專利名稱：一種固定化谷氨酸脫羧酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化谷氨酸脫羧酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
γ -氨基丁酸，是一種非組成蛋白質(zhì)的氨基酸，是哺乳動(dòng)物、甲殼類動(dòng)物、昆蟲和某 些寄生蠕蟲神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，一些植物中也含有這種氨基酸。在人腦中， Y-氨基丁酸是通過腦內(nèi)谷氨酸脫羧酶轉(zhuǎn)化谷氨酸生成的。生物體內(nèi)Y-氨基丁酸可以參 與鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗驚厥、降血壓等生理活動(dòng)，具有多種生物學(xué)功能。γ -氨基丁酸的制備，一般分為化學(xué)合成、植物富集提取和生物合成三大類。其中 化學(xué)合成Y-氨基丁酸的方法很多，但成本較高，反應(yīng)條件不易控制，安全性較差。植物富 集提取方法生產(chǎn)Y-氨基丁酸是以植物為原料，經(jīng)過富集、提取、分離、提純制得，雖然比化 學(xué)方法易操作，但由于植物Y-氨基丁酸含量較低，成本仍然較高。生物合成方法操作復(fù) 雜，成本較高。而固定化酶具有方法簡(jiǎn)單，可反復(fù)利用，反應(yīng)體系和產(chǎn)物分離簡(jiǎn)單，條件要求 溫和，易于實(shí)現(xiàn)，生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)，因此在實(shí)際生產(chǎn)中，與生物合成、化學(xué)合成和植物富集 提取相比具有很大的優(yōu)勢(shì)。目前發(fā)現(xiàn)，具有谷氨酸脫羧酶活性的微生物菌種主要有大腸桿菌，乳酸菌以及曲 霉菌等。大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶活性最高，但是其存在安全衛(wèi)生方面的隱患。乳酸菌是 一類普遍認(rèn)為安全的細(xì)菌，廣泛用于食品加工中。乳酸菌具有多種生理功能，如調(diào)節(jié)腸道菌 群，增強(qiáng)免疫力，抑菌抗氧化，降低血壓等。目前，對(duì)于谷氨酸脫羧酶的固定化方法及固定化谷氨酸脫羧酶的研究，有少量文 獻(xiàn)報(bào)道，但或固定化材料和方法復(fù)雜，或谷氨酸脫羧酶與載體結(jié)合不牢固，或以市售谷氨酸 脫羧酶丙酮粉為酶源，固定化后活力低，結(jié)果都很不理想。本發(fā)明提供的方法很好的克服了 上述缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種固定化谷氨酸脫羧酶及其制備方法。本發(fā)明所提供的固定化谷氨酸脫羧酶是按照包括下述步驟的方法制備得到的1)制備谷氨酸脫羧酶粗酶液向乳酸菌中加入醋酸-醋酸鹽緩沖液，配制成每毫 升含菌數(shù)為300-500cfU的菌懸液，將所述菌懸液在冰水浴條件下超聲破碎，得到谷氨酸脫 羧酶的粗酶液；該粗酶液可以放在4°C的冰箱中待用；其中，所述醋酸-醋酸鹽緩沖液的濃 度為 0. 1-0. 4mol/L, pH 值為 4. 0-5. 0 ；2)預(yù)處理棉絨布載體依次用氫氧化鈉、吡啶、對(duì)甲苯磺酰氯對(duì)棉絨布進(jìn)行預(yù)處 理，得到預(yù)處理的棉絨布載體；3)將預(yù)處理的棉絨布載體置于步驟1)得到的谷氨酸脫羧酶粗酶液中浸泡 30_50min ；4)向步驟3)的體系中加入戊二醛，使其終濃度達(dá)到0. 2-lmol/L，繼續(xù)浸泡l_2h，即得到固定化谷氨酸脫羧酶。其中，步驟1)中所述乳酸菌可為乳酸菌NBRC 12005。步驟1)中所述超聲破碎的條件可為超聲功率200-400W，工作時(shí)間4_8s，間歇時(shí) 間7-1 ls，超聲工作次數(shù)10-40次。步驟2~)中對(duì)棉絨布載體進(jìn)行預(yù)處理的具體方法如下a)先用濃度為0. 2-lmol/L的氫氧化鈉溶液在20_50°C下對(duì)棉絨布處理1- ，將處 理后的棉絨布吸干水分后，40-80°C烘干；b)將經(jīng)a)處理后的棉絨布用5-20mL/gfl;_布的干吡啶在20_50°C下處理l_5h ；c)向b)的體系中加入0. 2-1. 2g/mL干《的對(duì)甲苯磺酰氯，在20_50°C下繼續(xù)處理 l-5h ；處理完后晾干，得到預(yù)處理的棉絨布載體。所述棉絨布為常規(guī)布料，可從商業(yè)途徑中獲得。所述a)處理中，處理完后的棉絨布可以在40-70°C的烘箱中烘干待用。步驟幻中制得的固定化谷氨酸脫羧酶可以放在4°C的冰箱中待用。將本發(fā)明所制備的固定化谷氨酸脫羧酶加入到IOOmL含谷氨酸鈉的醋酸-醋 酸鹽緩沖液(pH 5.0,0. 2mol/L)中，于37°C lOOr/min搖床反應(yīng)Ih后，取反應(yīng)液測(cè)定酶活； 取出IGAD (固定化谷氨酸脫羧酶)，用去離子水反復(fù)浸泡沖洗3次，再將其加入到IOOmL含
谷氨酸鈉的醋酸-醋酸鹽緩沖液(pH 5.0,0. 2mol/L)中，于37°C lOOr/min搖床反應(yīng)Ih 后，取反應(yīng)液測(cè)定酶活；如此反復(fù)操作10次。連續(xù)進(jìn)行10次催化反應(yīng)后，酶活回收率仍可 達(dá)75%以上。本發(fā)明中谷氨酸脫羧酶的固定化方法的優(yōu)點(diǎn)1、根據(jù)選擇不同形狀的載體，固定化谷氨酸脫羧酶形態(tài)可多樣，可以以碎片狀、桶 狀、膜狀、條狀等形態(tài)出現(xiàn)，適用于更廣泛形態(tài)的反應(yīng)器，更易于二氧化碳的傳遞和排放。2、固定化谷氨酸脫羧酶的負(fù)載量大。預(yù)處理后的載體與酶液接觸后已有大量的谷 氨酸脫羧酶共價(jià)連接到棉纖維上，在經(jīng)戊二醛處理后，有更多的谷氨酸脫羧酶共價(jià)連接到 已附著的谷氨酸脫羧酶上，在棉絨布表面形成枝狀排列。3、催化反應(yīng)壽命長(zhǎng)。本發(fā)明提供的固定化方法中，棉絨布經(jīng)過預(yù)處理后，谷氨酸脫 羧酶與棉纖維以共價(jià)鍵連接，同時(shí)谷氨酸脫羧酶之間再通過戊二醛連接起來，進(jìn)一步增加 了固定化谷氨酸脫羧酶的穩(wěn)定性。4、本發(fā)明提供的谷氨酸脫羧酶的固定化方法簡(jiǎn)單，條件要求溫和，易于實(shí)現(xiàn)，所得 到的固定化谷氨酸脫羧酶具有活力高、負(fù)載量大、催化反應(yīng)壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材 料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例1、制備固定化谷氨酸脫羧酶1)制備谷氨酸脫羧酶粗酶液。向乳酸菌NBRC 12005濕菌體中加入20mL/g髓體的 醋酸-醋酸鹽緩沖液(0.2mol/L，pH 4. 6)，將離心管內(nèi)菌體懸浮(菌懸液含菌數(shù)350cfu/ ml)，并在冰水浴條件下超聲破碎，超聲波處理?xiàng)l件為超聲功率300W，工作時(shí)間6s，間歇時(shí)間9s，超聲工作次數(shù)30次。超聲結(jié)束后，即獲得谷氨酸脫羧酶的粗酶液?；妙A(yù)處理棉絨布載體a)用IOmL濃度為0. 5mol/L的氫氧化鈉溶液在30°C下處理3cmX3cm的棉絨布 池，將處理的棉絨布用吸水紙吸干水分后，在50°C烘干。b)用lOmL/g^^^的干吡啶在25°C下處理步驟1得到的棉絨布濁。c)向b)的體系中加入0. 5g/mLT_的對(duì)甲苯磺酰氯，在25°C下繼續(xù)處理2h ；處理 后的棉絨布在通風(fēng)櫥中自然晾干，得到預(yù)處理的棉絨布載體。3)將預(yù)處理的棉絨布載體放在步驟1)得到的谷氨酸脫羧酶粗酶液中浸泡30min。4)向步驟3)的體系中加入戊二醛，使其終濃度達(dá)到0. 3mol/L，繼續(xù)浸泡池即可， 即得到固定化谷氨酸脫羧酶。將固定化谷氨酸脫羧酶加入到IOOmL含質(zhì)量濃度谷氨酸鈉的醋酸_醋酸鹽緩 沖液(pH 5.0,0. 2mol/L)中，于37°C lOOr/min搖床反應(yīng)Ih后，取反應(yīng)液測(cè)定酶活；取出 IGAD，用去離子水反復(fù)浸泡沖洗3次，再將其加入到IOOmL含谷氨酸鈉的醋酸-醋酸鹽 緩沖液(pH 5.0,0. 2mol/L)中，于37°C lOOr/min搖床反應(yīng)Ih后，取反應(yīng)液測(cè)定酶活；如此 反復(fù)操作10次。測(cè)定酶活及計(jì)算酶活回收率的方法如下以Berthelot顯色法測(cè)定反應(yīng)液中的 GABA。以等量游離短乳桿菌在相同條件下的酶活力為100%，計(jì)算固定化細(xì)胞酶活回收率。 比酶活定義為37°C、pH = 5. O時(shí)，Ig濕菌體轉(zhuǎn)化Ih所產(chǎn)生的GABA物質(zhì)的量，單位為U，即 IU = 1. Oymol/(g · h)。10 次測(cè)定酶活回收率依次分別為 84. 79%,83. 12%,82. 77%,82. 48%,80. 01%, 79. 19%, 79. 21%, 76. 94%, 76. 89%, 76. 67%。實(shí)施例2、制備固定化谷氨酸脫羧酶1)制備谷氨酸脫羧酶粗酶液。向乳酸菌NBRC 12005濕菌體中加入20mL/g,_體的 醋酸-醋酸鹽緩沖液(0.4mol/L，pH 5. 0)，將離心管內(nèi)菌體懸浮(菌懸液含菌數(shù)400cfu/ ml)，并在冰水浴條件下超聲破碎，超聲波處理?xiàng)l件為超聲功率200W，工作時(shí)間8s，間歇時(shí) 間7s，超聲工作次數(shù)30次。超聲結(jié)束后，即獲得谷氨酸脫羧酶的粗酶液。2)預(yù)處理棉絨布載體a)用IOmL濃度為0. 8mol/L的氫氧化鈉溶液在40°C下處理3cmX3cm的棉絨布 4h，將處理的棉絨布用吸水紙吸干水分后，在60°C烘干。b)用的干吡啶在40°C下處理步驟1得到的棉絨布4h。c)向b)的體系中加入0. 8g/mLT_的對(duì)甲苯磺酰氯，在35°C下繼續(xù)處理2h ；處理 后的棉絨布在通風(fēng)櫥中自然晾干，得到預(yù)處理的棉絨布載體。3)將預(yù)處理的棉絨布載體放在步驟1)得到的谷氨酸脫羧酶粗酶液中浸泡50min。4)向步驟3)的體系中加入戊二醛，使其終濃度達(dá)到0.6mol/L，繼續(xù)浸泡Ih即可， 即得到固定化谷氨酸脫羧酶。將固定化谷氨酸脫羧酶加入到IOOmL含谷氨酸鈉的醋酸-醋酸鹽緩沖液 (pH5.0,0. 2mol/L)中，于37°C lOOr/min搖床反應(yīng)Ih后，取反應(yīng)液測(cè)定酶活；取出IGAD，用 去離子水反復(fù)浸泡沖洗3次，再將其加入到IOOmL含谷氨酸鈉的醋酸-醋酸鹽緩沖液 (pH 5. 0,0. 2mol/L)中，于37°C lOOr/min搖床反應(yīng)Ih后，取反應(yīng)液測(cè)定酶活；如此反復(fù)操
5作10次。酶活測(cè)定方法及酶活回收率計(jì)算的方法同實(shí)施例1。10 次測(cè)定酶活回收率依次分別為 86. 90%,86. 44%,86. 73%,86. 48%,84. 97%, 84. 88%,84. 74%,82. 99%,80. 10%,79. 33%。實(shí)施例3、制備固定化谷氨酸脫羧酶1)制備谷氨酸脫羧酶粗酶液。向短乳桿菌濕菌體中加入20mL/gs·的醋酸-醋 酸鹽緩沖液(0. lmol/L,pH 4. 0)，將離心管內(nèi)菌體懸浮(菌懸液含菌數(shù)500cfu/ml)，并在冰 水浴條件下超聲破碎，超聲波處理?xiàng)l件為超聲功率400W，工作時(shí)間6s，間歇時(shí)間11s，超聲 工作次數(shù)30次。超聲結(jié)束后，即獲得谷氨酸脫羧酶的粗酶液。2)預(yù)處理棉絨布載體a)用IOmL濃度為0. 2mol/L的氫氧化鈉溶液在5°C下處理3cmX 3cm的棉絨布5h， 將處理的棉絨布用吸水紙吸干水分后，在60°C烘干。b)用的干吡啶在20°C下處理步驟1得到的棉絨布濁。c)向b)的體系中加入1. 0g/mLT_的對(duì)甲苯磺酰氯，在40°C下繼續(xù)處理Ih ；處理 后的棉絨布在通風(fēng)櫥中自然晾干，得到預(yù)處理的棉絨布載體。3)將預(yù)處理的棉絨布載體放在步驟1)得到的谷氨酸脫羧酶粗酶液中浸泡40min。4)向步驟3)的體系中加入戊二醛，使其終濃度達(dá)到lmol/L，繼續(xù)浸泡Ih即可，即 得到固定化谷氨酸脫羧酶。將固定化谷氨酸脫羧酶加入到IOOmL含谷氨酸鈉的醋酸-醋酸鹽緩沖液 (pH5.0,0. 2mol/L)中，于37°C lOOr/min搖床反應(yīng)Ih后，取反應(yīng)液測(cè)定酶活；取出IGAD，用 去離子水反復(fù)浸泡沖洗3次，再將其加入到IOOmL含谷氨酸鈉的醋酸-醋酸鹽緩沖液 (pH 5. 0,0. 2mol/L)中，于37°C 100r/min搖床反應(yīng)Ih后，取反應(yīng)液測(cè)定酶活；如此反復(fù)操 作10次。酶活測(cè)定方法及酶活回收率計(jì)算的方法同實(shí)施例1。10 次測(cè)定酶活回收率依次分別為 86. 71%,86. 69%,86. 50%,86. 44%,85. 87%, 84. 81%,84. 73%,82. 99%,80. 05%,79. 44%。
權(quán)利要求
1.一種谷氨酸脫羧酶的固定化方法，包括下述步驟1)制備谷氨酸脫羧酶粗酶液向乳酸菌中加入醋酸-醋酸鹽緩沖液，配制成每毫升含 菌數(shù)為300-500cfU的菌懸液，將所述菌懸液在冰水浴條件下超聲破碎，得到谷氨酸脫羧酶 的粗酶液；其中，所述醋酸-醋酸鹽緩沖液的濃度為0. 1-0. 4mol/L, pH值為4. 0-5. 0 ；2)預(yù)處理棉絨布載體依次用氫氧化鈉、吡啶、對(duì)甲苯磺酰氯對(duì)棉絨布進(jìn)行預(yù)處理，得 到預(yù)處理的棉絨布載體；3)將預(yù)處理的棉絨布載體置于步驟1)得到的谷氨酸脫羧酶粗酶液中浸泡30-50min；4)向步驟3)的體系中加入戊二醛，使其終濃度達(dá)到0.2-lmol/L，繼續(xù)浸泡1-池，即得 到固定化谷氨酸脫羧酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟幻中對(duì)棉絨布載體進(jìn)行預(yù)處理的具 體方法如下a)先用濃度為0.2-lmol/L的氫氧化鈉溶液在20-50°C下對(duì)棉絨布處理1- ，將處理后 的棉絨布吸干水分后，烘干；b)將經(jīng)a)處理后的棉絨布用干吡啶在20-50°C下處理1- ；所述干吡啶的用量為每 克干棉絨布使用5-20mL ；c)向b)的體系中加入對(duì)甲苯磺酰氯，在20-50°C下繼續(xù)處理1- ;處理完后晾干，得 到預(yù)處理的棉絨布載體；所述對(duì)甲苯磺酰氯的用量為每克毫升干吡啶加入0. 2-1. 2g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟1)中所述乳酸菌是乳酸菌NBRC 12005。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于步驟1)中所述超聲破碎的條件 為超聲功率200-400W，工作時(shí)間4-8s，間歇時(shí)間7_lls，超聲工作次數(shù)10-40次。
5.權(quán)利要求1-4中任一所述方法制備得到的固定化谷氨酸脫羧酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固定化谷氨酸脫羧酶及其制備方法。該固定化谷氨酸脫羧酶是按照包括下述步驟的方法制備得到的1)向乳酸菌中加入醋酸-醋酸鹽緩沖液，配制成每毫升含菌數(shù)為300-500cfu的菌懸液，將所述菌懸液在冰水浴條件下超聲破碎，得到谷氨酸脫羧酶的粗酶液；2)使用棉絨布為載體，依次用氫氧化鈉、吡啶、對(duì)甲苯磺酰氯進(jìn)行預(yù)處理；3)將預(yù)處理的棉絨布置于谷氨酸脫羧酶粗酶液中浸泡，然后向溶液中加入戊二醛，實(shí)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶的固定化。本發(fā)明提供的谷氨酸脫羧酶的固定化方法簡(jiǎn)單，條件要求溫和，易于實(shí)現(xiàn)，所得到的固定化谷氨酸脫羧酶具有活力高、負(fù)載量大、催化反應(yīng)壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N11/04GK102120995SQ20101058002
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月2日
發(fā)明者劉萍, 孫君社, 張京聲, 張秀清, 范杰 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)