一種利用酸性蛋白酶水解魚源膠原蛋白制備的抗凍多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用酸性蛋白酶水解魚皮膠原蛋白制備的抗凍多肽，以魚皮膠原蛋白為原料，通過酸性蛋白酶酶解，再經(jīng)過分離純化得到純化的特異性抗凍多肽，氨基酸全序列為：GAIGPAGPLGP。本發(fā)明突破了國內(nèi)外現(xiàn)存的抗凍蛋白（多肽）的研究思路和方法，克服從天然生物體中純化抗凍蛋白數(shù)量的局限性以及國際FDA組織對轉(zhuǎn)基因抗凍蛋白在食品應用中的安全性顧慮，獲得基于食品源的高效抗凍多肽，為開發(fā)基于食品源的抗凍多肽以及探索其在食品、醫(yī)學上的廣泛應用奠定理論基礎。
【專利說明】一種利用酸性蛋白酶水解魚源膠原蛋白制備的抗凍多肽
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗凍多肽，更具體地涉及了一種利用酸性蛋白酶水解魚源膠原蛋白制備的抗凍多肽，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]食品和醫(yī)藥產(chǎn)品在低溫儲存和運輸過程中由于環(huán)境溫度的波動變化而反復地遭受冰晶生長和重結(jié)晶的問題越來越受到人們的關注。溫度的反復升降使冰晶不斷生長、凍融和重結(jié)晶，嚴重破壞細胞和組織結(jié)構(gòu)而失去產(chǎn)品應有的品質(zhì)。世界范圍內(nèi)的科學家正面臨嚴肅的挑戰(zhàn):如何控制冰晶生長及重結(jié)晶，實現(xiàn)低溫冷鏈上的冰晶生長控制，是制約眾多食品和醫(yī)藥廣品品質(zhì)的關鍵所在。
[0003]抗凍蛋白，也稱“冰結(jié)構(gòu)蛋白”，是一類附著在冰晶體表面而抑制冰晶的生長和重結(jié)晶的活性蛋白質(zhì)?？箖龅鞍子捎谄渚哂锌刂票L、減少細胞損傷及保持產(chǎn)品原有組織結(jié)構(gòu)、質(zhì)地和品質(zhì)的特點和突出意義而成為熱點研究主題。同樣的研究還表明，抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于局部的特異多肽鏈結(jié)構(gòu)域而并不是整體蛋白質(zhì)在起作用，即使是純化了的抗凍蛋白，抗凍活性往往不高，仍然需要探究其活性域來進一步提高抗凍效率。所以，如何獲得食品源的結(jié)構(gòu)緊湊的高活性抗凍多肽，就成為抗凍蛋白迫切的研究方向。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種利用酸性蛋白酶水解魚源膠原蛋白制備的抗凍多肽，使抗凍活性得以高效地實現(xiàn)。
[0006]本發(fā)明的一種利用酸性蛋`白酶水解魚源膠原蛋白制備的抗凍多肽，是由11個氨基酸所構(gòu)成的多肽。所述多肽的氨基酸序列為:GAIGPAGPLGP。
[0007]所述抗凍多肽的制備方法如下:
以包括來自魚皮、魚鱗的魚源膠原蛋白為原料，采用酸性蛋白酶對其進行酶解，分離純化、冷凍干燥得到抗凍多肽。
[0008]其中，酶解條件為:pH為5.4、溫度是37°C、酶解時間為30分鐘、酶-底物配比為1:15 (w/w)。
[0009]所述分離純化的具體步驟為:酶解產(chǎn)物首先利用Sephadex G_50凝膠色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為2mL/min，洗脫峰在225nm下進行測量；收集具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25陽離子交換色譜進行分離,洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0.5 M的0.01mol/L pH7.0的磷酸緩沖液，流速為0.5mL/min ;收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進行進一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10%-90% (v/v)乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為lmL/min，收集20%乙腈和80%水(v/v)處的洗脫峰，得到抗凍多肽。
[0010]為了實現(xiàn)上述方案，本發(fā)明采取的具體步驟如下:(I)明膠酶解條件的優(yōu)化
本技術所采用的酶和魚(魚皮、魚鱗)膠原蛋白購自Sigma生物試劑公司(中國?上海)。采用單因素實驗，分別對三個酶解因素即酶解溫度(37°C，45°C和50°C )、酶解時間(10，20，30，40和60分鐘)以及酶-底物配比(1: 100，1:50，1:20，1:15和1:10 w/w)，進行考察。稱取1.65克魚源膠原蛋白溶解于6ml Mil1-Q水中，然后用2mol/L HCL將其pH調(diào)節(jié)至5.4。先將該溶液水浴加熱到需要溫度，接著再按不同的酶-底物配比加入相應量的酶，按照預定的反應時間開始反應。接著再在沸水浴中滅酶10分鐘，冷卻后再IOOOrpm離心10分鐘。上清液收集后，分別對其抗凍活性進行測定，以確定最佳酶解條件。
[0011]得到具有最大抗凍活性的酶解液的酶解條件是:pH為5.4、溫度是37°C、酶解時間為30分鐘、酶-底物配比為1:15-1:20 (w/w)。
[0012](2)酶解產(chǎn)物的分離、純化
先在最佳酶解條件下進行酶解，得到的酶解產(chǎn)物先經(jīng)過Sephadex G-50凝膠色譜(長100cm,直徑2.6cm)進行分離,洗脫液為去離子水,流速為2mL/min,洗脫峰在225nm下進行測量。收集具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex C-25陽離子交換色譜(長55cm,直徑2.0cm)進行分離,洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0.5 M的0.01mol/L pH7.0的磷酸緩沖液，流速為0.5mL/min。收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜再進行進一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10-90%乙腈溶液作為洗脫液，流速為lmL/min，得到高純度的特異性抗凍多肽。
[0013](3)抗凍活性的測試
本發(fā)明按照國際抗凍蛋白活性檢測的標準，建立抗凍活性檢測系統(tǒng)?？箖龌钚圆捎脵z測抗凍多肽對低溫凍融細菌的 保護作用來測試。
[0014]將活化的保加利亞乳酸桿菌接種到液體培養(yǎng)基中37°C，130r/min培養(yǎng)過夜作為種子液，將種子液以1:100的比例接種到新的液體培養(yǎng)基中，37°C，130r/min搖床培養(yǎng)至OD600=L O左右。取若干1.5mL已滅菌的離心管，加入經(jīng)過濾除菌的濃度為250 μ g/mL待測樣品900 μ L，將菌液稀釋IO4倍，吸取100 μ L加入至待測樣品中，混勻，涂布，37°C倒置培養(yǎng)18h，計菌落數(shù)。將剩余的樣品-菌液混合液置于_20°C低溫處理24h，取出融化并涂布，37°C倒置培養(yǎng)18h，計菌落數(shù)，每組做兩個平行。然后根據(jù)公式計算保加利亞乳酸桿菌的存活率。
[0015]
【權(quán)利要求】
1.一種利用酸性蛋白酶水解魚源膠原蛋白制備的抗凍多肽，其特征在于:多肽的氨基酸序列為:GAIGPAGPLGP。
2.一種如權(quán)利要求1所述的抗凍多肽的制備方法，其特征在于:以包括來自魚皮、魚鱗的魚源膠原蛋白為原料，采用酸性蛋白酶對其進行酶解，分離純化、冷凍干燥得到抗凍多肽。
3.如權(quán)利要求2所述的抗凍多肽的制備方法，其特征在于:所述的酶解條件為:pH為5.4、溫度是37°C、酶解時間為30分鐘、酶-底物配比為1:15 (w/w)0
4.如權(quán)利要求2所述的抗凍多肽的制備方法，其特征在于:所述的分離純化具體步驟為:酶解產(chǎn)物首先利用Sephadex G-50凝膠色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為2mL/min,洗脫峰在225nm下進行測量；收集具有最佳抗凍活性的峰,再用Sulfopropyl-SepadexC-25陽離子交換色譜進行分離，洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0.5 M的0.0lmol/L pH7.0的磷酸緩沖液，流速為0.5mL/min ;收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜再進行進一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10%-90% (v/v)乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為lmL/min，收集20%乙腈和80%水(v/v)處的洗脫峰，得到抗凍多肽。
【文檔編號】C07K1/20GK103467587SQ201310441150
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】汪少蕓, 蔡茜茜, 何慶燕, 饒平凡 申請人:福州大學