木糖(10g/L)的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，誘導(dǎo)成苗率達(dá)15. 25%，轉(zhuǎn)基因陽性率達(dá)到77. 27%。本發(fā)明避免了利用抗生素篩選可能造成的安全隱患，而且轉(zhuǎn)化效率高，是一種安全、高效的篩選方法。為達(dá)到解決上述技術(shù)問題的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn) 一種將木糖異構(gòu)酶基因用于花生遺傳轉(zhuǎn)化的篩選方法，它包括以下步驟
(1)將目的基因插入到含木糖異構(gòu)酶基因xylA的植物表達(dá)載體中，構(gòu)建含有目的基因的重組載體；
(2)將重組載體轉(zhuǎn)化花生胚小葉外植體；
(3)將轉(zhuǎn)化后胚小葉外植體轉(zhuǎn)移到添加有蔗糖和木糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，4飛周后誘導(dǎo)出體胚；
(4)將體胚轉(zhuǎn)移到添加有蔗糖和木糖的萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，Γ5個月后誘導(dǎo)成
苗；
(5)對再生苗進(jìn)行PCR檢測，獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株；
(6)將轉(zhuǎn)基因陽性植株通過嫁接方法移栽田間。對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述步驟(1)中植物表達(dá)載體為pCAMBIA1301-xylA。對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述步驟O)中利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將重組載體轉(zhuǎn)化花生胚小葉外植體。對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述步驟(3)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含有5g/L蔗糖、10g/L木糖、10mg/L 2，4-D的MS-B5培養(yǎng)基。對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述步驟中萌發(fā)培養(yǎng)基是含有5g/L蔗糖、10g/L 木糖、％ig/L BAP的MS-B5培養(yǎng)基。對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述步驟C3)和(4)中的培養(yǎng)條件為25°C、30001x、每日光照1池。對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述步驟(5)中PCR檢測的xylA基因引物為 上游引物為 5 ‘ -CTCGAGATGGAGTTCAATATGCAAGCCTA-3 ‘，
下游引物為 5 ‘ -CTCGAGATTATTTGTCGAACAGATAATGGTTT-3 ‘。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是
1、本發(fā)明所述將木糖異構(gòu)酶基因用于花生遺傳轉(zhuǎn)化的篩選方法，使用添加了蔗糖(5g/ L)和木糖(10g/L)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化體在木糖異構(gòu)酶基因xylA的催化下能將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖，再經(jīng)過磷酸戊糖途徑分解代謝，為細(xì)胞生長所利用，在以木糖為主要碳源的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化細(xì)胞因能利用木糖而呈現(xiàn)優(yōu)勢生長，非轉(zhuǎn)化體則因碳源供應(yīng)不足而使生長受到抑制不能成苗。因此可以篩選出轉(zhuǎn)化體，避免了使用抗生素進(jìn)行篩選可能造成的安全隱
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)Qi、O2、在添加蔗糖(5g/L)和木糖(10g/L)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)成苗率達(dá)15. 25%， 所得到的再生植株經(jīng)PCR檢測陽性率高達(dá)77. 27%，是一種安全、高效的篩選方法。


圖1是本發(fā)明中花生胚小葉外植體在添加蔗糖(10g/L)的培養(yǎng)基上的生長情況。圖2是本發(fā)明中花生胚小葉外植體在添加蔗糖(5g/L)的培養(yǎng)基上的生長情況。圖3是本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因植株在添加蔗糖(5g/L)和木糖(10g/L)的培養(yǎng)基上篩選后的PCR檢測結(jié)果。圖4是本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因再生植株嫁接移栽田間生長情況。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1、建立將木糖異構(gòu)酶基因用于花生遺傳轉(zhuǎn)化的篩選方法 l、xylA基因的克隆
根據(jù)GenBank中xylA基因序列(登錄號No. X04691)設(shè)計引物，并在引物5 ‘末端添加 Xho I酶切位點(diǎn)(斜體部分)
上游引物為 5 ‘ -C7TG^ATGGAGTTCAATATGCAAGCCTA-3 ‘， 下游引物為 5 ‘ -C7TG^ATTATTTGTCGAACAGATAATGGTTT-3 ‘。以大腸桿菌DH-5 α菌株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增xylA基因并將其克隆到pMDIS-T載體(購自寶生物大連工程有限公司)上，得到T-xylA重組質(zhì)粒。2、植物表達(dá)載體pCAMBIA1301_xylA的構(gòu)建
用損ο I酶切PCAMBIA1301質(zhì)粒(購自上海希匹吉生物技術(shù)有限公司)，去掉潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hygromycin-B-phosphotransferase, Hpt), M Xho I 酶切 T-xylA 重組質(zhì)粒，切下xylA基因片段?；厥誴CAMBIA1301質(zhì)粒大片段和xylA基因小片段，用 T4 DNA連接酶將xylA片段連接到切除Hpt基因的pCAMBIA1301質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒 pCAMBIA1301-xylA。3、將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化花生，包括以下步驟
a、農(nóng)桿菌重組菌株的制備、活化及菌液制備將pCAMBIA1301-xylA重組質(zhì)粒利用液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105 (購自北京天恩澤基因科技有限公司)感受態(tài)細(xì)胞，篩選出含有重組質(zhì)粒的重組菌株。挑取重組菌株單菌落，接種到Y(jié)EB (利福平50mg/L，卡那霉素 50mg/L)液體培養(yǎng)基中，280C、180rpm培養(yǎng)至OD6tltl=O. 5 0. 8時，取2mL菌液轉(zhuǎn)移到50mL YEB (利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到OD6tltl=O. 6、. 8。將菌液于5000rpm離心15min后，用相同體積的液體MS-B5懸浮備用。b、花生胚小葉外植體的分離將連同胚軸的花生胚小葉切下，在70%乙醇中浸泡 l(T20s，0. 1%升汞中浸泡8min，無菌水沖洗后浸泡過夜，次日將胚軸切去分離出胚小葉， 放入MS-民培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3天，培養(yǎng)條件為25°C、30001x、每日光照13h。C、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將預(yù)培養(yǎng)3天后的胚小葉外植體浸于已備好的農(nóng)桿菌菌液中J8°C、90rpm溫和震蕩侵染15min。用無菌濾紙將殘留菌液吸干，接種到MSi5培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)移到添加羧芐青霉素(500mg/L)的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS-B5，添加 10mg/L 2，4-D)中培養(yǎng)，約4 5周后誘導(dǎo)出體胚。培養(yǎng)條件為25°C、30001x、每日光照13h。4、木糖篩選體系的建立，包括以下步驟
a、基本培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件培養(yǎng)基為MS-B5,添加不同濃度的蔗糖/木糖濃度比、0. 8% 瓊脂，？11為5.8，在121°C、105Kpa條件下滅菌20min。培養(yǎng)條件為25°C、30001x、每日光照 13h。b、最適蔗糖濃度的確定取花生品種“花育22”成熟種子M粒，分為4組，每組6 粒。分離胚小葉外植體(方法同上)，0. 1%升汞消毒lOmin，然后轉(zhuǎn)移到MS^5培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，蔗糖濃度分別為5g/L，10g/L，20g/L，30g/L。培養(yǎng)4 5個月后進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明當(dāng)蔗糖濃度在10g/L及以上濃度時，外植體可以分化成苗(如圖1所示)；當(dāng)蔗糖濃度為5g/ L時，外植體停留在體胚階段，不能分化成苗(如圖2所示)。所以最終確定5g/L為蔗糖最低臨界濃度。C、最適木糖濃度的確定利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-xylA轉(zhuǎn)化花生胚小葉外植體，然后轉(zhuǎn)移到添加了蔗糖(5g/L)和不同濃度木糖(5 g/L, 10 g/L，20 g/ L,30g/L)的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。誘導(dǎo)出的體胚轉(zhuǎn)到添加了蔗糖(5g/L)和不同濃度木糖(5 g/L, 10 g/L, 20 g/L，30g/L)的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，約4飛個月誘導(dǎo)成苗后進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果如表1所示，隨著木糖濃度的升高，誘導(dǎo)成苗率有所下降；當(dāng)木糖濃度為5g/L時，誘導(dǎo)成苗率最高(17. M%)，但植株生長較弱；當(dāng)木糖濃度為10g/L時，誘導(dǎo)成苗率較高(15. 25%)，植株生長健壯，且嫁接成活率高；所以最終確定10g/L為最適木糖濃度。表1 不同木糖濃度下外植體的成苗率及再生苗生長情況
權(quán)利要求
1.一種將木糖異構(gòu)酶基因用于花生遺傳轉(zhuǎn)化的篩選方法，其特征在于它包括以下步驟(1)將目的基因插入到含木糖異構(gòu)酶基因XylA的植物表達(dá)載體中，構(gòu)建含有目的基因的重組載體；(2)將重組載體轉(zhuǎn)化花生胚小葉外植體；(3)將轉(zhuǎn)化后胚小葉外植體轉(zhuǎn)移到添加有蔗糖和木糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，4飛周后誘導(dǎo)出體胚；(4)將體胚轉(zhuǎn)移到添加有蔗糖和木糖的萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，Γ5個月后誘導(dǎo)成苗；(5)對再生苗進(jìn)行PCR檢測，獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株；(6)將轉(zhuǎn)基因陽性植株通過嫁接方法移栽田間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種將木糖異構(gòu)酶基因用于花生遺傳轉(zhuǎn)化的篩選方法，其特征在于所述步驟(1)中植物表達(dá)載體為pCAMBIA1301-xylA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種將木糖異構(gòu)酶基因用于花生遺傳轉(zhuǎn)化的篩選方法，其特征在于所述步驟O)中利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將重組載體轉(zhuǎn)化花生胚小葉外植體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種將木糖異構(gòu)酶基因用于花生遺傳轉(zhuǎn)化的篩選方法，其特征在于所述步驟C3)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含有5g/L蔗糖、10g/L木糖、10mg/L 2，4_D的MS-B5 培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種將木糖異構(gòu)酶基因用于花生遺傳轉(zhuǎn)化的篩選方法，其特征在于所述步驟(4)中萌發(fā)培養(yǎng)基是含有5g/L蔗糖、10g/L木糖、％ig/L BAP的MS-民培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種將木糖異構(gòu)酶基因用于花生遺傳轉(zhuǎn)化的篩選方法， 其特征在于所述步驟(3)和中的培養(yǎng)條件為25°C、30001x、每日光照13h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種將木糖異構(gòu)酶基因用于花生遺傳轉(zhuǎn)化的篩選方法，其特征在于所述步驟(5)中PCR檢測的xylA基因引物為上游引物為 5 ‘ -CTCGAGATGGAGTTCAATATGCAAGCCTA-3 ‘， 下游引物為 5 ‘ -CTCGAGATTATTTGTCGAACAGATAATGGTTT-3 ‘。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種將木糖異構(gòu)酶基因用于花生遺傳轉(zhuǎn)化的篩選方法，它包括構(gòu)建含有目的基因的重組載體；將重組載體轉(zhuǎn)化花生胚小葉外植體；將轉(zhuǎn)化后胚小葉外植體轉(zhuǎn)移到添加有蔗糖和木糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，直至誘導(dǎo)出體胚；將體胚轉(zhuǎn)移到萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，直至誘導(dǎo)成苗；對再生苗進(jìn)行PCR檢測，獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株；將轉(zhuǎn)基因陽性植株通過嫁接方法移栽田間。本發(fā)明使用添加了5g/L的蔗糖和10g/L的木糖的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，非轉(zhuǎn)化體由于不能利用木糖生長受到抑制不能成苗，轉(zhuǎn)化體由于能夠利用木糖可以再生成苗，因此可以篩選出轉(zhuǎn)基因植株，避免了使用抗生素進(jìn)行篩選可能造成的安全隱患；轉(zhuǎn)化效率高，是一種安全、高效的篩選方法。
文檔編號C12N15/82GK102433354SQ201110361128
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月15日
發(fā)明者丁霄, 喬利仙, 劉文平, 王晶珊, 隋炯明 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)