專利名稱：非均相酶催化劑、制備方法和用途的制作方法
非均相酶催化劑、制備方法和用途本發(fā)明涉及非均相酶催化劑、制備此類酶催化劑的方法及其通過在非均相中的酶催化進行化學反應的用途。酶催化劑屬于“綠色”化學和可持續(xù)發(fā)展的范疇。它使得能夠進行各種化學反應同時將溶劑的使用最小化并且支持使用生物前體。考慮到酶的高價格(特別是歸因于它們的制備和純化成本)，能夠在它們催化的反應完成時將它們從所述反應介質(zhì)中容易地回收是重要的。已提出的解決這一問題的方法之一在于將所述酶固定在固體載體上。于是這被稱作非均相酶催化。非均相催化(或接觸催化)的目的是通過使用固體催化劑來轉(zhuǎn)化液體反應物或氣體反應物。由于所述反應物吸附在所述固體的表面，所以化學過程發(fā)生在固-液界面。目前提出的各種酶催化系統(tǒng)主要由固體的、通常多孔的載體(聚合物基質(zhì)、膠體二氧化硅、硅酸鈣、沸石、鋯、高嶺石、多孔玻璃、氧化鋁等)組成，純化的酶被固定于所述載體上。這些系統(tǒng)使得能夠在所述反應結(jié)束時容易地回收酶。然而，它們具有一個主要的缺點，因為酶在被固定于固體載體上之前必須首先經(jīng)過純化，這不可避免地增加了這些催化系統(tǒng)的成本價格。一些作者還提出摻入未純化的酶的非均相酶催化劑。美國專利6，004, 786具體記載了這樣一種非均相酶催化劑，其由例如多孔玻璃、膨潤土、硅膠、膠體二氧化硅、二氧化硅-氧化鋁羥基磷灰石、磷酸鈣凝膠等的固體載體組成，用具有羧酸酯官能的硅烷型偶聯(lián)劑將未純化的脂肪酶固定化于其上/其中。但是，該美國專利6，004，786的實施例證明，在所使用載體上固定未純化的脂肪酶只有在使用具有羧酸酯官能的偶聯(lián)劑時表現(xiàn)出在催化活性方面令人滿意的結(jié)果。在這一方面，用不具有羧酸官能的偶聯(lián)劑即Y-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(γ-glycidoxypropyltrimethoxysilane)(還已知商品名為GLYM0)進行的比較性脂肪酶固定試驗沒有得到催化活性方面的好結(jié)果。因此，不可能使用任何偶聯(lián)劑將未純化的酶固定于固體載體上/內(nèi)。還提出了(特別是在美國專利6，025，171中)將未純化的兩親酶例如脂肪酶固定于糖(淀粉、右旋糖、纖維素衍生物等)上。然而，盡管此類載體具有提高的熱穩(wěn)定性，但是它們的重復使用涉及每一次催化反應后的系統(tǒng)性再生步驟，這從工業(yè)角度而言是不實際的并且妨礙它們在連續(xù)酶催化過程中的使用。另外，這些載體在極性介質(zhì)(水和其它極性溶齊U)中的部分或完全溶解性妨礙它們在任何循環(huán)式或連續(xù)流式催化過程中的使用。最后， 也不能設想它們在制備生物柴油中的用途，因為新形成的化合物均能夠溶解上述載體。因此需要這樣的非均相酶催化劑，其-使得能夠以非常高的催化效率使用未純化的酶，-能夠重復使用很多次而不顯著喪失催化活性，-能夠用于極性介質(zhì)和/或連續(xù)催化過程中(不需要中間的再生步驟)，以及-能夠按照易于實施的方法特別是使用常規(guī)的偶聯(lián)劑制備。通過作為本發(fā)明的主題并且將在下文中進行描述的非均相酶催化劑實現(xiàn)這一目
5的。本發(fā)明的一個主題是非均相酶催化劑，其特征在于它的形式為由二氧化硅基質(zhì)或有機改性的二氧化硅基質(zhì)組成的多孔整體，所述整體包括平均大小dA為1 μ m-100 μ m的大孔、平均大小dE為2-50nm的中孔和平均大小(I1為0. 7-1. 5nm的微孔，所述孔相互連接，并且其中所述大孔的內(nèi)表面被選自硅烷的偶聯(lián)劑官能化，未純化的酶通過共價鍵或靜電鍵與所述偶聯(lián)劑連接。在本發(fā)明的背景中，“未純化的酶”這一表述應理解為表示包含至少一種未經(jīng)過純化步驟的未分離的酶的蛋白質(zhì)物質(zhì)。術(shù)語“整體”應理解為平均大小至少為Imm的固體物體。如舉例說明本申請的實施例所證明的，此類整體的使用使得可以使用未純化的酶，這從經(jīng)濟學角度而言是非常有利的。確實，用選自硅烷的偶聯(lián)劑將未純化的酶固定于此類整體的大孔內(nèi)得到了這樣的非均相酶催化劑，其具有非常高的催化活性和非常高的可循環(huán)性，所述催化活性通常達到所述酶以純化狀態(tài)或非固定狀態(tài)使用時的理論催化活性的 100%。本發(fā)明人還證明了當將未純化的酶固定化于此類整體內(nèi)時，其反應動力學提高。在該整體中，所述大孔的壁的厚度通常為0. 5-40 μ m,并且優(yōu)選為2-25 μ m。根據(jù)本發(fā)明，所述微孔存在于所述大孔的壁的厚度內(nèi)，因此使得它們是微孔性的。所述整體的比表面積通常為約200-1000m2/g，優(yōu)選約300-700m2/g。當所述多孔整體由有機改性的二氧化硅基質(zhì)組成時，所述二氧化硅攜帶對應下式 (I)的有機基團R -(CH2)n-R1 (I)其中-0彡η彡5，并且-R1表示巰基，通過氮與-(CH2)n-基團連接的C4H3N-吡咯基團，任選地攜帶一個或多個任選取代的烷基、烷基氨基或芳基取代基的氨基，烷基(優(yōu)選具有1-5個碳原子)， C2-C21單羥基烷基或多羥基烷基，苯基，或被烷基優(yōu)選甲基取代的苯基。具體而言，所述有機基團R可以是-3-巰基丙基；-3-氨基丙基；-N-(3-丙基)吡咯基；-N- (2-氨基乙基)-3-氨基丙基；-3- (2，4- 二硝基苯基氨基)丙基；-苯基或芐基；-甲基；或者-式-(CH2OH-CH2OH),-CH2OH 或 _ (CH2OH-CH2OH) ,-CH2CH3 的基團，其中q是1-10的整數(shù)。所述多孔整體的二氧化硅基質(zhì)還可包含一種或多種金屬氧化物MO2，其中M是選自 Zr、Ti、Th、Nb、Ta、V、W*Al的金屬。在這種情況下，所述二氧化硅基質(zhì)是SiO2-MO2型混合基質(zhì)。在此類混合基質(zhì)中，優(yōu)選SiO2-ZiO2型混合基質(zhì)。當所述二氧化硅基質(zhì)是混合基質(zhì)時，相對于所述二氧化硅或所述有機改性的二氧化硅的重量，金屬氧化物MO2的含量優(yōu)選占10-50重量％。根據(jù)本發(fā)明，確保所述偶聯(lián)劑與所述二氧化硅，或者在有機改性的二氧化硅的情況下與所述二氧化硅的R基團的連接的鍵是離子共價鍵。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，所述偶聯(lián)劑選自硅烷，所述硅烷選自 Y-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷；含甲硅烷基的離子液體，例如1-甲基-3-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)氯化咪唑鐺或1-甲基-3-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)咪唑六氟磷酸鹽；式Si (OR2)3R3的硅烷，其中R2表示C1-C2烷基并且R3表示-(CH2OH-CH2OH),-CH2OH 或-(CH2OH-CH2OH)q-CH2CH3 基團，其中 q 是 1_10 的整數(shù)。在此類硅烷中，特別優(yōu)選還已知其商品名為Glymo的γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基娃焼。能夠用所述偶聯(lián)劑固定于所述二氧化硅整體上的酶的性質(zhì)不是關鍵性的，只要它包含至少一個能夠與所述偶聯(lián)劑攜帶的互補官能團反應以形成離子共價鍵的官能團。當所使用的偶聯(lián)劑是含甲硅烷基的離子液體時，這些是靜電鍵。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，所述未純化的酶選自i)水解酶類(酶學委員會(布魯塞爾)制定的分類的EC 3類)，例如酯酶類(EC
3.1)，特別是羧酸酯水解酶類(EC 3. 1. 1)，例如脂肪酶(EC 3. 1. 1. 3或三?；视王；饷?；?；被崴饷割?EC 3. 5. 1. 14)；酰胺酶類(EC 3. 5. 1. 4 ；EC 3. 5. 1. 3或ω-酰胺酶；EC 3. 5. 1. 11或青霉素酰胺酶)；催化腈水解成羧酸的腈水解酶類(EC 3. 5. 5. 1類)；ii)裂合酶類(EC 4類)，特別包括羧基裂合酶類(EC 4. 1.2)、醛裂合酶類(EC
4.1. 2)例如催化手性羥腈的合成的醇腈酶類(EC 4. 1. 2. 10類和EC4. 1. 2. 37類)；以及水裂合酶類(EC 4. 2. 1)；iii)異構(gòu)酶類(EC 5)，特別包括差向異構(gòu)酶類和消旋酶類(EC 5. 1.)，尤其是催化形成氨基酸的對映異構(gòu)體的EC 5. 1. 1類的差向異構(gòu)酶和消旋酶；以及iv)氧化還原酶類(EC 1)，特別包括葡萄糖氧化酶類(EC 1. 1. 3. 4)，例如黑曲霉菌(Aspergillus niger)葡萄糖氧化酶和過氧化物酶類(EC 1. 11. 1)，如辣根過氧化物酶。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，所述未純化的酶選自微生物源或植物源的脂肪酶，特別是選自皺褶假絲酵母(Candida rugosa)、南極假絲酵母(Candida antarctica)、 黑曲霉菌、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)、疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)、粘稠色桿菌(Chromobacterium viscosum)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)、婁地青霉菌(Penicillium roqueforti)、擴展青霉菌(Penicillium expansum) 和無根根霉菌(Miizopus arrhizus)的脂肪酶以及小麥胚芽脂肪酶?？赏ㄟ^熱重量分析和元素分析測定固定于本發(fā)明的催化劑內(nèi)的酶的量。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，以所述催化劑的總重計，被固定的未純化的酶的量是約3-40重量％，并且更優(yōu)選是約10-20重量％。本發(fā)明的另一主題是制備根據(jù)本發(fā)明并且如上定義的非均相酶催化劑的方法， 所述方法包括制備形式為由二氧化硅或有機改性的二氧化硅組成的多孔整體的固體二氧化硅模板的第一步驟，所述整體包含平均大小4為ΙΙμπι-ΙΟΟμπι的大孔、平均大小(^為 2-50nm的中孔和平均大小(I1為0. 7-1. 5nm的微孔，所述孔相互連接，所述方法的特征在于其還包括以下步驟-通過用選自硅烷的偶聯(lián)劑在有機溶劑中的溶液真空浸漬所述多孔整體，用所述偶聯(lián)劑將所述大孔的內(nèi)表面官能化的第二步驟；-用至少一種未純化的酶的水溶液或水分散液真空浸漬如此官能化的整體的第三步驟。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述第一步驟中所述二氧化硅模板的制備是根據(jù)專利申請FR-A1-2 852 947和FR-Al-2 912 400中記載的方法進行的。這些方法大體上為-通過向表面活性劑水溶液中加入油相來制備乳液；-在制備所述乳液之前或之后向所述表面活性劑溶液中加入至少一種二氧化硅前體和/或至少一種有機改性的二氧化硅前體的水溶液；-將反應混合物靜置直到所述前體已凝結(jié)(condensed)；然后-將所述混合物干燥以獲得預期的固體二氧化硅模板。在這一情況下，所述二氧化硅前體或有機改性的二氧化硅前體可選自下式(II) 的硅烷氧化物(silica alkoxide)R4p(OR5)4^pSi (II)其中-R4表示具有1-5個碳原子的烷基或任選地攜帶一個或多個官能團的芳基；-R5表示具有1-5個碳原子的烷基或下式(I)的基團-(CH2)n-R1 (I)其中0彡η彡5，并且R1選自巰基，通過氮與-(CH2)n-基團連接的C4H3N-吡咯基團，任選地攜帶一個或多個任選取代的烷基、烷基氨基或芳基取代基的氨基，烷基(優(yōu)選具有1-5個碳原子)，C2-C21單羥基烷基或多羥基烷基，苯基，或被烷基優(yōu)選甲基取代的苯基； 并且-ρ是等于0、1、2或3的整數(shù)。在一個實施方案中，式(II)的前體包含單一類型的式(I)的基團。在另一個實施方案中，式(II)的前體包含至少兩種不同類型的式(I)的基團。具體而言，式(I)的有機基團可以是-3-巰基丙基；-3-氨基丙基；-N- (3-丙基)吡咯基團；-N- (2-氨基乙基)-3-氨基丙基；-3- (2，4- 二硝基苯基氨基)丙基；-苯基或芐基；-甲基；或-式-(CH2OH-CH2OH),-CH2OH 或 _ (CH2OH-CH2OH) ,-CH2CH3 的基團，其中q是1-10的整數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，式(I)的前體選自四甲氧基正硅烷(TMOS)、 四乙氧基正硅烷(TEOS)、二甲基二乙氧基硅烷(DMDES)、(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷、3_(氨基丙基)三乙氧基硅烷、N-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)吡咯、3-(2，4-二硝基苯基氨基)丙基三乙氧基硅烷、N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、苯基三乙氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷以及它們的混合物。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，所述式(I)的前體選自TEOS、TEOS和DMDES 的混合物(其中相對于所述TE0S，所述DMDES占5_30重量％ )以及TM0S。所述水溶液中的二氧化硅前體和/或有機改性的二氧化硅前體的濃度優(yōu)選相對于所述水相的重量而言大于10重量％。更優(yōu)選地，相對于所述水相的重量，該濃度為17-35
重量％。根據(jù)本發(fā)明的一個特定的實施方案，并且當所述二氧化硅基質(zhì)或有機改性的二氧化硅基質(zhì)還包含至少一種金屬氧化物MO2 (其中M是選自Zr、Ti、Th、Nb、Ta、V、W和Al的金屬)時，所述二氧化硅前體或有機改性的二氧化硅前體的水溶液還包含至少一種所述金屬氧化物的前體，所述前體是選自下式(III)的化合物M(OR6)4 (III)其中-M 是選自 Zr、Ti、Th、Nb、Ta、V、W 和 Al 的金屬；并且-R6是C1-C4烷基，優(yōu)選甲基或乙基。所述油相優(yōu)選由一種或多種選自具有至少12個碳原子的直鏈烷烴或支鏈烷烴的化合物形成。作為實例，可提及十二烷和十六烷。所述油相還可由低粘度(即低于400厘泊)的硅油形成?？筛鶕?jù)所述二氧化硅模板中要獲得的大孔的期望的直徑調(diào)節(jié)存在于所述乳液中的油相的量，應理解油/水體積分數(shù)越高，所述乳液中油滴的直徑越小并且同樣地所述大孔的直徑越小。一般而言，以所述乳液的總體積計，所述油相占60-90體積％。該油量使得可以獲得其中所述大孔的平均直徑為約1-100 μ m的二氧化硅模板。所述表面活性劑化合物可為特別是選自十四烷基三甲基溴化銨(TTAB)、十二烷基三甲基溴化銨和十六烷基三甲基溴化銨的陽離子型表面活性劑。當所述表面活性劑化合物是陽離子型的時，使所述反應混合物的PH低于3，優(yōu)選低于1。特別優(yōu)選十四烷基三甲基溴化銨。所述表面活性劑化合物還可以是選自十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉和二辛基磺化琥珀酸鈉(AOT)的陰離子型表面活性劑。當所述表面活性劑化合物是陰離子型的時， 使所述反應混合物的PH高于10。最后，所述表面活性劑化合物可為選自具有乙氧基化的首基的表面活性劑和壬基酚類的非離子型表面活性劑。在此類表面活性劑中，可特別提及BASF以商品名Pluronic P123和PluroniC F127出售的乙二醇和丙二醇嵌段共聚物。當所述表面活性劑化合物是非離子型的時，使所述反應混合物的PH高于10或低于3，優(yōu)選低于1，并且所述反應混合物還優(yōu)選包含氟化鈉以增強所述二氧化硅前體的凝結(jié)(condensation)。還可根據(jù)所述二氧化硅模板中要獲得的大孔的期望的直徑調(diào)節(jié)存在于所述乳液中的表面活性劑的總量。該量可隨所使用的表面活性劑的性質(zhì)而變化。一般而言，以所述乳液的總重計，表面活性劑的量為約1-10重量％，優(yōu)選3-6重量％。使所述二氧化硅前體和/或所述有機改性的二氧化硅前體凝結(jié)的步驟在接近于室溫的溫度下有利地進行。該步驟的持續(xù)時間可為數(shù)小時小時)至數(shù)周周)，視反應介質(zhì)的PH而定。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，用有機溶劑(例如四氫呋喃、丙酮以及它們的混合物)洗滌在所述第一步驟結(jié)束時獲得的二氧化硅模板，然后干燥(例如在烘箱的空氣中或通過冷凍干燥)，然后進行用碳-前體或陶瓷-前體的溶液浸漬的步驟。在偶聯(lián)反應的過程中使用的偶聯(lián)劑溶液的溶劑是有機溶劑，優(yōu)選選自氯仿、甲苯以及它們的混合物。優(yōu)選地，所述溶劑是等份的氯仿和甲苯的混合物?？筛鶕?jù)所述二氧化硅整體的大孔的直徑和期望固定的未純化的酶的量調(diào)節(jié)用于官能化步驟的溶液中的偶聯(lián)劑的量。一般而言，該量可以為0. 02M-0. 5M，優(yōu)選0. 05M-0. 2M。根據(jù)本發(fā)明的一個特定且優(yōu)選的實施方案，使用偶聯(lián)劑在氯仿和甲苯的50/50(w/ w)混合物中的0. IM溶液。優(yōu)選地，用所述偶聯(lián)劑將所述多孔整體官能化的步驟在真空下于室溫下進行約72 小時的持續(xù)時間。優(yōu)選地，固定所述未純化的酶的步驟在真空下于室溫下進行約72小時的持續(xù)時間。優(yōu)選地，用有機溶劑例如四氫呋喃、氯仿或丙酮進行在所述官能化步驟結(jié)束時所述整體的洗滌。最后，將所述整體干燥，優(yōu)選在空氣中干燥約2天。優(yōu)選地，用蒸餾水進行在固定所述未純化的酶的步驟結(jié)束時所述整體的洗滌。本發(fā)明的非均相酶催化劑可用于進行在非均相中被催化的化學反應。當然，能夠被本發(fā)明的催化劑催化的化學反應的性質(zhì)會隨被固定化的未純化的酶的性質(zhì)而變化。因此，當所述未純化的酶是脂肪酶時，本發(fā)明的催化劑用于催化脂肪酸甘油三酯的水解、酸和醇之間的酯化反應、酯和醇之間的酯交換反應、兩種酯之間的酯交換反應或乙?；鶑孽サ桨坊蛄虼嫉霓D(zhuǎn)移反應。具體而言，當所述酶是脂肪酶時，所述催化劑可用于例如催化-油酸丁酯的合成，其為生物柴油的潤滑劑；-甘油-亞油酸酯衍生物的水解以得到肥皂或去污劑；以及-與低粘度生物柴油的合成相關的酯交換反應。通過下文的實施方案的實施例舉例說明本發(fā)明，但是本發(fā)明不限于所述實施例。 實施例以下列出以下實施例中使用的原料-98%十四烷基三甲基溴化銨(TTAB)，來自Fluka ；-98 %四乙氧基正硅烷(TE0Q，來自Fluka ；-99%十二烷，來自 Fluka ；-偶聯(lián)劑SigmaAldrich (St Louis, M0)以商品名Glymo銷售的Y -環(huán)氧丙氧丙
基三甲氧基硅烷；-褶皺假絲酵母脂肪酶，EC3. 1. 1. 3，VII 型，700U/mg，來自 Sigma Chemicals (StLouis, MO)；-疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶，至少100000U/g的溶液，來自SigmaAldrich(St. Louis, MO)；-油酸、三亞油酸甘油酯(98%)、亞油酸乙酯(彡98%)、亞油酸(彡99%)、正庚 @、Zi酉享、1_ TII^ 自 SigmaAldrich (Paris, France)。所述實施例中使用的其它化學品和溶劑均為分析級或HPLC級。以接受自生產(chǎn)商的形式使用這些原材料而未進行另外的純化。表征用JEOL公司出售的于IOkV運行的JSM-840A型掃描電子顯微鏡通過掃描電子顯微鏡(SEM)技術(shù)定性表征大孔隙度(macroporositS)。在對樣品進行表征前用金或碳將它
們鍍膜。使用以名稱Micromeritics Autopore IV出售的儀器，通過壓汞測量法定量大孔隙度，以獲得組成所述整體的骨架的宏觀孔腔(cellules macroscopiques)的特征。使用以名稱Micromeritics ASAP 2010出售的儀器，通過氮吸附-脫吸技術(shù)進行比表面積測量和介觀尺度Qchelle mesoscopique)的表征，通過BET或BJH計算方法進行該分析。使用以Ge晶體(111)作為單色儀的ISkW旋轉(zhuǎn)陽極X-射線源(Rigaku-200)，用小角度X-射線散射(SAXS)對所述整體進行XRD (X-射線衍射)分析。在二維收集器(Imaging Plate system，由Mar Research，Hamburg出售)上收集散射輻射。從檢測器到樣品的距離為 500mm。使用具有80kV的加速電壓并且與feitan Inc.公司出售的Orius IlMPX型的照相機聯(lián)接的Hitachi公司出售的H7650型顯微鏡，通過透射電子顯微術(shù)(TEM)定性表征中孔 PlCiS； (mesoporosite)。在安裝了手動進樣600溶劑泵(Waters，Milford, MA, USA)的系統(tǒng)上以等度洗脫方案使用乙腈作為流動相進行高效液相色譜法(HPLC)分析。在具有Atlantis dC18保護柱(Waters)的Atlantis dC18(4. 6mmX 150mm, 5 μ Μ)色譜柱上分離化合物。在室溫下使用所述柱子。將Empower 軟件(Waters)用于數(shù)據(jù)采集和處理。將標準品溶于甲基叔丁醚 (MTBE) 0所有溶液通過0.45μπι膜過濾并且在使用前脫氣。將液相的流速設為lml/min并且進樣的樣品的體積為20 μ L。使用Waters公司(Milford，MA，USA)出售的410型折光計監(jiān)測被催化的酯化反應。為了檢測從被催化的水解和酯交換反應得到的產(chǎn)物，為系統(tǒng)安裝紫外線(UV) 二極管陣列檢測器(WAT996，Waters, Milford, MA, USA)。在對應最大吸收的 204nm波長處進行測定。使用以下洗脫梯度(溶劑A 乙腈，溶劑B :MTBE) :A/B 100/0 (w/ w)等度洗脫 4 分鐘，A/B :70/30 (w/w)梯度洗脫 anin，A/B :70/30 (w/w)，然后 A/B 100/0 (w/ w)梯度洗脫5分鐘。在上述條件下將柱子平衡10分鐘。實施例1制備摻入酶的二氧化硅整體在該實施例中舉例說明制備二氧化硅整體和在這些整體的大孔內(nèi)固定脂肪酶。1)第一步合成二氧化硅整體(MSi)。將5. 02g TEOS加入16. 02g 35wt% TTAB水溶液中。然后通過加入5. 88g 37%濃
11鹽酸溶液將該溶液酸化。在攪拌下使混合物水解約5分鐘直到獲得單相的親水介質(zhì)(乳液的水相)。然后，在攪拌下將40. Og十二烷(乳液的油相)滴加入該水相中。將混合物轉(zhuǎn)移到充當宏觀模具(moule macroscopique)的圓柱形容器內(nèi)。然后使所述乳液在室溫下以二氧化硅整體的形式凝結(jié)3天。然后用四氫呋喃(THF)將由此合成的二氧化硅整體洗滌三次。然后在室溫下將二氧化硅整體干燥3天，然后于650°C熱處理6小時(采用2°C/min 的溫度升高速率并且在200°C維持2小時)。獲得被命名為MSi的二氧化硅整體。由此獲得的整體具有以下形態(tài)學特征-孔隙率94%-所述整體的密度0.085g. cnT3- 二氧化硅骨架的密度1. 56g. cm_3-蠕蟲型的中孔，兩壁之間的平均距離31人，-比表面積:170m2.glBET)(表明高的大孔隙度)和45m2· g—1 (BJH)(表明低的中孔隙度)。2)第二步用硅烷型偶聯(lián)劑將二氧化硅整體官能化將上文前一步驟中獲得的二氧化硅整體切割成各Ig的幾片。然后用Glymo官能化各片。為此，將各片MSi置于包含Glymo在120g氯仿中的0. Olmol溶液的容器內(nèi)。將懸浮液置于真空下以促進浸漬。在室溫下48小時后，過濾所述懸浮液，然后用氯仿，接著用丙酮洗滌回收的MSi片，最后在空氣中干燥。由此獲得了用Glymo將其大孔的表面官能化的整體(MSi-Glymo)。3)第三步將脂肪酶固定于MSi-Glymo的大孔中將MOmg未純化的皺褶假絲酵母脂肪酶(ICR)分散于18ml蒸餾水中并且混合一小時直到獲得溶液。然后，將250mg MSi-Glymo片加入該脂肪酶水溶液中，然后在室溫下對該混合物進行20mbar真空處理72小時，以用該脂肪酶溶液浸漬MSi-Glymo。將53mg未純化的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(ITL)溶解于IOml蒸餾水中。然后， 將350mg MSi-Glymo片加入該脂肪酶水溶液中，然后在室溫下對該混合物進行20mbar真空處理72小時，以用該脂肪酶溶液浸漬MSi-Glymo。然后從脂肪酶溶液中取出二氧化硅整體，然后用蒸餾水洗滌三次以除去過量的酶，然后在室溫下干燥12小時。由此獲得用Glymo固定脂肪酶的二氧化硅整體 (MSi-Glymo-ICR和MSi-Glymo-ITL)。在將這些整體用作非均相酶催化劑前將它們保存于 4°C。實施例2 ^mMmmimm^.rm ι-τ醇酉旨化油 在該實施例中，根據(jù)以下反應路線進行1- 丁醇(2)酯化油酸(1)的催化反應
權(quán)利要求
1.非均相酶催化劑，其特征在于它的形式為由二氧化硅基質(zhì)或有機改性的二氧化硅基質(zhì)組成的多孔整體，所述整體包含平均大小dA為1 μ m-100 μ m的大孔、平均大小dE為 2-50nm的中孔和平均大小(I1為0. 7-1. 5nm的微孔，所述孔相互連接，并且其中所述大孔的內(nèi)表面被選自硅烷的偶聯(lián)劑官能化，未純化的酶通過共價鍵或靜電鍵與所述偶聯(lián)劑連接。
2.權(quán)利要求1的催化劑，其特征在于所述整體具有200-1000m2/g的比表面積。
3.權(quán)利要求1或2的催化劑，其特征在于所述多孔整體由有機改性的二氧化硅基質(zhì)組成，所述二氧化硅攜帶對應下式(I)的有機基團R -(CH2)n-R1 (I)其中-0 ^ η ^ 5，并且-R1表示巰基，通過氮與-(CH2)n-基團連接的C4H3N-吡咯基團，任選地攜帶一個或多個任選取代的烷基、烷基氨基或芳基取代基的氨基，烷基，C2-C21單羥基烷基或多羥基烷基，苯基，或被烷基取代的苯基。
4.前述權(quán)利要求中任一項的催化劑，其特征在于所述多孔整體的二氧化硅基質(zhì)還包含一種或多種金屬氧化物MO2，其中M是選自Zr、Ti、Th、Nb、Ta、V、W和Al的金屬。
5.權(quán)利要求4的催化劑，其特征在于所述混合基質(zhì)是SiO2-ZiO2型基質(zhì)。
6.前述權(quán)利要求中任一項的催化劑，其特征在于所述偶聯(lián)劑選自硅烷，所述硅烷選自 Y-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷；含甲硅烷基的離子液體；式Si(OR2)3R3的硅烷，其中R2表示 C1-C2 烷基，并且 R3 表示-(CH2OH-CH2OH) ,-CH2OH 或-(CH2OH-CH2OH) ,-CH2CH3 基團，其中 q 是1-10的整數(shù)。
7.權(quán)利要求6的催化劑，其特征在于所述偶聯(lián)劑是Y-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷。
8.前述權(quán)利要求中任一項的催化劑，其特征在于所述未純化的酶選自水解酶類、裂合酶類、異構(gòu)酶類和氧化還原酶類。
9.權(quán)利要求8的催化劑，其特征在于所述未純化的酶是選自酯酶類的水解酶。
10.權(quán)利要求9的催化劑，其特征在于所述未純化的酶是選自羧酸酯水解酶類、?；被崴饷割?、酰胺酶類和腈水解酶類的酯酶。
11.權(quán)利要求10的催化劑，其特征在于所述未純化的酶選自皺褶假絲酵母(Candida rugosa) > it 1 fiSl# (Candida antarctica) > H ^ ‘ (Aspergillus霉菌(Aspergillus oryzae)、疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)、粘稠色桿菌(Chromobacterium viscosum)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)、婁地青霉菌(Penicillium roqueforti)、擴展青霉菌(Penicillium expansum)禾口無根根霉菌 (Rhizopus arrhizus)的脂肪酶以及小麥胚芽脂肪酶。
12.前述權(quán)利要求中任一項的催化劑，其特征在于，以所述催化劑的總重計，被固定的未純化的酶的量為3-40重量％。
13.制備前述權(quán)利要求中任一項定義的非均相酶催化劑的方法，所述方法包括制備形式為由二氧化硅基質(zhì)或有機改性的二氧化硅基質(zhì)組成的多孔整體的固體二氧化硅模板的第一步驟，所述整體包含平均大小dA為1 μ m-100 μ m的大孔、平均大小dE為2-50nm的中孔和平均大小Cl1為0. 7-1. 5nm的微孔，所述孔相互連接，所述方法的特征在于其還包括以下步驟-通過用選自硅烷的偶聯(lián)劑在有機溶劑中的溶液真空浸漬所述多孔整體，用所述偶聯(lián)劑將所述大孔的內(nèi)表面官能化的第二步驟；-用至少一種未純化的酶的水溶液或水分散液真空浸漬如此官能化的整體的第三步馬聚ο
14.權(quán)利要求13的方法，其特征在于所述第一步驟中所述二氧化硅模板的制備是根據(jù)以下方法進行的-通過向表面活性劑水溶液中加入油相來制備乳液；-在制備所述乳液之前或之后向所述表面活性劑溶液中加入至少一種二氧化硅前體和 /或至少一種有機改性的二氧化硅前體的水溶液；-將反應混合物靜置直到所述前體已凝結(jié)；并且然后 -將所述混合物干燥以獲得預期的固體二氧化硅模板。
15.權(quán)利要求14的方法，其特征在于所述二氧化硅前體或有機改性的二氧化硅前體選自下式(II)的硅烷氧化物R4p(0R5)4-PSi (II) 其中-R4表示具有1-5個碳原子的烷基或任選地攜帶一個或多個官能團的芳基； -R5表示具有1-5個碳原子的烷基或下式(I)的基團 -(CH2)n-R1 (I)其中0彡η彡5，并且R1選自巰基，通過氮與-(CH2)η-基團連接的C4H3N-吡咯基團，任選地攜帶一個或多個任選取代的烷基、烷基氨基或芳基取代基的氨基，烷基，C2-C21單羥基烷基或多羥基烷基，苯基，或被烷基取代的苯基；并且 -P是等于0、1、2或3的整數(shù)。
16.權(quán)利要求15的方法，其特征在于式(I)的前體選自四甲氧基正硅烷、四乙氧基正硅烷、二甲基二乙氧基硅烷、(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷、Ν-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)吡咯、3-(2，4-二硝基苯基氨基)丙基三乙氧基硅烷、 N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、苯基三乙氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷以及它們的混合物。
17.權(quán)利要求16的方法，其特征在于式(II)的前體選自四乙氧基正硅烷，四乙氧基正硅烷和二甲基二乙氧基硅烷的混合物，以及四甲氧基正硅烷，在所述混合物中，相對于所述四乙氧基正硅烷，所述二甲基二乙氧基硅烷占5-30重量％。
18.權(quán)利要求13-17中任一項的方法，其特征在于所述二氧化硅基質(zhì)或有機改性的二氧化硅基質(zhì)還包含至少一種金屬氧化物MO2，其中M是選自Zr、Ti、Th、Nb、Ta、V、W和Al的金屬，并且其中所述二氧化硅前體或有機改性的二氧化硅前體的水溶液還包含至少一種所述金屬氧化物的前體，所述前體選自下式(III)的化合物M(OR6)4 (III) 其中-M是選自Zr、Ti、Th、Nb、Ta、V、W和Al的金屬；并且 -R6是C1-C4烷基。
19.權(quán)利要求13-18中任一項的方法，其特征在于所述偶聯(lián)劑溶液的溶劑選自氯仿、甲苯以及它們的混合物。
20.權(quán)利要求1-12中任一項的非均相酶催化劑用于進行在非均相中被催化的化學反應的用途。
21.權(quán)利要求20所述的用途，其特征在于所述未純化的酶是用于催化脂肪酸甘油三酯的水解、酸和醇之間的酯化反應、酯和醇之間的酯交換反應、兩種酯之間的酯交換反應或者乙?；鶑孽サ桨坊蛄虼嫉霓D(zhuǎn)移反應的脂肪酶。
22.權(quán)利要求21的用途，用于催化-油酸丁酯的合成，其為生物柴油的潤滑劑； -甘油-亞油酸酯衍生物的水解以得到肥皂或去污劑；以及 -與低粘度生物柴油的合成相關的酯交換反應。
全文摘要
本發(fā)明涉及非均相酶催化劑，其形式為由二氧化硅基質(zhì)或有機改性的二氧化硅基質(zhì)組成的多孔整體，所述整體包含大孔、中孔和微孔，所述孔相互連接，并且其中所述大孔的內(nèi)表面被選自硅烷的偶聯(lián)劑官能化，其中所述內(nèi)表面還具有通過共價鍵或靜電鍵連接于其上的未純化的酶。本發(fā)明還涉及制備所述催化劑的方法，所述方法包括制備形式為例如上述的多孔整體的固體二氧化硅模板的第一步驟；通過將選自硅烷的偶聯(lián)劑溶解在有機溶劑中，真空浸漬所述多孔整體，用所述偶聯(lián)劑將所述大孔的內(nèi)表面官能化的第二步驟；以及用至少一種未純化的酶的水溶液或水分散液真空浸漬如此官能化的整體的第三步驟。最后，本發(fā)明涉及此類催化劑用于進行催化的化學反應的用途。
文檔編號C12N11/14GK102482663SQ201080034935
公開日2012年5月30日 申請日期2010年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月6日
發(fā)明者A·巴爾博-加西亞, C·桑切斯, N·布蘭, R·貝科夫 申請人:皮埃爾-瑪麗-居里大學(巴黎第六大學)