專利名稱：一種新城疫h(yuǎn)i抗原的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新城疫HI抗原的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
新城疫(Newcastle disease, ND)，又稱亞洲雞瘟或偽雞瘟，是由副粘病毒屬新城疫病毒引起的一種禽類急性、高度接觸性、致死性家禽傳染病。該病于1926年首先發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞，同年發(fā)現(xiàn)于英國新城，我國于1935年首次報(bào)道此病，當(dāng)時(shí)認(rèn)為是禽流感，1948 年證實(shí)是新城疫。該病在世界上曾有三次大流行，到了 20世紀(jì)80年年代末，該病發(fā)生新的變化，多發(fā)生于有母源抗體的雛雞和免疫雞群，而臨床癥狀不典型；在免疫雞群中出現(xiàn)以呼吸道為主，有輕微神經(jīng)癥狀；在產(chǎn)蛋雞中呈現(xiàn)產(chǎn)蛋下降、產(chǎn)白色、軟殼蛋等非急性、致死率不高、癥狀不明顯的非典型性新城疫。新城疫的不斷傳播，至今世界上大多數(shù)國家和地區(qū)均有暴發(fā)該病的記載或報(bào)道。目前，新城疫仍廣泛存在于亞洲、非洲、美洲等許多國家和地區(qū)。目前，防治新城疫的主要手段仍是免疫接種，傳統(tǒng)的弱毒活疫苗和滅活苗在疾病中仍發(fā)揮巨大作用。由于HI試驗(yàn)(血凝抑制實(shí)驗(yàn))具有操作簡便、快捷、敏感度高、和特異性等特點(diǎn)，是當(dāng)前實(shí)際生產(chǎn)過程中評價(jià)疫苗質(zhì)量、雞體免疫水平的高低的最重要手段之一， 同時(shí)中國獸藥典2005版規(guī)定的新城疫類滅活疫苗效力檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法。在臨床和實(shí)驗(yàn)室新城疫疾病防控過程中起著很重要的作用。但是，目前HI檢測方法是利用活病毒進(jìn)行檢測，因此存在著一些問題，其中首要問題是缺乏穩(wěn)定的、安全的HI診斷抗原。具體表現(xiàn)在 1)活病毒抗原隱患大，存在散毒的危險(xiǎn)；2)活病毒抗原為了保護(hù)病毒本身的活性必須冷凍保存，要求條件高，如果在4°C條件下放置，1星期后抗原就開始出現(xiàn)蛋白沉淀、血凝活性降低，而反復(fù)凍融又會使蛋白變性，抗原血凝活性降低；3)利用活的病毒作為診斷抗原需每次測定抗原的血凝活性，增加了工作量。聚乙二醇(PEG)可用作溶劑、助溶劑、o/w型乳化劑和穩(wěn)定劑，用于制作水泥懸劑、 乳劑、注射劑等，也用作水溶性軟膏基質(zhì)和栓劑基質(zhì)，用于增加低分子量液體PEG的粘度和成固性，以及外償其他藥物；對于水中不易溶解的藥物，PEG可作固體分散劑的載體，以達(dá)到固體分散目的，穩(wěn)定劑PEG4000、PEG6000、PEG8000是良好的包衣材料，親水拋光材料、膜材和囊材、增塑劑、潤滑劑和滴丸基質(zhì)，用于制備片劑、丸劑、膠囊劑、微囊劑等。該系列產(chǎn)品無毒、無刺激性，具有良好的水溶性，并與許多有機(jī)物組份有良好的相溶性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開一種制備新城疫HI抗原的方法，以克服現(xiàn)有新城疫HI診斷抗原中缺乏安全、穩(wěn)定、易儲存的抗原的問題。本發(fā)明提供的新城疫HI抗原的制備方法，包括以下步驟1)新城疫病毒液接種雞胚，收獲雞胚尿囊液，檢測HA效價(jià)，HA效價(jià)> Slog2合格；2)向收獲的HA效價(jià)合格的尿囊液中加入β -丙內(nèi)酯滅活；3)將滅活后的尿囊液離心濃縮為原體積的1/10 1/20 ；
4)濃縮后的尿囊液中加入穩(wěn)定劑；5)將尿囊液用PBS緩沖液稀釋溶解，PBS的體積為濃縮前尿囊液體積的1/10 1/5 ；6)將稀釋后的尿囊液超聲裂解；7)在超聲后的尿囊液中加入甘油即為新城疫HI抗原，振蕩混合均勻后使用或放 4°C下保存?zhèn)溆谩Ｆ渲胁襟E1)所述的新城疫病毒液，每0. Iml病毒含量為IO6EID5tl，每只雞胚接種 0. lmL。其中步驟2)是按照尿囊液體積的0. 25%。 0. 5%。加入滅活劑β -丙內(nèi)酯，在4°C 條件下滅活24 48h。其中步驟3)的離心為15000r/min，高速離心1小時(shí)。本發(fā)明穩(wěn)定劑配方為PEG3 4g，KCl 0. 01 0. 05g，NaCl 1 1. 5g， Na2HPO4O. 1 0. 5g，KH2PO4O. 01 0. 05g，加入 IOOml 的尿囊液中。上述PEG 可以為 PEG4000、PEG6000 和 / 或 PEG8000。本發(fā)明尿囊液濃縮和穩(wěn)定劑的溶解都在4°C環(huán)境下進(jìn)行。其中步驟6)超聲裂解是使用40kHz、30 50W超聲波處理尿囊液20 40s。其中，步驟7)加入終體積20%-30%甘油，在4°C條件下儲存?zhèn)溆?。本發(fā)明新城疫病毒是La Sota株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。本發(fā)明的方法是在無菌條件下，采用雞胚尿囊腔接種法，將稀釋好的病毒液接種 9 11日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，用4%碘酒消毒氣室部位，用75%酒精脫碘，0. ImL/枚， 放置37°C繼續(xù)孵育，24h照蛋1次，棄去Mh內(nèi)死亡雞胚，以后每隔Mi照蛋1次，及時(shí)取出死胚2 8 °C冷卻，孵育后，全部取出2 8 °C冷卻過夜，無菌收獲雞胚尿囊液。經(jīng)檢驗(yàn)合格后，將尿囊液滅活、按照一定比例加入穩(wěn)定劑、濃縮、稀釋、超聲后加入甘油保護(hù)劑即為新城疫HI抗原，振蕩混勻后即可使用或是4°C保存。按照本發(fā)明提供的方法制備的抗原為滅活抗原，方便抗原的儲存、運(yùn)輸和使用，同時(shí)本抗原為滅活抗原，在使用和儲備時(shí)不存在散毒的危險(xiǎn)，減少了因?yàn)槭褂每乖鴮θ梭w造成的危害；此種抗原的HA血凝活性穩(wěn)定，抗原在4°C環(huán)境下可以保存2年，血凝價(jià)不變， 每次使用前不需重復(fù)測定血凝價(jià)，減少了工作人員的工作量。


圖1是HI抗原的制備流程簡圖。圖2是HI抗原M個(gè)月內(nèi)的血凝價(jià)變化情況圖，其中實(shí)驗(yàn)1描述的是實(shí)施例1獲得的HI抗原的HA效價(jià)變化情況，實(shí)驗(yàn)2描述的是實(shí)施例2獲得的HI 抗原的HA效價(jià)變化情況。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
實(shí)施例1使用北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司的PEG4000為穩(wěn)定劑主要成分。HI穩(wěn)定抗原的制備步驟如下(1) SPF雞胚(由北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供)接毒在無菌環(huán)境下，將新城疫La Sota株病毒稀釋至含IO6EIDStlA). 1ml，接種9 11日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，0. Iml/枚，接種后封蠟。(2)培養(yǎng)和照胚接毒后的SPF雞胚置37°C繼續(xù)孵育，24h照蛋1次，棄去死亡雞胚，此后每Mi照蛋 1次，及時(shí)取出死亡雞胚放入4°C，至全部取出放入4°C過夜。(3)收獲及HA檢測在無菌環(huán)境下收獲雞胚尿囊液，并同時(shí)做無菌檢驗(yàn)。檢測HA價(jià)> 81og2為合格。 采用其他處理過程的病毒液只要HA價(jià)符合上述要求也可實(shí)用于本發(fā)明所述的制備工藝。(4)滅活按照尿囊液體積的0.25%。加入β-丙內(nèi)酯(購自Sigma公司)，在4°C磁力攪拌器滅活M小時(shí)。37°C水解2h。(5)濃縮采用BACKMAN公司出品的高速離心機(jī)，(15000r/min, lh)將尿囊液在4°C環(huán)境下進(jìn)行濃縮，使其體積濃縮為原體積的1/10。(6)加入穩(wěn)定劑按照IOOml 的尿囊液中加入PEG40003g，KCl 0. Olg, NaCl lg, Na2HPO4O. Ig, KH2PO4O. Olg。(7)稀釋將尿囊液用PBS緩沖液稀釋，PBS的體積為濃縮前尿囊液體積的1/10。(8)超聲將稀釋好的尿囊液超聲裂解，超聲條件是40kHz，30W超聲20s，由于是在濃縮后進(jìn)行超聲，使病毒濃度增大，超聲后也使得病毒粒子更加均勻。在檢測時(shí)可達(dá)到最佳效果。(9)加入保護(hù)劑保存超聲好的尿囊液中加入終體積30%的甘油，振蕩混合均勻后即為新城疫HI抗原， 可使用或放入4°C環(huán)境保存。實(shí)施例2使用北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司的PEG8000為穩(wěn)定劑主要成分，HI穩(wěn)定抗原的制備工藝步驟如下(I)SPF雞胚接毒在無菌環(huán)境下，將新城疫La Sota株病毒稀釋至含106EID5(1/0. 1ml，接種9-11日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，0. Iml/枚，封蠟。(2)培養(yǎng)和照胚接毒后的SPF雞胚置37°C繼續(xù)孵育，24h照蛋1次，棄去死亡雞胚，此后每Mi照蛋 1次，及時(shí)取出死亡雞胚放入8°C，至全部取出放入8°C過夜。(3)收獲及HA檢測
在無菌環(huán)境下收獲雞胚尿囊液，并同時(shí)做無菌檢驗(yàn)。檢測HA價(jià)> Slog2為合格。 采用其他處理過程的病毒液只要HA價(jià)符合上述要求也可實(shí)用于本發(fā)明所述的制備工藝。(4)滅活 按照尿囊液體積的0. 5%。加入β -丙內(nèi)酯，在4°C磁力攪拌器滅活48小時(shí)，37°C水解2h。(5)濃縮采用BACKMAN公司出品的高速離心機(jī)(15000r/min，lh)，將滅活后的尿囊液在4°C 環(huán)境下進(jìn)行濃縮，使其體積濃縮為原體積的1/20。(6)加入穩(wěn)定劑按照IOOml 的尿囊液中加入PEG80004g，KCl 0. 05g，NaCl 1. 5g，Na2HPO4O. 5g， KH2PO4O. 05g。(7)稀釋將尿囊液用PBS緩沖液稀釋，PBS的體積為濃縮前尿囊液體積的1/5。(8)超聲將稀釋好的尿囊液超聲裂解，超聲條件是40kHz，50W，20s，由于是在濃縮后進(jìn)行超聲，使病毒濃度增大，超聲后也使得病毒粒子分布更加均勻。在檢測時(shí)可達(dá)到最佳效果。(9)加入保護(hù)劑保存向超聲好的尿囊液中加入終體積20%的甘油，振蕩混合均勻后即為新城疫HI抗原，可使用或放入4°C環(huán)境保存。實(shí)施例3滅活檢驗(yàn)將實(shí)施例1和實(shí)施例2中滅活的尿囊液按1 10000倍稀釋后，經(jīng)尿囊腔接種11日齡SPF雞胚，每胚0. lmL，接種后置37°C繼續(xù)孵化5天，觀察雞胚發(fā)育情況并檢測雞胚尿囊液有無血凝活性。并將收獲的雞胚尿囊液在SPF雞胚上盲傳3代，檢測雞胚尿囊液均無血凝活性。說明本發(fā)明制備的抗原滅活完全，安全性好、無毒害。實(shí)施例4特異性實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例1和實(shí)施例2濃縮后的新城疫La Sota株尿囊液(即抗原) 分別與新城疫(ND)血清、雞傳染性支氣管炎(IB)血清、肉雞減蛋綜合證(EDS)血清、禽流感病毒H5W亞型血清、禽流感病毒H9N2血清、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILT)血清、傳染性法氏囊病毒(IBD)血清等做HI交叉抑制實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。結(jié)果表明本發(fā)明制備新城疫La Sota株抗原不與除新城疫以外的其他病毒陽性血清反應(yīng)，說明本發(fā)明制備的新城疫 HI抗原特異性好。表1本發(fā)明制備的抗原與幾種病毒血清HI試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種新城疫HI抗原的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟1)新城疫病毒液接種雞胚，收獲雞胚尿囊液，檢測HA效價(jià)，HA效價(jià)>Slog2合格；2)向收獲的HA效價(jià)合格的尿囊液中加入β-丙內(nèi)酯滅活；3)將滅活后的尿囊液離心濃縮為原體積的1/10 1/20；4)向濃縮后的尿囊液中加入穩(wěn)定劑；5)將尿囊液用PBS緩沖液稀釋溶解，PBS的體積為濃縮前尿囊液體積的1/10 1/5；6)將稀釋后的尿囊液超聲裂解；7)在超聲后的尿囊液中加入甘油即為新城疫HI抗原，振蕩混合均勻后使用或放4°C下保存?zhèn)溆谩?br> 2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的新城疫病毒液，每只雞胚接種 0. lmL，病毒含量為106EID5Q。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟2)是按照尿囊液體積的 0. 25%。 0. 5%。加入滅活劑β -丙內(nèi)酯，在4°C條件下滅活24 48h。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)的離心條件為15000r/min，離心1小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的穩(wěn)定劑其配方為PEG3 4g，KCl 0. 01 0. 05g, NaCl 1 1. 5g, Na2HPO4O. 1 0. 5g, KH2PO4O. 01 0. 05g，加入 IOOml 的尿囊液中。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的PEG為PEG4000、PEG6000和/或 PEG8000。
7.如權(quán)利要求1 6之一所述的方法，其特征在于，尿囊液濃縮和穩(wěn)定劑的溶解都在 4°C環(huán)境下進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中步驟6)超聲裂解是使用40kHz、30 50W超聲波處理尿囊液20 40s。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，所述新城疫病毒是LaSota株。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟7)加入終體積20%-30%甘油， 在4°C條件下儲存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明提供了一種新城疫HI穩(wěn)定抗原的制備方法，包括以下技術(shù)步驟(1)新城疫病毒接種雞胚后收獲雞胚尿囊液，按尿囊液體積的0.25‰～0.5‰加入滅活劑β-丙內(nèi)酯；(2)將滅活的尿囊液濃縮為原體積的1/10～1/20，加入穩(wěn)定劑；(3)再用體積為濃縮前尿囊液體積的1/5～1/10的PBS緩沖液稀釋抗原；(4)超聲裂解，加入終體積20％～30％甘油，振蕩混合均勻后即為可使用的抗原。本方法制備的抗原在使用和儲備時(shí)不存在散毒的危險(xiǎn)，減少了因?yàn)槭褂没畈《究乖鴮Νh(huán)境和人體的危害，該產(chǎn)品具有很好的穩(wěn)定性，在2～8℃條件下，保存24個(gè)月以上該產(chǎn)品血凝價(jià)不變，可用于雞新城疫的HI檢測。
文檔編號C12N7/00GK102352345SQ20111024038
公開日2012年2月15日 申請日期2011年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月19日
發(fā)明者孫豐廷, 張發(fā)明, 張洪, 張紅, 李靜, 楊國良, 王世敏, 王文泉, 鄭杰, 陳玲 申請人:北京市獸醫(yī)生物藥品廠