專利名稱：由木質(zhì)纖維素生物質(zhì)制糖的方法，包括醇-堿脫木質(zhì)化步驟的制作方法
由木質(zhì)纖維素生物質(zhì)制糖的方法，包括醇-堿脫木質(zhì)化步
驟本發(fā)明涉及由木質(zhì)纖維素材料制備碳水化合物分解產(chǎn)物，特別是糖例如戊糖和己糖的方法。此外，本發(fā)明涉及由糖獲得醇的方法。出于本說明書和權(quán)利要求書的目的，術(shù)語 “糖”意在還包括“糖寡聚物”。與原油短缺和玉米作為能源供應(yīng)物的討論相關(guān)，可再生原料木質(zhì)纖維素(秸稈、 木材、廢紙等)在作為用于燃料或化學(xué)產(chǎn)品的起始材料方面是很重要的。木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化可以兩種原則上不同的路徑進(jìn)行1) “熱化學(xué)平臺”，其中首先使木質(zhì)纖維素氣化并且使合成氣合成為希望的產(chǎn)物，和2、“糖平臺”，其中主要的興趣在于利用束縛在聚合物纖維素和半纖維素中的糖，同時木質(zhì)素主要以能量方面被利用。本發(fā)明歸于第二種路徑。與淀粉相反，木質(zhì)纖維素的糖以纖維素和半纖維素的緊密交聯(lián)的聚合結(jié)晶結(jié)構(gòu)形式存在，其另外被木質(zhì)素覆層覆蓋，由此得到極其致密的復(fù)合物。由木質(zhì)纖維素得到糖的最明顯路徑將是直接使用纖維素酶和半纖維素酶。然而，由于上述復(fù)合物的致密性，這在原料秸稈或木材情況下是困難的。由于它們的高分子量，因此酶不能穿過窄的孔進(jìn)入木質(zhì)纖維素。這意味著必須采取增加木質(zhì)纖維素的孔隙度并且由此能夠進(jìn)一步酶促糖化的第一步馬聚ο該第一步驟被稱為“預(yù)處理”(預(yù)先處理，制漿(Aufschluss))。其始終非常復(fù)雜， 以致于例如在“第二代生物燃料”制備期間，必須對其花費(fèi)高達(dá)1/3的生產(chǎn)成本，這對收益率有不利影響。使用的方法目的在于主要液化半纖維素(例如水蒸氣爆炸、稀酸預(yù)處理) 或者通過液化木質(zhì)素(例如石灰、氨預(yù)處理)實現(xiàn)孔隙度增加。為了獲得糖或其寡聚物，可以進(jìn)一步用酶處理制漿的木質(zhì)纖維素底物，其中預(yù)處理的類型可以對酶活性和產(chǎn)率有強(qiáng)烈影響。在高反應(yīng)溫度，常常產(chǎn)生毒性分解產(chǎn)物(例如糠醛)，在緊接著的乙醇發(fā)酵情形中，可能抑制酵母；參見例如Chandra等，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 108:67，2007 ;Mansfield 等，Biotechnol. Prog. 15:804， 1999。這些方法的嚴(yán)重缺點是它們是耗能的并且主要在些微低于200°C的溫度進(jìn)行。在本領(lǐng)域中例如由于開發(fā)低溫方法(即在低于100°C的溫度)的技術(shù)改進(jìn)將意味著原料木質(zhì)纖維素的任何物質(zhì)利用的決定性進(jìn)步。這是本發(fā)明的任務(wù)。從EP 1 025 305 Bl獲知一種木質(zhì)素解聚(Cu體系)的化學(xué)方法。其基于絡(luò)合的銅與過氧化氫或有機(jī)氫過氧化物組合的催化效應(yīng)，并且能夠在低于100°c的溫度氧化分解木質(zhì)素。該方法中使用的絡(luò)合劑是吡啶衍生物。在合成的木質(zhì)素模式上可以表明，當(dāng)使用 H2O2作為氧化劑時，木質(zhì)素分子的醚鍵出現(xiàn)分解，由此木質(zhì)素聚合物分解成低聚的亞單元。 使用Cu體系與過量的有機(jī)氫過氧化物，可以使木材脫木質(zhì)化?；贖2A的體系在工業(yè)上更可行，在牛皮紙漿的過氧化物漂白中作為漂白添加劑試驗并且得到提高的脫木質(zhì)化速度和更高的白度。此夕卜，從“Oxidation of wood and its components in water-organic media，，， Chupka 等，Proceedings: Seventh International symposium on wood and pulpingchemistry,卷 3，373-382，Beijing P. R. China,五月 25-28 日，1993 獲知如果將有機(jī)溶劑例如DMS0、丙酮、乙醇加入含水反應(yīng)介質(zhì)，則木材和木質(zhì)素氧化的堿催化效率顯著增加。此外，作者暗示了在高于11的PH值下，木材和木質(zhì)素氧化出現(xiàn)急劇增加。從WO 01/059204獲知一種制備紙漿的方法，其中將起始材料進(jìn)行預(yù)處理，其中將材料用緩沖液和脫木質(zhì)化催化劑(過渡金屬)處理。脫木質(zhì)化在氧、過氧化氫或臭氧的存在下進(jìn)行。相反，根據(jù)本發(fā)明的制備糖的方法特征在于以下措施的組合
-用包含醇，特別是Cy-醇或酚，并且具有11. 0 - 14. 0的PH-值的水溶液處理木質(zhì)纖維素材料以使木質(zhì)纖維素分解，并且使分解產(chǎn)物從該材料中分離，由此獲得富含纖維素和半纖維素的材料，和
-用至少一種分解碳水化合物的酶處理得到的富含纖維素和半纖維素的材料，以得到碳水化合物分解產(chǎn)物。脂族或脂環(huán)族單或多元醇或酚，例如Cp6-醇，特別是Cy-醇例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，包括它們的異構(gòu)體；二醇(乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇)、甘油、丙烯醇、丁烯醇、環(huán)戊醇、環(huán)己醇、芐醇；或酚例如苯酚、甲酚、兒茶酚、萘酚，以及氨基醇例如乙醇胺、甲醇胺和己醇胺適合作為醇。優(yōu)選Ci_4-醇。為了本專利申請的目的，酚也包括在通稱 “醇”中。此外，木質(zhì)素提取物的醇溶液提供了分別用于進(jìn)一步加工木質(zhì)素和木聚糖分解產(chǎn)物的有利選項。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，醇優(yōu)選以10 — 70體積％，例如20 - 50體積％，優(yōu)選30 —
40體積％的程度存在于水溶液中。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，木質(zhì)纖維素材料優(yōu)選以3-40重量％，例如5-40重量％，特別為5-20重量％的物質(zhì)密度存在于水溶液中。優(yōu)選地，木質(zhì)纖維素在低于100°C，例如低于80°C，例如低于60°C的溫度分解。pH-值可以用堿，優(yōu)選無機(jī)堿，例如氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)。本發(fā)明基于這樣的認(rèn)識用包含醇，特別是CV4-醇或酚，并且具有11. 0 - 14. 0的 PH-值的含水堿性溶液處理的木質(zhì)纖維素材料可以比另外的方式，特別是不加入醇而脫木質(zhì)化的材料更高的產(chǎn)率用酶加工成碳水化合物分解產(chǎn)物，例如糖。主要地，戊糖和己糖作為碳水化合物分解產(chǎn)物形成。優(yōu)選的糖包括木糖和葡萄糖。根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方案特征在于用木聚糖酶和纖維素酶處理富含纖維素和半纖維素的材料以獲得糖。秸稈，能源草例如柳枝稷、象草或馬尼拉麻、劍麻、蔗渣，或非典型的木質(zhì)纖維素底物例如谷殼，例如稻殼，優(yōu)選秸稈、能源草、蔗渣或谷殼，特別優(yōu)選秸稈或蔗渣，例如秸稈被優(yōu)選用作木質(zhì)纖維素材料。秸稈具有高度疏水的表面，以致于用水溶液潤濕其構(gòu)成問題。已經(jīng)表明通過使用醇，即使沒有壓力也可以將反應(yīng)溶液引入底物的孔并且由反應(yīng)溶液代替存在的空氣。此外，表明醇加快分解產(chǎn)物從秸稈中提取并且有助于將木質(zhì)素分解產(chǎn)物保持在溶液中。此外表明，相反，醇降低了半纖維素和其的分解產(chǎn)物的溶解度，并且因此半纖維素保持在底物中。通過在制漿過程后從底物中壓出液相，底物濃度增加，使得需要較小的酶量用于酶促水解或其他酶促的后續(xù)處理。在醇的制備中，酶成本是關(guān)鍵的成本因素。醇導(dǎo)致在堿性范圍內(nèi)反應(yīng)期間除了木質(zhì)素外可能放出的半纖維素和其的分解產(chǎn)物的溶解度急劇降低，并且它們保持結(jié)合在底物上。該方法的優(yōu)點是木質(zhì)素分解的高選擇性，在提取液從固體中分離的情形下在提取液中非常低的半纖維素和其的分解產(chǎn)物濃度，因為半纖維素留在固體含量中并且由此保持用于酶促水解和糖獲取。此外，木質(zhì)素提取物的醇溶液提供了用于進(jìn)一步再加工木質(zhì)素和由木質(zhì)素制備產(chǎn)物的改進(jìn)的可能性。此外，已經(jīng)表明在低于100°C在堿制漿中通過使用醇，特別是CV4-醇或酚，基本上阻止半纖維素分解，使得幾乎所有的半纖維素有效用于進(jìn)一步酶分解和將木糖轉(zhuǎn)化成更高質(zhì)量產(chǎn)物，并且在制漿期間不部分分解(例如在其他過程中出現(xiàn)的)并且將產(chǎn)生木質(zhì)素/糖混合物。通過在制漿中進(jìn)行的脫木質(zhì)化，木質(zhì)纖維素材料的細(xì)胞壁的孔隙度增加，例如在秸稈的情形中增加至使得幾乎所有木糖變得能由木聚糖酶達(dá)到并且約100%的木聚糖可以水解并且可以獲得木糖的程度。這使得根據(jù)本發(fā)明的方法特別適合于制備較高質(zhì)量產(chǎn)物與木糖的酶轉(zhuǎn)化的組合。這樣做，酶轉(zhuǎn)化可以直接在木糖溶液和固體的混合物中直接地，或者用從固體中分離的木糖溶液進(jìn)行。在由剩余固體進(jìn)一步的醇制備中一這在木聚糖酶促水解和根據(jù)本發(fā)明將木糖轉(zhuǎn)化成木糖醇后，酶成本是關(guān)鍵的成本因素。它們部分地還得自于非特定的酶至木質(zhì)素的結(jié)合，參見例如Chandra等，2007，ibidem。木質(zhì)素的部分除去減少了該活性損失并且具有成本節(jié)省效果。隨后的酶方法的優(yōu)點是例如由木質(zhì)素分解的高選擇性得到提取液中非常低的半纖維素和其分解產(chǎn)物濃度，糖聚合物幾乎完全保存，半纖維素留在固體含量中并且由此保持用于酶促水解和糖或其以及其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明的結(jié)果是最大的材料利用率和例如與使用木糖脫氫酶結(jié)合的所述方法的高收益率。木糖轉(zhuǎn)化成木糖醇的過程的實施可以在木糖的酶釋放后直接在根據(jù)本發(fā)明的方法得到的固/液混合物中進(jìn)行，這進(jìn)一步增加了整個方法的收益率。在轉(zhuǎn)化成木糖醇的情形中，得自制漿過程的剩余醇一其在固體壓出后留在底物中一可以直接用作用于NAD再生成NADH的醇脫氫酶的底物。如果出于該目的將方法設(shè)計為使得留在反應(yīng)混合物中的得自制漿的剩余醇(部分)消耗，則醇從產(chǎn)物溶液中除去變得 (部分)多余并且整個方法的效率由此進(jìn)一步增加。在木質(zhì)素分解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的情形中，醇充當(dāng)自由基清除劑和用于得自較高分子木質(zhì)素分解產(chǎn)物的酶、仿生或化學(xué)解聚成低分子物質(zhì)的裂解產(chǎn)物的溶劑。提取物中低的半纖維素和其分解產(chǎn)物含量以及增加的木質(zhì)素溶解度增加了在固體從轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中分離以及它們通過過濾后加工期間的通過率(Durchsatzrate)。根據(jù)本發(fā)明的方法使得例如秸稈的三種主要組分，即葡萄糖、木糖以及木質(zhì)素能夠分離成低干擾物質(zhì)的物料，并且它們進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成更高質(zhì)量產(chǎn)物例如木糖醇，并且因此符合理想的生物精制工藝的要求。與主要在150°C — 200°C的溫度范圍進(jìn)行的其他制漿方法相比，根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)點是其的低于100°c的反應(yīng)溫度。小的能耗允許將制漿期間得到的木質(zhì)素作為有價值的產(chǎn)物，而不是作為制漿方法的能源利用。根據(jù)本發(fā)明的方法，在用包含醇，特別是CV4-醇或酚和H2A的水溶液處理后，分離包含木質(zhì)素的溶液并且將制漿的固體優(yōu)選用木聚糖酶在30-90°C處理例如6-72小時，并且將液相從固體中分離，因此液相優(yōu)選進(jìn)一步反應(yīng)成后續(xù)產(chǎn)物例如木糖醇。液相分離后剩余的固體優(yōu)選用纖維素酶處理，其中通過固體/葡萄糖溶液進(jìn)一步發(fā)酵，可以獲得乙醇、丁醇或其他發(fā)酵產(chǎn)物；或者將剩余的固體進(jìn)行熱或熱化學(xué)轉(zhuǎn)化并且分離所得的產(chǎn)物，例如燃料組分、燃料添加劑和/或其他化學(xué)產(chǎn)物例如酚；或者通過細(xì)菌、酵母或真菌使剩余的固體進(jìn)行微生物物質(zhì)轉(zhuǎn)化；或者將剩余的固體進(jìn)行進(jìn)一步脫木質(zhì)化步驟，用于得到纖維素纖維材料。剩余固體可以在沼氣設(shè)備中發(fā)酵并且可以進(jìn)一步加工成沼氣。木糖的經(jīng)濟(jì)上最感興趣的后續(xù)產(chǎn)物之一是木糖醇。獲得木糖的主要來源是得自紙漿工業(yè)的蒸煮液，其包含豐富的分解產(chǎn)物，主要是木質(zhì)素和半纖維素，以致于木糖必須通過復(fù)雜的分離和精制步驟才能獲得。例如，H. Harms 在"Willkommen in der natiirlichen Welt von Lenzing, weltweit fiihrend in der Cellulosefaser Technologie", Herbsttagung der osterreichischen Papierindustrie, Frantschach (15. 11. 2007)中描述了通過凝膠過濾一一種通常不用于大批量生產(chǎn)的技術(shù)非常復(fù)雜的方法，從濃的堿液中回收木糖。以該方式得到的木糖然后催化轉(zhuǎn)化成木糖醇。在另一個方面中，不發(fā)酵而通過用木糖還原酶，例如得自fe/^ii/a te/wis的木糖脫氫酶轉(zhuǎn)化使根據(jù)本發(fā)明得到的木糖轉(zhuǎn)化成木糖醇，其中任選地將木糖還原酶和任選地將用于輔因子再生的協(xié)同底物和任選地將醇脫氫酶以及任選地將NAD(P)H加入木糖溶液；特別地得到的木糖醇通過過濾從木質(zhì)素分解產(chǎn)物中分離。借助于以下實施例1和對比例1A，記錄了在醇的存在下預(yù)處理對酶促水解后還原糖的產(chǎn)率的影響。實施例1 麥稈的預(yù)處理
將麥稈粉碎成約2 cm的粒度。在500 mL反應(yīng)容器中使5 g粉碎的麥稈懸浮在200 mL 由49. 5%水、50%乙醇和0. 5%過氧化氫組成的溶液中。將懸浮液在水浴中加熱至50°C，恒溫并且用NaOH水溶液將懸浮液的pH值調(diào)節(jié)至12的初始pH值。將混合物在200 rpm, 60 °C 下連續(xù)磁性攪拌M小時。隨即濾出固體成分并且用IL蒸餾水清洗。為了酶促水解，將每個平行實驗的100 mg預(yù)處理的底物用9. 8 mL 50 mM乙酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)至 pH 4. 8，并且與 200 μ L Accellerase 1000 懸浮液(www. genencor. com) 混合。Accellerase是纖維素酶和半纖維素酶的酶混合物。酶促水解在振蕩的水浴中在 50°C進(jìn)行。48小時后釋放的己糖和戊糖可溶單體根據(jù)DNS方法(Miller等，Analytical Chemistry 31(3) :426, 1959)在1 mL液體上清液中以還原糖的形式測得，其與稱入的、預(yù)處理的底物量相關(guān)并且以最大理論產(chǎn)率的百分比表示。還原糖的最大理論產(chǎn)率單獨(dú)測量并且為705 mg +/- 5%每g未處理的麥稈。每個試驗批次，進(jìn)行5次平行實驗。還原糖的產(chǎn)率為99% +/" 4%。
對比例IA
重復(fù)實施例1，但不加入醇。還原糖的產(chǎn)率僅為64% +/" 3%。實施例2 麥稈的預(yù)處理
將麥稈粉碎成約2 cm的粒度。在500 mL反應(yīng)容器中使2. 5 g粉碎的麥稈懸浮在200 mL由49. 5%水和50%異丙醇組成的溶液中。將懸浮液在水浴中加熱至50°C，恒溫并且用 NaOH水溶液將懸浮液的pH值調(diào)節(jié)至13 (或14)的初始pH值。將混合物在200 rpm, 60°C 連續(xù)磁性攪拌M小時。隨即濾出固體成分并且用IL蒸餾水清洗。為了酶促水解，將每個平行實驗的100 mg預(yù)處理的底物用9. 8 mL 50 mM乙酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)至 pH 4. 8，并且與 200 μ L Accellerase 1000 懸浮液(www. genencor. com)混合。Accellerase是纖維素酶和半纖維素酶的酶混合物。酶促水解在振蕩的水浴中在50°C 進(jìn)行。48小時后釋放的己糖和戊糖可溶單體根據(jù)DNS方法在1 mL液體上清液中以還原糖的形式測得，其與稱入的、預(yù)處理的底物量相關(guān)并且以最大理論產(chǎn)率的百分比表示。還原糖的最大理論產(chǎn)率單獨(dú)測量并且為705 mg +/- 5%每g未處理的麥稈。每個試驗批次，進(jìn)行5次平行實驗。還原糖的產(chǎn)率為97% +/" 4%。實施例3
由根據(jù)實施例2所述方法由麥稈制備的木糖溶液酶促制備木糖醇。使用異丙醇作為協(xié)同底物。反應(yīng)溶液包含5 mg/mL木糖。得自Candida tenuis的木糖還原酶(XR)使木糖還原成木糖醇。所述)(R需要NADH (還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)作為輔酶，其在反應(yīng)期間氧化成輔酶NAD+。氧化的輔因子再生通過醇脫氫酶的平行活性進(jìn)行(ADH:酶偶聯(lián)的再生)。使用異丙醇作為協(xié)同底物。如反應(yīng)圖式1所示，異丙醇和NAD+通過ADH反應(yīng)成NADH和丙酮
反應(yīng)圖式權(quán)利要求
1.制備碳水化合物分解產(chǎn)物，特別是糖的方法，特征在于以下措施的組合-用包含醇，特別是Ci_4-醇或酚，并且具有11. 0 - 14. 0的PH-值的水溶液處理木質(zhì)纖維素材料以使木質(zhì)纖維素分解，并且使分解產(chǎn)物從該材料中分離，其中獲得富含纖維素和半纖維素的材料，和-用至少一種分解碳水化合物的酶處理得到的富含纖維素和半纖維素的材料，以得到碳水化合物分解產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，特征在于所述水溶液具有11.0-13.0的pH-值。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項的方法，特征在于所述分解在低于100°C的溫度進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，特征在于所述分解在低于40°C的溫度進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1一 4任一項的方法，特征在于使用秸稈、蔗渣、能源草和/或谷殼作為木質(zhì)纖維素材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求1一 5任一項的方法，特征在于所述木質(zhì)纖維素材料以5-40重量％的物質(zhì)密度存在于所述水溶液中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1一 6任一項的方法，特征在于用木聚糖酶和/或纖維素酶處理富含纖維素和半纖維素的材料以獲得糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求1一 7任一項的方法，特征在于使得到的糖發(fā)酵成醇，分離和獲得所述
9.根據(jù)權(quán)利要求1一 8任一項的方法，特征在于用木聚糖酶轉(zhuǎn)化制漿的固體并且將得到的液相轉(zhuǎn)化成木糖醇，并且使剩余的固體-進(jìn)一步與纖維素酶反應(yīng)以得到不同的發(fā)酵產(chǎn)物； 或-進(jìn)行熱或熱化學(xué)轉(zhuǎn)化； 或-通過細(xì)菌、酵母或真菌進(jìn)行微生物物質(zhì)轉(zhuǎn)化； 或-為了得到纖維素纖維材料，進(jìn)行進(jìn)一步去木質(zhì)化步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，特征在于用木聚糖酶轉(zhuǎn)化制漿的固體并且使用木糖脫氫酶將得到的液相轉(zhuǎn)化成木糖醇，并且使剩余的固體-進(jìn)一步與纖維素酶反應(yīng)以得到不同的發(fā)酵產(chǎn)物； 或-進(jìn)行熱或熱化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化； 或-通過細(xì)菌、酵母或真菌進(jìn)行微生物物質(zhì)轉(zhuǎn)化； 或-為了得到纖維素纖維材料，進(jìn)行進(jìn)一步去木質(zhì)化步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10任一項的方法，特征在于使(發(fā)酵)產(chǎn)物分離后留下的固體在沼氣設(shè)備中發(fā)酵并且進(jìn)一步加工成沼氣。
全文摘要
一種制備碳水化合物分解產(chǎn)物的方法，特征在于以下措施的組合用包含醇，特別是C1-4-醇或酚，并且具有11.0－14.0的pH-值的水溶液處理木質(zhì)纖維素材料以使木質(zhì)纖維素分解，并且使分解產(chǎn)物從材料中分離，由此獲得富含纖維素和半纖維素的材料，和用至少一種分解碳水化合物的酶處理得到的富含纖維素和半纖維素的材料以得到碳水化合物分解產(chǎn)物。
文檔編號C12P7/18GK102575268SQ201080034813
公開日2012年7月11日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月6日
發(fā)明者C.克隆格泰夫, K.梅斯納, K.法克勒, O.埃爾特爾 申請人:安尼基有限責(zé)任公司