專利名稱：一種魚蛋白水解螯合物制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種水解螯合物的制備方法，尤其涉及一種魚蛋白水解螯合物的制備方法。
背景技術：
蛋白質(zhì)水解物中的小分子多肽可由腸道直接吸收消化，可作為腸道營養(yǎng)劑或以流質(zhì)食物形式提供給需要人群，因此蛋白質(zhì)水解物在醫(yī)藥、保健食品中有廣泛的應用。因此，也一直都是營養(yǎng)研究的重要課題。蛋白質(zhì)經(jīng)酶催化等方法水解得到的產(chǎn)物稱為水解蛋白或蛋白水解物(Protein hydrolysate)。前一個時期對蛋白水解物的開發(fā)研究主要停留在乳蛋白、大豆蛋白、蛋清蛋白等種類，其中以乳蛋白水解物和活性肽的研究開發(fā)最為深入。近年來，有關動物源性水解蛋白 和活性肽的產(chǎn)品研究和開發(fā)日益受到重視，如畜血、水產(chǎn)蛋白等方面文章不斷有報道。因為我國海洋生物資源蘊藏量十分豐富，其中海洋蛋白資源種類尤其繁多，由于海洋環(huán)境不同于陸地環(huán)境，為適應某些極端生存環(huán)境，構成海洋生物的蛋白無論在氨基酸組成成分上還是在氨基酸排列順序上都與陸生動植物源蛋白有很大不同。因而向海洋進軍，索取海洋藥物食物、功能蛋白和特殊活性物質(zhì)，已成為世界各沿海國家海洋開發(fā)的一項重要內(nèi)容。長期以來，帶魚(產(chǎn)量在100萬噸以上)由于市場價格低、加工技術水平和回收手段落后，其中很大一部分被直接切碎，只是用于簡單加工的養(yǎng)殖餌料魚粉，造成產(chǎn)品價值利用率低，經(jīng)濟效益不高，資源浪費嚴重等現(xiàn)象，同時由于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、氨基酸、活性礦物質(zhì)等大量營養(yǎng)成分流失，更造成了環(huán)境的污染。近年來，魚類資源的匱乏越來越引起人們的關注，而大量的魚類下腳料因加工性能差而被拋棄，浪費了大量的蛋白源。同時海洋魚類蛋白質(zhì)產(chǎn)生于特殊的地理環(huán)境，所含氨基酸比值與人的肌肉成分又極為接近，對于人體吸收利用而言其品位極高，因而開發(fā)魚蛋白水解物和分離物引起了人們的廣泛興趣。因此，必須開展魚類資源特別是帶魚的精深加工，為提高其利用價值和經(jīng)濟價值尋找新的途徑。中國專利公告號CN 1883289A,
公開日2006年12月27日，發(fā)明名稱為淡水魚蛋白活性多肽水解液的制備方法，該申請案公開了一種淡水魚蛋白活性多肽水解液的制備方法，通過添加動物蛋白復合酶、風味酶進行水解，加入酵母菌和乳酸菌發(fā)酵等五次去腥工藝流程，既可以徹底祛除水解液的腥味、苦味，又使該水解液具備了普通魚蛋白水解液沒有的特殊香味和口感。其不足之處為，適用于淡水魚，制的的水解液抗氧化性，抗菌低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術中對于海水魚下腳料利用少，水解液抗氧化性，抗菌低的缺陷，以提供了一種同時具有抗氧化性、抗菌和鐵強化作用的魚蛋白水解螯合物的制備方法。本發(fā)明主要是通過下述技術方案得以解決上述技術問題的
一種魚蛋白水解螯合物的制備方法，所述的制備方法步驟如下a)原料處理帶魚下腳料，去頭、去尾、去骨，留取魚肉以作備用；
b)前處理用清水將步驟a所得的魚肉洗凈，浙干水分，切碎后室溫條件下勻漿，冷凍貯藏；
c)復合酶水解將步驟b所得魚肉漿按2-5倍重量比加入去離子水，調(diào)節(jié)pH為6-7，加入復合酶，溫度40-50°C水解，復合酶的重量百分比為魚肉漿的O. 2%-0. 8%，水解I. 5-6小時，水解結束后于沸水中保持8-15min滅酶，冷卻后抽濾，再離心過濾，最后超濾膜過濾水解液去除分子量低于IOkDa的水解產(chǎn)物，收集超濾水解液于4°C條件下儲存；
d)多肽螯合物制備將步驟c所得超濾水解液調(diào)整PH7-8.3，按重量向40-50份超濾水解液中緩慢加入I份質(zhì)量分數(shù)為1%_3%的FeC12溶液，在溫度20_30°C，螯合反應20-30分鐘，螯合反應結束后，對螯合物進行過濾，得到初級螯合沉淀物與初級濾液，之后對初級濾液進行無水乙醇分級梯度沉淀得到次級螯合沉淀物，將以上無水乙醇分級梯度沉淀所得的螯合沉淀物與第一次沉淀所得的初級螯合沉淀物合并40-60°C下干燥3-5h，得到魚蛋白水 解螯合物。作為優(yōu)選，所述復合酶由風味酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶兩種以上組成，風味酶的酶活力為40萬U/克,木瓜蛋白酶的酶活力為200萬U/克，中性蛋白酶的酶活力為10萬
U/克。作為優(yōu)選，所述復合酶中風味酶、木瓜蛋白酶酶、中性蛋白酶重量比為I :3 :2。作為優(yōu)選，步驟b中勻漿所用儀器轉(zhuǎn)速為2000 -3000r/min。作為優(yōu)選，所述步驟d中無水乙醇分級梯度沉淀分為3級，乙醇的質(zhì)量百分濃度分別為 60%、80%、95%。該制備工藝為
原料一前處理一酶解一按比例加入金屬一攪拌一調(diào)節(jié)pH —震蕩合成一離心分離一無水乙醇洗滌一分級沉淀一抽濾一鼓風干燥一多肽-Fe2+螯合物成品。其中，步驟c中抽濾是為了去除水解產(chǎn)物中碎魚骨和魚刺，離心過濾是為了去除魚油和未水解的魚肉。步驟d，將步驟c所得超濾水解液調(diào)整PH7-8. 3，按重量比向45份超濾水解液中緩慢加入I份質(zhì)量分數(shù)為1%_4%的FeC12溶液，在溫度20_30°C，20-30分鐘進行螯合反應，螯合反應結束后，對螯合物進行過濾，得到初級螯合沉淀物A和初級濾液，之后對初級濾液進行乙醇分級梯度沉底，在室溫下加入無水乙醇，使其質(zhì)量百分濃度達到60%，沉淀后離心10min獲得2級螯合物沉淀B和次級濾液；向次級濾液中繼續(xù)加入無水乙醇，使其質(zhì)量百分濃度達到80%，離心10 min獲得3級螯合物沉淀C和三級濾液；最后向三級濾出液中繼續(xù)添加無水乙醇，使得其質(zhì)量百分濃度達到95%以上，室溫下靜置20 min，產(chǎn)生懸浮物和沉淀，對此體系進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮，可得4級螯合物沉淀D ;將以上I一4級螯合物沉淀于真空條件下(O. I MPa) 45°C烘干4h后，置于硅膠干燥器保存?zhèn)溆?。其中，風味酶是外切酶，具有消除苦味的作用，能水解酪蛋白，彈性蛋白，膠原蛋白，類粘蛋白和粘蛋白等；木瓜蛋白酶是蛋白內(nèi)切酶，水解能力強，作用時間長，且價格低；中性蛋白酶是由枯草芽孢桿菌經(jīng)發(fā)酵提取而得的，屬于一種內(nèi)切酶，可用于各種蛋白質(zhì)水解處理，在一定溫度、PH值下，能將大分子蛋白質(zhì)水解為氨基酸等產(chǎn)物，可廣泛應用于動植物蛋白的水解，價格適中，水解度高。
其中，按照標準方法測定原料的各成分
水分常壓直接干燥法
總灰分總灰分測定方法 粗脂肪索氏抽提法 粗蛋白微量凱氏定氮法 非蛋白氮微量凱氏定氮法 總糖蒽酮比色法 鐵含量鄰兩氮菲法 鈣含量=EDTA滴定法 α -氨基氮電位滴定法。亞鐵離子多肽螯合物的抗氧化、抗菌活性測定
多肽螯合物的抗氧化測定——TBA法
以維生素C、生育酚為對比，亞鐵離子螯合物具有良好的抗氧化能力，其抗氧化作用與其相當；
多肽螯合物的抗菌活性測定——牛津杯雙層平板法
亞鐵離子螯合物對大腸桿菌，枯草牙孢桿菌，金黃色葡萄球菌，綠膿桿菌進行實驗，結構表明對革蘭氏陽性菌有較好的抗菌效果。本發(fā)明的有益效果是
(O以海洋低值魚帶魚加工后下腳料為原料，制備同時具有抗菌、抗氧化和鐵強化作用的魚蛋白水解螯合物，生產(chǎn)過程中的無水乙醇可以回收利用，生產(chǎn)成本低，可以實現(xiàn)水產(chǎn)品高值化開發(fā)與高度利用；
(2)生產(chǎn)工藝技術對設備要求不高，設備投資少，一般水產(chǎn)加工企業(yè)都具備開發(fā)的條件和能力；
(3)產(chǎn)品具有純天然的特點，具有良好的抗氧化能力，對大腸桿菌，枯草牙孢桿菌，金黃色葡萄球菌，沙門氏菌有顯著的抗菌效果。


圖I是本發(fā)明抗氧化活性示意圖。圖中，Α: 一級螯合物沉淀；Β :二級螯合物沉淀；C :三級螯合物沉淀；D :四級螯合物沉淀；E Vit. Eo
具體實施例方式實施例一
a)原料處理帶魚下腳料，去頭、去尾、去骨，留取魚肉以作備用；
b)前處理用清水將步驟a所得的魚肉洗凈，浙干水分，切碎后室溫條件下勻漿，冷凍貯藏；
c)復合酶水解將步驟b所得魚肉漿按3倍重量比加入去離子水，調(diào)節(jié)pH為6.8，加入復合酶，溫度45°C水解，復合酶的重量為魚肉漿的O. 5%，復合酶由風味酶與木瓜蛋白酶組成，風味酶與木瓜蛋白酶的重量比為I :3，水解時間為4小時，水解結束后于沸水中保持10min滅酶，冷卻后抽濾，再離心過濾，最后超濾膜過濾去除分子量低于IOkDa的水解產(chǎn)物，收集超濾水解液于4°C條件下儲存；
d)多肽螯合物制備將步驟c所得超濾水解液調(diào)整pH7. 3，按重量比向45份超濾水解液中緩慢加入I份質(zhì)量分數(shù)為1%的FeC12溶液，在溫度24°C，螯合反應30分鐘，螯合反應結束后，對螯合物進行過濾，得到初級螯合沉淀物A和初級濾液，之后對初級濾液進行無水乙醇分級梯度沉底，在室溫下加入無水乙醇，使其質(zhì)量百分濃度達到60%，沉淀后離心10 min獲得2級螯合物沉淀B和次級濾液；向次級濾液繼續(xù)加入無水乙醇，使其質(zhì)量百分濃度達到80%，離心10 min獲得3級螯合物沉淀C和三級濾液；最后向三級濾出液中繼續(xù)添加無水乙醇，使得其濃度達到95%以上，室溫下靜置20 min,產(chǎn)生懸浮物和沉淀，對此體系進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮，可得4級螯合物沉淀D ;將以上I一4級螯合物沉淀于真空條件下(O. I MPa)45°C烘干4h后，置于硅膠干燥器保存?zhèn)溆?。實施例?
a)原料處理帶魚下腳料，去頭、去尾、去骨，留取魚肉以作備用；
b)前處理用清水將步驟a所得的魚肉洗凈，浙干水分，切碎后室溫條件下勻漿，冷凍貯藏；
c)復合酶水解將步驟b所得魚肉漿按2倍重量比加入去離子水，調(diào)節(jié)pH為6.0，加入復合酶，溫度40°C水解，復合酶的重量為魚肉漿的O. 2%，復合酶由風味酶、木瓜蛋白酶與中性蛋白酶組成，風味酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶的重量比為I :3 :2，水解時間為I. 5小時，水解結束后于沸水中保持8 min滅酶，冷卻后抽濾，再離心過濾，最后超濾膜過濾去除分子量低于IOkDa的水解產(chǎn)物，收集超濾水解液于4°C條件下儲存；
d)多肽螯合物制備將步驟c所得超濾水解液調(diào)整pH7.0，按重量比向40份超濾水解液中緩慢加入I份質(zhì)量分數(shù)為2%的FeC12溶液，在溫度20°C，螯合反應20分鐘，螯合反應結束后，對螯合物進行過濾，得到初級螯合沉淀物A和初級濾液，之后對初級濾液進行無水乙醇分級梯度沉底，在室溫下加入無水乙醇，使其質(zhì)量百分濃度達到60%，沉淀后離心10 min獲得2級螯合物沉淀B和次級濾液；向次級濾液繼續(xù)加入無水乙醇，使其質(zhì)量百分濃度達到80%，離心10 min獲得3級螯合物沉淀C和三級濾液；最后向三級濾出液中繼續(xù)添加無水乙醇，使得其濃度達到95%以上，室溫下靜置20 min，產(chǎn)生懸浮物和沉淀，對此體系進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮，可得4級螯合物沉淀D ;將以上I一4級螯合物沉淀于真空條件下(O. I MPa)40°C烘干3h后，置于硅膠干燥器保存?zhèn)溆?。實施例?br> a)原料處理帶魚下腳料，去頭、去尾、去骨，留取魚肉以作備用；
b)前處理用清水將步驟a所得的魚肉洗凈，浙干水分，切碎后室溫條件下勻漿，冷凍貯藏；
c)復合酶水解將步驟b所得魚肉漿按5倍重量比加入去離子水，調(diào)節(jié)pH為7.0，加入復合酶，溫度50 V水解，復合酶的重量為魚肉漿的O. 8%，復合酶由木瓜蛋白酶與中性蛋白酶組成，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶的重量比為3 :2，水解時間為6小時，水解結束后于沸水中保持15 min滅酶，冷卻后抽濾，再離心過濾，最后超濾膜過濾去除分子量低于IOkDa的水解產(chǎn)物，收集超濾水解液于4°C條件下儲存；
d)多肽螯合物制備將步驟c所得超濾水解液調(diào)整pH8.3，按重量比向50份超濾水解液中緩慢加入I份質(zhì)量分數(shù)為3%的FeCl2溶液，在溫度30°C，螯合反應25分鐘，螯合反應結束后，對螯合物進行過濾，得到初級螯合沉淀物A和初級濾液，之后對初級濾液進行無水乙醇分級梯度沉底，在室溫下加入無水乙醇，使其質(zhì)量百分濃度達到60%，沉淀后離心10 min獲得2級螯合物沉淀B和次級濾液；向次級濾液繼續(xù)加入無水乙醇，使其質(zhì)量百分濃度達到80%，離心10 min獲得3級螯合物沉淀C和三級濾液；最后向三級濾出液中繼續(xù)添加無水乙醇，使得其濃度達到95%以上，室溫下靜置20 min，產(chǎn)生懸浮物和沉淀，對此體系進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮，可得4級螯合物沉淀D ;將以上I一4級螯合物沉淀于真空條件下(O. I MPa)50°C烘干5h后，置于硅膠干燥器保存?zhèn)溆谩嵤├?，通過上述實施例制的產(chǎn)物，測定其抗氧化性，采用TBA法即硫代巴比妥酸法，其抗氧化性能效果見圖I :
B的抗氧化活性最高，其氧化活性Vit. E抗氧化活性的92%。A和B疏水性更強，原因是它們富含組氨酸，且它們的螯合環(huán)增強了組氨酸咪唑環(huán)的抗氧化能力，因此A和B可以用作天然抗氧化劑。同A和B相比，C和D具有較好的親水性，在水環(huán)境中可溶，這些提示C和D 可能主要由親水氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸、氨基乙酸、丙氨酸、蘇氨酸和絲氨酸等組成，僅含有少量組氨酸，所以C和D可以作為親水性的天然抗氧化劑。通過上述實施例的產(chǎn)物，測定其抗菌性，采用牛津杯雙層平板法，其應用效果如下
I.....—大聽桿·金黃色蕾萄球菌....沙門氏菌—枯萆芽胞桿菌.........[
ASS8§
B898I
C99910
D 12 11916 I
A對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草芽胞桿菌無任何抗菌活性；而B對金黃色葡萄球菌具有較弱的抗菌活性；C對上述4種細菌也具有微弱抗菌活性；D對4種細菌的抗菌活性為最高，這種活性取決于螯合組分的親水性，所以在食品工業(yè)中，D可以用作親水性的天然抗菌劑。
權利要求
1.ー種魚蛋白水解螯合物的制備方法，其特征在于，所述的制備方法步驟如下 a)原料處理帶魚下腳料，去頭、去尾、去骨，留取魚肉以作備用； b)前處理用清水將步驟a所得的魚肉洗浄，浙干水分，切碎后室溫條件下勻漿，冷凍貯藏； c)復合酶水解將步驟b所得魚肉漿按2-5倍重量比加入去離子水，調(diào)節(jié)pH為6-7，加入復合酶，溫度40-50°C水解，復合酶的重量百分比為魚肉漿的O. 2%-0. 8%，水解I. 5-6小吋，水解結束后于沸水中保持8-15min滅酶，冷卻后抽濾，再離心過濾，最后超濾膜過濾水解液去除分子量低于IOkDa的水解產(chǎn)物，收集超濾水解液于4°C條件下儲存； d)多肽螯合物制備將步驟c所得超濾水解液調(diào)整PH7-8.3，按重量向40-50份超濾水解液中緩慢加入I份質(zhì)量分數(shù)為1%_3%的FeC12溶液，在溫度20_30°C，螯合反應20-30分鐘，螯合反應結束后，對螯合物進行過濾，得到初級螯合沉淀物與初級濾液，之后對初級濾液進行無水こ醇分級梯度沉淀得到次級螯合沉淀物，將以上無水こ醇分級梯度沉淀所得的螯合沉淀物與第一次沉淀所得的初級螯合沉淀物合并40-60°C下干燥3-5h，得到魚蛋白水解螯合物。
2.根據(jù)權利要求I所述的ー種魚蛋白水解螯合物的制備方法，其特征在于，所述復合酶由風味酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶兩種以上組成，風味酶的酶活力為40萬U/克，木瓜蛋白酶的酶活力為200萬U/克，中性蛋白酶的酶活力為10萬U/克。
3.根據(jù)權利要求2所述的ー種魚蛋白水解螯合物的制備方法，其特征在于，所述復合酶中風味酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶重量比為I :3 :2。
4.根據(jù)權利要求I或2所述的ー種魚蛋白水解螯合物的制備方法，其特征在于，步驟b中勻漿所用儀器轉(zhuǎn)速為2000 -3000r/min。
5.根據(jù)權利要求I或2或3所述的ー種魚蛋白水解螯合物的制備方法，其特征在于，所述步驟d中無水こ醇分級梯度沉淀分為3級，こ醇的質(zhì)量百分濃度分別為60%、80%、95%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種魚蛋白水解螯合物的制備方法，以低值海水魚如帶魚下腳料為原料，經(jīng)過前處理、加入復合酶水解、多肽螯合修飾制備同時具有抗菌、抗氧化和鐵強化作用的魚蛋白水解螯合物，產(chǎn)品具有純天然的特點，具有良好的抗氧化能力，對大腸桿菌，枯草牙孢桿菌，金黃色葡萄球菌，沙門氏菌有顯著的抗菌效果。生產(chǎn)過程中的無水乙醇可以回收利用，生產(chǎn)成本低，可以實現(xiàn)水產(chǎn)品高值化開發(fā)與高度利用。
文檔編號A23J1/04GK102669401SQ201110360779
公開日2012年9月19日 申請日期2011年11月15日 優(yōu)先權日2011年11月15日
發(fā)明者付萬冬, 傅光明, 周宇芳, 廖妙飛, 楊會成, 鄭斌, 鐘明杰 申請人:浙江省海洋開發(fā)研究院