專利名稱：羅氏沼蝦雙順反子病毒的lamp檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于靶DNA片斷的檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)快速檢測羅氏沼蝦雙順反子病毒所用的試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
羅氏沼蟲下雙順反子病毒 Ofecro^racAi腫 rosenbergii dicistrovirus, MRDV)是引起羅氏沼蝦幼體綜合癥(ifecro^racAi腫rosenbergii larval Syndrome, MRLS)的主要病原，對羅氏沼蝦育苗產(chǎn)業(yè)危害極大。MRDV為單正鏈RNA病毒，歸為雙順反子病毒科。該病毒在國內(nèi)外文獻上未有報道，其基因組序列僅公開了 900個堿基。該病毒于2009年和2010 年引起我國羅氏沼蝦幼體的疾病，造成羅氏沼蝦在幼體期出現(xiàn)大量死亡，特別是在幼體6-9 日齡死亡尤為嚴重，死亡率一般為80-90%，嚴重的達到100%，近2年造成的經(jīng)濟損失無法估量。被發(fā)現(xiàn)以來，因缺少檢測方法，嚴重阻礙了該病毒引起疾病的預(yù)防工作，因此該病毒檢測試劑盒的開發(fā)和檢測技術(shù)的研究顯得尤為重要。RT-LAMP是一種新型的核酸等溫擴增技術(shù)，該技術(shù)針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計6條特異引物，利用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶同時作用，使得病毒cDNA合成和核酸擴增同時進行，并且DNA聚合酶是一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件下即可完成核酸擴增反應(yīng)，擴增出LAMP特征性梯狀條帶。RT-LAMP技術(shù)在保持PCR技術(shù)優(yōu)點的基礎(chǔ)上，進一步增強了反應(yīng)的特異性并縮短了檢測時間；特別是它不需使用昂貴的熱循環(huán)儀， 在等溫條件下就能使反轉(zhuǎn)錄和核酸擴增同時完成反應(yīng)，且擴增產(chǎn)物用肉眼能觀察，可用于病原微生物的現(xiàn)場快速檢測。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供羅氏沼蝦雙順反子病毒的 RT-LAMP檢測試劑盒和檢測方法的技術(shù)方案，該試劑盒特異性強，敏感性高，該方法方便、靈敏、準確、快速，為羅氏沼蝦幼體綜合癥的預(yù)防奠定基礎(chǔ)。所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于包括RNA提取試劑和RT-LAMP反應(yīng)試劑，
所述的RNA提取試劑含有Trizol試劑、氯仿、異丙醇、無RNase的70%乙醇和DEPC水； 所述的RT-LAMP反應(yīng)試劑含有
1)RT-LAMP 預(yù)反應(yīng)液20 25mM pH 為 8. 2 9. 0 的 Tris-HCl、6 IOmM硫酸鎂、10 12mM 氯化鉀、8 12mM 硫酸銨、0. 1 0. 2% Triton X-100 或 Tween 20、1 1. 6 mM dNTP、 0.6 1.0 M 甜菜堿、1. 5 2. 2μΜ 引物 MRDV-FIP、1. 5 2. 2μΜ 引物 MRDV-BIP、0. 15 0. 3 μ M 引物 MRDV-F3、0. 15 0. 3 μ M 引物 MRDV-B3， 引物MRDV-FIP核苷酸序列如SEQ No. 1所示， 引物MRDV-BIP核苷酸序列如SEQ No. 2所示，引物MRDV-F3核苷酸序列如SEQ No. 3所示， 引物MRDV-B3核苷酸序列如SEQ No. 4所示；
2)逆轉(zhuǎn)錄酶每微升含10個活性單位的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶；
3)聚合酶每微升含8個活性單位的BstDNA聚合酶；
4)RT-LAMP反應(yīng)穩(wěn)定液由礦物油或液體石蠟油組成；
5)RT-LAMP反應(yīng)顯色液含有10 % SYBR Green I的熒光染料。所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的RT-LAMP預(yù)反應(yīng)液含有21 MmM pH為8. 2 9. 0的iTris-HClJ 9mM硫酸鎂、11 12mM氯化鉀、 9 IlmM 硫酸銨、0. 1 0. 2% Triton X-100 或 Tween 20、1. 2 1. 4 mM dNTP、0. 7 0. 9 M 甜菜堿、1. 6 2. ΟμΜ 引物MRDV-FIP、1. 6 2. 0 μ M 引物 MRDV_BIP、0. 2 0. 25 μ M 引物 MRDV-F3、0. 2 0. 25 μ M 引物 MRDV-B3。所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的RT-LAMP預(yù)反應(yīng)液中還含有0. 6 1. 2 μ M引物MRDV-LB和0. 6 1. 2 μ M引物MRDV-LF，
引物MRDV -LF核苷酸序列如SEQ No. 5所示， 引物MRDV -LB核苷酸序列如SEQ No. 6所示。所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于檢測試劑盒還具有陽性對照試樣和陰性對照試樣，所述陽性對照試樣為羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組RNA， 所述的陰性對照試樣為無核酸去離子水。所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的RT-LAMP預(yù)反應(yīng)液中還含有0. 8 1. 0 μ M引物MRDV-LB和0. 8 1. 2 μ M引物MRDV-LF。所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測方法，其特征在于包括以下步驟
1)羅氏沼蝦RNA抽提利用RNA提取試劑抽提羅氏沼蝦RNA；
2)羅氏沼蝦雙順反子病毒的RT-LAMP擴增
a)根據(jù)待檢測樣品的數(shù)目，設(shè)置所需RT-LAMP反應(yīng)管數(shù)N，N=樣品數(shù)+2，其中1管為陽性對照，1管為陰性對照；
b)吸取RT-LAMP預(yù)反應(yīng)液的體積為NX22.5 μ L，加入1. 5mL離心管中，然后加入N μ L Bst DNA聚合酶和Ν/2 μ L AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，混合均勻，1500 2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，取上清的混合液；
c)向上述設(shè)定的N個反應(yīng)管中分別加入Mu L步驟b)所得的混合液，并向N個反應(yīng)管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對照、待檢模板RNA和陽性對照RNA各1 μ L ；
d)在每個反應(yīng)管中再分別加入30u L RT-LAMP反應(yīng)穩(wěn)定液，蓋緊管蓋并做好標記， 2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒；
e).在61°C 67°C下恒溫反應(yīng)40 70分鐘；
3)顯色檢測
取出RT-LAMP反應(yīng)管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入1 μ L RT-LAMP反應(yīng)顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測方法，其特征在于所述的步驟1)羅氏沼蝦RNA提取包括以下步驟取羅氏沼蝦幼體頭胸部或是成蝦鰓組織0. 1 0. 2g，于冰上用研磨棒研磨，加300 μ L Trizol后，繼續(xù)研磨充分后加Trizol至lmL，旋渦震蕩1分鐘，室溫5分鐘，加入200 μ L氯仿，旋渦震蕩30秒，室溫靜置3分鐘，12000g離心10分鐘；取上層水相于新的EP管中，加入500 μ L異丙醇，室溫放置10分鐘后，12000g離心IOmin ；移去上清，沉淀用70%乙醇洗滌2次，室溫干燥5 IOmin后以DEPC處理的去離子水重懸，得到待測羅氏沼蝦RNA。本發(fā)明所述的引物是根據(jù)在線軟件I^rimerExplorer V4(http:// primerexplorer. jp/e/)設(shè)計和手工修改而得，這六條引物能特異識別靶序列的八個不同位點，增加了擴增的特異性，并在反應(yīng)中產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中引物MRDV-FIP 核苷酸序列(SEQ No. 1)為TCACGCAACACAAATTCTCGCTTTT TTCCACCTCCTTATCGCTCT ；
引物 MRDV-BIP 核苷酸序列(SEQ No. 2)為 GGTTGCTCCATTGGCCAAGAACATTTTGCAACAACGC TTCCTGTG ；
引物 MRDV-F3 核苷酸序列(SEQ No. 3)為 CTGATGAAACAAAGAGTGGGTC ； 引物 MRDV-B3 核苷酸序列(SEQ No. 4)為 TTCAAACGAAGCAATCCGTG ； 引物 MRDV -LF 核苷酸序列(SEQ No. 5)為 TTAGAAACGACACTTCAGACAA ； 引物 MRDV -LB 核苷酸序列(SEQ No. 6)為 CGATTGAAGATATGTGTATGTGG。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點
(1)本發(fā)明根據(jù)靶基因序列設(shè)計了羅氏沼蝦雙順反子病毒檢測用引物組，該靶基因序列如SEQ No. 7所示。本發(fā)明中設(shè)計的引物組能特異性識別靶序列上的八個獨立區(qū)域，在 BstDNA聚合酶的作用下啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標cDNA區(qū)啟動互補鏈合成，在同一鏈上互補序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖一環(huán)DNA混合物，由于LAMP技術(shù)只有在四條引物完全識別靶序列六個結(jié)合區(qū)的情況下才能順利進行，所以本發(fā)明的引物組在很大程度上減少了擴增反應(yīng)的背景影響，大大增強了羅氏沼蝦雙順反子病毒檢測的特異性；
(2)采用本發(fā)明的引物組對羅氏沼蝦雙順反子病毒進行檢測，因為特異性高，所以可以根據(jù)是否擴增就能判斷目標基因的存在與否；
(3)本發(fā)明的快速診斷試劑盒是利用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測羅氏沼蝦雙順反子病毒，檢測靈敏度高，擴增模板僅需20拷貝；
(4)本發(fā)明的快速診斷試劑盒不但反應(yīng)條件溫和，且所需儀器簡單，也不需要特殊試劑，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本高等缺點；
(5)本發(fā)明的快速診斷試劑盒擴增快速且高效，在不到Ih即可完成擴增，且產(chǎn)率高；
(6)本發(fā)明的快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的 Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠；
(7)本發(fā)明的快速診斷試劑盒操作簡單，對檢測人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，可建立成本低廉的快速篩選體系，實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測；
(8)本發(fā)明的快速診斷試劑盒建立了一套經(jīng)過優(yōu)化的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系，不但使得羅氏沼蝦雙順反子病毒定性檢測更加簡便快速、特異性高、靈敏度高，而且該試劑盒是檢測羅氏沼蝦雙順反子病毒的第一個試劑盒，填補了羅氏沼蝦雙順反子病毒無檢測方法的缺口，具有很高的科研和經(jīng)濟價值。


圖1引物特異性測試M. IOObp DNA Marker ； 1.羅氏沼蝦雙順反子病毒；2.羅氏沼蝦諾達病毒(MRNV)； 3.對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV) ； 4.對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)； 5.陰性對照。圖2靈敏性檢測M. IOObp DNA Marker ； 1. 1. 5X IO5 copies ；2. 1. 5X IO4 copies ；3. 1. 5X IO3 copies ；4. 1. 5X IO2 copies ；5. 1. 5X IO1 copies ；6. 1. 5 copies ；7.陰性對照。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例來進一步說明本發(fā)明。實施例1
1)用RNA提取試劑抽提RNA (RNA提取試劑為現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)試劑，其含有Trizol 試劑、氯仿、異丙醇、無RNase的70%乙醇和DEPC水)
取羅氏沼蝦幼體頭胸部或是成蝦鰓組織0. 1,0. 15或0. 2g，于冰上用研磨棒研磨，加 300 μ L Trizol后，繼續(xù)研磨充分后加Trizol至lmL，旋渦震蕩1分鐘，室溫5分鐘，加入 200 μ L氯仿，旋渦震蕩30秒，室溫靜置3分鐘，12000g離心10分鐘，取上層水相于新的EP 管中，加入500 μ L異丙醇，室溫放置10分鐘后，12000g離心IOmin ；移去上清，沉淀用70% 乙醇洗滌2次，室溫干燥5、8或IOmin后以DEPC處理的去離子水重懸，分裝，得到提羅氏沼蝦RNA，置-80°C保存。2)反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增羅氏沼蝦雙順反子病毒特異基因區(qū)
a)根據(jù)待檢測樣品的數(shù)目，設(shè)置所需RT-LAMP反應(yīng)管數(shù)N(N大于等于1)，N=樣品數(shù) +1管陽性對照+1管陰性對照；
b)吸取RT-LAMP預(yù)反應(yīng)液(RT-LAMP預(yù)反應(yīng)液含有20 25mMpH為8. 2 9. 0的 iTris-HClj IOmM硫酸鎂、10 12mM氯化鉀、8 12mM硫酸銨、0. 1 0. 2% Triton X-100 或 Tween 20、1 1.6 mM dNTP、0. 6 1. 0 M 甜菜堿、1.5 2. 2 μ M 引物 MRDV-FIP、1. 5 2.2 口] 引物1 0￥-81卩、0.15 0.3 μ M 引物 MRDV_F3、0. 15 0. 3 口] 引物1 0￥-83，引物MRDV-FIP核苷酸序列如SEQ No. 1所示，引物MRDV-BIP核苷酸序列如SEQ No. 2所示，引物MRDV-F3核苷酸序列如SEQ No. 3所示，引物MRDV-B3核苷酸序列如SEQ No. 4所示)的體積為NX22.5 PL，加入一潔凈的1. 5mL離心管中，然后加入N μ L Bst DNA聚合酶(每微升含8個活性單位的Bst DNA聚合酶)和Ν/2 μ L AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(每微升含10個活性單位的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶)，混合均勻，1500、1800或2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，取上清之混合液；
c)向設(shè)定的N個反應(yīng)管中分別加入MyL上述混合液，再向上述N個PCR反應(yīng)管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對照(無核酸去離子水)、待檢模板RNA和陽性對照(羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組RNA)各1 μ L ；
d)然后在上述每個反應(yīng)管中再分別加入30μ L PT-LAMP反應(yīng)穩(wěn)定液(由礦物油或液體石蠟油組成)，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，蓋緊管蓋并做好標記；
6)在611、631、651或671下恒溫反應(yīng)40、50、60或70分鐘，然后在80°C滅活5min。
3)取出RT-LAMP反應(yīng)管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入1 μ LPT-LAMP反應(yīng)顯色液(含有10 % SYBR Green I的熒光染料)，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化或用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳后用溴化乙錠染色。RT-LAMP預(yù)反應(yīng)液電泳結(jié)果在紫外分析儀下觀察，可發(fā)現(xiàn)階梯狀的擴增特征條帶， 說明樣品中有羅氏沼蝦雙順反子病毒。實施例1中RT-LAMP預(yù)反應(yīng)液也可以采用21 MmM ρΗ為8. 2 9. 0的Tris-HCl、 7 9mM硫酸鎂、11 12mM氯化鉀、9 IlmM硫酸銨、0. 1 0. 2% Triton X-100或Tween 20、1.2 1.4 mM dNTP、0. 7 0. 9 M 甜菜堿、1. 6 2. 0 μ M 引物 MRDV-FIP、1. 6 2. 0 μ M 引物 MRDV-BIP、0. 2 0. 25 μ M 引物 MRDV_F3、0. 2 0. 25 μ M 引物 MRDV-B3 ；
或采用20 25mM ρΗ為8. 2 9. 0的Tris_HCl、6 IOmM硫酸鎂、10 12mM氯化鉀、 8 12mM 硫酸銨、0. 1 0. 2% Triton X-100 或 Tween 20、1 1. 6 mM dNTP、0. 6 1. 0 M 甜菜堿、1. 5 2. 2 μΜ 引物 MRDV-FIP、1. 5 2. 2 μ M 引物 MRDV_BIP、0. 15 0. 3μ M 引物 MRDV-F3、。· 15 0. 3 μ M 引物 MRDV_B3、0. 6 1. 2 μ M 引物 MRDV-LB 和 0. 6 1. 2 μ M 引物 MRDV-LF，引物MRDV-LF核苷酸序列如SEQ No. 5所示，引物MRDV -LB核苷酸序列如SEQ No. 6 所示。采用上述快速診斷試劑盒和方法進行RT-LAMP檢測羅氏沼蝦雙順反子病毒特異性和靈敏性試驗結(jié)果如附圖1和2所示。圖1引物種特異性測試圖，如1圖所示，僅羅氏沼蝦雙順反子病毒能擴增出階梯狀的擴增特征條帶，其它病毒無階梯狀的擴增特征條帶，表明對其它病毒無交叉擴增性。圖2羅氏沼蝦雙順反子病毒靈敏性檢測圖，如圖所示，經(jīng)Real-time PCR定量后的羅氏沼蝦雙順反子病毒RNA系列稀釋的擴增特征條帶顯示，當反應(yīng)體系中加入15個病毒拷貝的RNA，就能擴增出特征條帶。本發(fā)明利用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測羅氏沼蝦雙順反子病毒的檢測方法，在已試驗的4種不同種的病毒進行了檢測，結(jié)果都能達到與實施例1相同的技術(shù)效果。
權(quán)利要求
1.羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于包括RNA提取試劑和 RT-LAMP反應(yīng)試劑，所述的RNA提取試劑含有Trizol、氯仿、異丙醇、無RNase的70%乙醇和DEPC水；所述的RT-LAMP反應(yīng)試劑含有URT-LAMP 預(yù)反應(yīng)液20 25mM pH 為 8. 2 9. O 的 Tris-HCl、6 IOmM硫酸鎂、10 12mM 氯化鉀、8 12mM 硫酸銨、0. 1 0. 2% Triton X-100 或 Tween 20、1 1.6 mM dNTP、 0. 6 1. 0 M 甜菜堿、1. 5 2. 2 μ M 引物 MRDV-FIP、1. 5 2. 2 μ M 引物 MRDV_BIP、0. 15 0. 3 μ M 引物 MRDV-F3、0. 15 0. 3 μ M 引物 MRDV-B3，引物MRDV-FIP核苷酸序列如SEQ No. 1所示，引物MRDV-BIP核苷酸序列如SEQ No. 2所示，引物MRDV-F3核苷酸序列如SEQ No. 3所示，引物MRDV-B3核苷酸序列如SEQ No. 4所示；2)逆轉(zhuǎn)錄酶每微升含10個活性單位的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶；3)聚合酶每微升含8個活性單位的BstDNA聚合酶；4)RT-LAMP反應(yīng)穩(wěn)定液由礦物油或液體石蠟油組成；5)RT-LAMP反應(yīng)顯色液含有10 % SYBR Green I的熒光染料。
2.如權(quán)利要求1所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的RT-LAMP預(yù)反應(yīng)液含有21 MmM pH為8. 2 9. 0的Tris_HCl、7 9mM硫酸鎂、11 12mM氯化鉀、9 IlmM硫酸銨、0. 1 0. 2% Triton X-100或Tween 20、1.2 1.4 mM dNTP、 0. 7 0. 9 M 甜菜堿、1. 6 2. 0 μ M 引物 MRDV-FIPU. 6 2. 0 μ M 引物 MRDV_BIP、0. 2 0.25 口] 引物1 0￥-卩3、0.2 0.25 口1引物1 0乂-83。
3.如權(quán)利要求1所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的 RT-LAMP預(yù)反應(yīng)液中還含有0. 6 1. 2 μ M引物MRDV-LB和0. 6 1. 2 μ M弓丨物MRDV-LF，引物MRDV -LF核苷酸序列如SEQ No. 5所示，引物MRDV -LB核苷酸序列如SEQ No. 6所示。
4.如權(quán)利要求1或2或3所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于檢測試劑盒還具有陽性對照試樣和陰性對照試樣，所述陽性對照試樣為羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組RNA，所述的陰性對照試樣為無核酸去離子水。
5.如權(quán)利要求3所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的 RT-LAMP預(yù)反應(yīng)液中還含有0. 8 1. 0 μ M引物MRDV-LB和0. 8 1. 2 μ M引物MRDV-LF。
6.羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)羅氏沼蝦RNA抽提利用RNA提取試劑抽提羅氏沼蝦RNA；2)羅氏沼蝦雙順反子病毒的RT-LAMP擴增a)根據(jù)待檢測樣品的數(shù)目，設(shè)置所需RT-LAMP反應(yīng)管數(shù)N，N=樣品數(shù)+2，其中1管為陽性對照，1管為陰性對照；b)吸取RT-LAMP預(yù)反應(yīng)液的體積為NX22. 5 μ L，加入1. 5mL離心管中，然后加入NyL Bst DNA聚合酶和Ν/2 μ L AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，混合均勻，1500 2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，取上清的混合液；c)向上述設(shè)定的N個反應(yīng)管中分別加入MuL步驟b)所得的混合液，并向N個反應(yīng)管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對照、待檢模板RNA和陽性對照RNA各1 μ L ；d)在每個反應(yīng)管中再分別加入30u L RT-LAMP反應(yīng)穩(wěn)定液，蓋緊管蓋并做好標記， 2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒；e).在61°C 67°C下恒溫反應(yīng)40 70分鐘； 3)顯色檢測取出RT-LAMP反應(yīng)管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入1 μ L RT-LAMP反應(yīng)顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。
7.如權(quán)利要求6所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測方法，其特征在于所述的步驟1)羅氏沼蝦RNA提取包括以下步驟取羅氏沼蝦幼體頭胸部或是成蝦鰓組織0. 1 0. 2g，于冰上用研磨棒研磨，加300 μ L Trizol后，繼續(xù)研磨充分后加Trizol至lmL，旋渦震蕩1分鐘，室溫5分鐘，加入200 μ L氯仿，旋渦震蕩30秒，室溫靜置3分鐘，12000g離心 10分鐘；取上層水相于新的EP管中，加入500 μ L異丙醇，室溫放置10分鐘后，12000g離心 IOmin ；移去上清，沉淀用70%乙醇洗滌2次，室溫干燥5 IOmin后以DEPC處理的去離子水重懸，得到待測羅氏沼蝦RNA。
全文摘要
羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒及檢測方法，屬于靶DNA片斷的檢測技術(shù)領(lǐng)域。該檢測試劑盒包括RNA提取試劑和RT-LAMP反應(yīng)試劑，該檢測方法包括1)羅氏沼蝦RNA抽提；2)羅氏沼蝦雙順反子病毒的RT-LAMP擴增3)顯色檢測。該檢測試劑盒特異性強，敏感性高，該檢測方法方便、靈敏、準確、快速，為羅氏沼蝦幼體綜合癥的預(yù)防奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/70GK102277453SQ20111023977
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月19日
發(fā)明者姚嘉赟, 尹文林, 徐洋, 曹錚, 沈錦玉, 潘曉藝, 郝貴杰 申請人:浙江省淡水水產(chǎn)研究所