專利名稱：一種產(chǎn)s-芳樟醇的基因工程菌及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)S-芳樟醇的酵母工程菌及其構建方法，尤其是一種分子手段 改造萜類生產(chǎn)(MVA)途徑并異源引入S-芳樟醇合成酶，從而調(diào)控代謝流實現(xiàn)S-芳樟醇過 量積累的方法，屬于遺傳工程領域。
背景技術：
芳樟醇(linalool)，又名沉香醇、芫荽醇，學名3，7-二甲基-1，6辛二烯-3_醇。 芳樟醇屬鏈狀萜烯醇類，有α-和β-兩種異構體，還有左旋(S)、右旋(乃兩種光異構體。 在不同的來源中，多為異構體的混合物。消旋體存在于香紫蘇油、茉莉油中，或是化學合成 的芳樟醇中；左旋體S-芳樟醇存在于芳樟油、黃樟油、香檸檬油、薰衣草油、玫瑰木油等精 油中。芳樟醇是重要的香料，用于花香型香精、香水、香皂和芳香工業(yè)等，是香水香精、家 化產(chǎn)品香精及皂用香精配方中使用頻率最高的香料品種。芳樟醇也是重要的化工原料，如 用作維生素E和異植醇的合成前體。目前以松節(jié)油合成S-芳樟醇是最主要的生產(chǎn)方式，但 存在很多問題，如合成線路長、副產(chǎn)物多且無法控制、有害中間產(chǎn)物殘留等，嚴重影響了其 使用的安全性。利用發(fā)酵法生產(chǎn)S-芳樟醇和其它單萜類化合物及其衍生物是一種可行的 技術思路。萜類化合物的生物合成均來源于共同的前體——異戊二烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate, IPP)。在釀酒酵母中，IPP是由乙酰輔酶A經(jīng)過甲羥戊酸(MVA)途徑生成 的。IPP可以進一步生成香葉基焦磷酸(Geranyl pyrophosphate, GPP)和法尼基焦磷酸 (Farnesyl pyrophosphate,FPP)等異戊二烯二磷酸同系物，在特定的萜類合成酶和修飾酶 作用下，最終形成種類繁多的萜類化合物。代謝工程改造釀酒酵母生產(chǎn)芳樟醇國內(nèi)未見有相關報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種產(chǎn)芳樟醇的基因工程菌通過改造甲羥 戊酸(MVA)途徑引入來源于JciiwWia arguta的芳樟醇合成酶，達到異源高效生產(chǎn)芳 樟醇的目的。所述酵母工程菌含有S-芳樟醇合成酶基因。所述芳樟醇合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述芳樟醇合成酶基因克隆于ras304。本發(fā)明要解決的另一個技術問題是提供一種產(chǎn)芳樟醇的基因工程菌基因工程 菌的構建方法。為解決上述技術問題，本發(fā)明的具體方案為 IMtKgenebank ID: GQ338153合成芳樟醇合成酶基因；
2)將芳樟醇合成酶基因與載體連接得到重組表達載體；
3)將重組表達載體轉化釀酒酵母i^dcclmromycescerevisiae)后得到基因工程菌。
下面是本發(fā)明技術方案的具體描述 質粒及基因工程菌的構建
根據(jù)NCBI公布的S-芳樟醇合成酶序列，經(jīng)密碼子優(yōu)化后，進行全基因合成；將人工 合成的S-芳樟醇合成酶基因克隆到整合質粒ras304 (購自德而寶生物技術有限公司，貨 號YV8002)構建整合表達載體；將構建好的表達質粒轉化釀酒酵母CEN. PK2-1C (MATa-araJ-52; trpl~2m\ leu2~3, 112; his,3d 1; MUSc] SUC2)。PCR (F1:5'GGACTAGTATTA TTCATGGCCAGCTTCAACAGG3‘；
Rl: 5，CGGAATTCTATTACAGCATCTTTCGATACATC3，)，驗證陽性轉化子(含有 1. 9kbp 條帶)。工程菌CEN. PK2 Iinalool的種子培養(yǎng)及發(fā)酵
種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20 g，1.7 g YNB和5 g硫酸銨g，亮氨酸0. 2g，組氨酸0. 2g， 尿嘧啶0. 2g，pH5. 6。在制作斜面和平板時加入20瓊脂，115 ° C滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20 g，1. 7 g YNB和5 g硫酸銨g，亮氨酸0. 4g，組氨酸 0.4 g，尿嘧啶0. 4g，pH5. 6。在制作斜面和平板時加入20瓊脂，115 ° C滅菌20 min。培養(yǎng)條件從斜面中接種酵母工程菌于20 mL的種子培養(yǎng)基中，放置于30° C轉 速為200 rpm的搖床上，培養(yǎng)20-24 h至對數(shù)中期，以10%的轉接量轉接入發(fā)酵培養(yǎng)基中， 發(fā)酵培養(yǎng)40-46 h。芳樟醇含量測定氣象色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS) 樣品處理頂空微固相萃取
儀器裝置VARIAN 1200LGC/MS-MS氣相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用儀； 儀器分析條件
氣相色譜柱VF17，30 m,0. 32 mmXO. 25 μπι ；
進樣口溫度250° C;不分流進樣；
載氣Ae (氦氣)，載氣流速1. 3 mL/min ；恒流方式；
色譜分離條件程序升溫40° C維持3min;5° C /min升溫至120° C (第一階段)； 10° C /min 升溫至 250° C (第二階段)；250° C 維持 5 min; 采集方式全掃描，掃描范圍33— 450 Amu ；
電離方式電子轟擊(EI)；燈絲發(fā)射電流50 μ A ；檢測器電壓1000V; 離子源溫度200° C，接口溫度250° C。本發(fā)明通過代謝工程改造，將來源于軟棗獼猴桃UciiwWia arguta)的芳樟 醇合成酶異源表達于釀酒酵母CfeccAarofflj^^s cerevisiae)中，增加萜類合成途徑——甲 羥戊酸(MVA)途徑碳代謝流，獲得了一株高產(chǎn)·5-芳樟醇的酵母工程菌CEN. H(2 Limonene0 與出發(fā)菌株CEN. PK2-1C相比，改造后酵母工程菌能夠代謝生產(chǎn)芳樟醇，且芳樟醇反 饋抑制明顯降低，芳樟醇的產(chǎn)量可達12 mg/L，具有很好的應用前景。本發(fā)明提供的構建 方法簡單，適于標準化。
具體實施例方式實例1表達載體的構建
根據(jù)NCBI公布的S-芳樟醇合成酶序列，經(jīng)密碼子優(yōu)化后，進行全基因合成；將人工合成的S-芳樟醇合成酶基因到整合質粒raS304構建整合表達載體。轉化大腸桿菌Dffia后， 挑選轉化子，提取質粒并經(jīng)及SpeI酶切后，出現(xiàn)1. 9 kb條帶，證明已經(jīng)構建成功整 合表達載體。實施例2基因工程菌的構建
將構建好的表達質粒轉化釀酒酵母CEN. H(2-1C iMATa- ura3~52 ； trplH leu2~ >, 112; hisJ) 1; MAL2-80.,，所述菌株購買于德國 EUR0SCARF 菌種保藏中心。
由于重組質粒上帶有trpl基因，轉化釀酒酵母CEN. H(2-1C感受態(tài)，涂布到含有組氨酸、亮 氨酸、尿嘧啶的YNB (葡萄糖20 g/L, YNB 6.7 g /L，固體培養(yǎng)基加20 g/L瓊脂，調(diào)節(jié)pH 5.6,115° C滅菌20 min)，挑取轉化后平板上正常生長的轉化子，提取基因組PCR驗證，出 現(xiàn)1. 9kb條帶，對照未能PCR同樣條帶，證明成功整合到基因組上。實例3發(fā)酵生產(chǎn)芳樟醇
從斜面中接種酵母工程菌于20 mL的種子培養(yǎng)基中，放置于30° C轉速為200 rpm的 搖床上，培養(yǎng)20-24 h至對數(shù)中期，以10%的轉接量轉接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)40-48 h，搖瓶發(fā)酵30° C，ZOOrpnu-芳樟醇產(chǎn)量為5 mg/L。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20 g，1. 7 g YNB和5 g硫酸銨，亮氨酸0. 2 g，組氨酸 0.2 g，尿嘧啶0.2 g，pH 5.6。在制作斜面和平板時加入20 g瓊脂，115 ° C滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20 g，1.7 g YNB和5 g硫酸銨，亮氨酸0.4 g，組氨酸 0.4 g，尿嘧啶0.4 g，pH5.6。在制作斜面和平板時加入20 g瓊脂，115 ° C滅菌20 min。實施例4發(fā)酵生產(chǎn)芳樟醇
發(fā)酵參數(shù)轉速400 rpm, pH4. 5，通氣量1. 5 vvm。3 L罐上發(fā)酵添加碳酸鈣后流加碳源，流加量為2. 5 g/L. h^-芳樟醇產(chǎn)量達到12 mg/L ο雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。序列表 <110>江南大學
<120> 一種產(chǎn)S-芳樟醇的基因工程菌及其構建方法 <160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1931
<212> DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>根據(jù)基因序列設計，用于基因擴增。 <400> 1
attattcatg gccagcttca acaggttttg tgtctcttct cttcttgctc caaacaacag 60cccacaaattagcaatgctccccgctccaccgctgtaccctctatgcctaCCSLCCCSLSLSLSL120atggagcatcaccgaagacctagcattcatttctaatccctcgaaacaacclCclclC Celt Ccl180aaccggatatcgcattttctctgatgagttttacctaaagcacgaaaacaaattgaagga240cgttaggagagcgttaagggaagtggaggaaaccccattagaaggtctggtcatgatcga300caccctccaacggctaggcattgactaccacttccagggggagattggagccctactaca360gaaacaacagagaatatctacttgtgattatcccgagcatgatctttttgaggtctctac420tcgctttcggctgttaaggcaagaaggtcacaatgtgcctgcagatgtgtttaacaactt480cagagacaaggagggaaggttcaaatcagaactaagcagagacatcagggggttgatgag540tttgtatgaagcttcacagttaagcatacaaggagaagacatacttgatcaagccgcaga600ttttagttcccaactccttagcgggtgggcgacaaatctcgatcatcatcaagctaggct660tgtgcgtaatgcactgacacatccctatcacaagagcctagcgacattcatggcaagaaa720cttcaattatgattgcaagggccaaaatggatgggtcaataacttgcaagaactagcaaa780aatggacttaactatggttcagtccatgcatcaaaaagaagtccttcaagtttcccaatg840gtggaaaggcaggggtttggccaatgaattgaagcttgtgagaaatcagccacttaaatg900gtacatgtggccaatggcagccctcacagatccaagattctcagaggaaagagttgaact960C 3. C 3.3.3.3. C C 3.atctcttttatctatatcatagatgacatttttgatgtttatgggacatt1020agaagaactcactctcttcacagatgctgtcaatagatgggaacttactgctgttgagca1080actacccgactacatgaagatttgctttaaggctctttatgacatcacaaatgaaatcgc1140ctacaagatctacaaaaagcatggacggaaccccatagattctctgcggagaacgtgggc1200aagtttgtgcaacgcgttcttagaagaagcaaaatggtttgcttctgggaacttgccaaa1260ggcagaagagtacttgaagaatgggatcatcagttcagggatgcatgtggttacggttca1320catgttctttctcttgggcggttgtttcaccgaagaaagtgtcaatcttgtggatgaaca1380tgcgggaattacatcttctatagcaacaatccttcgtctttcggatgacttgggaagtgc1440caaggatgaggatcaagatggctacgatggatcctatttagaatgctatctgaaggacca1500caagggctcttcggtagagaatgcaagagaagaagttattcgcatgatttcagatgcatg1560gaagcgcctcaacgaggaatgcctatttccgaatccattttcagcaactttcaggaaggg1620ttctcttaatatcgcaaggatggttcctttgatgtacagctatgatgacaatcataacct1680cccaatccttgaggagcacatgaagacaatgctctatgatagttcttcttgataaggatt1740C 3. C 3.3.3.3. C 3. aagtactgaagtcggactgaaacttattttcaaagtacatgttactgccc1800atttaatattcacacactagcagtttatgaaagaacggcgagtaagtgtg1860tgcttgcaaggggtattaatgtgggtatatgaaactcggaggagactgatgtatcgaaag1920atgctgtaata1931
<210>2
<211>33
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>根據(jù)基因序列設計，用于基因擴增。
權利要求
1.一種產(chǎn)S-芳樟醇的基因工程菌，其特征在于含有外源芳樟醇合成酶基因。
2.權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述芳樟醇合成酶基因核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
3.權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述芳樟醇合成酶基因克隆于 PRS304質粒中。
4.權利要求1所述基因工程菌的構建方法，其特征在于包括如下步驟 優(yōu)化genebank ID: GQ338153合成芳樟醇合成酶基因；將S-芳樟醇合成酶基因與載體連接得到重組表達載體；將得到的重組表達載體轉化釀酒酵母CfeccAarofflj^e1S cerevisiae CEN. PK2-1C)后得 到基因工程菌。
5.權利要求1所述基因工程菌應用于芳樟醇生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)s-芳樟醇酵母工程菌及其構建方法，屬于遺傳工程領域。本發(fā)明通過代謝工程改造，將來源于軟棗獼猴桃(Actinidiaarguta)的芳樟醇合成酶異源表達于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C)中，增加萜類合成途徑——甲羥戊酸(MVA)途徑碳代謝流，獲得了一株高產(chǎn)s-芳樟醇的酵母工程菌CEN.PK2linalool。與出發(fā)菌株CEN.PK2-1C相比，改造后的酵母工程菌CEN.PK2 linalool能夠代謝生產(chǎn)s-芳樟醇，且s-芳樟醇反饋抑制明顯降低，s-芳樟醇的產(chǎn)量可達12mg/L，具有很好的應用前景。
文檔編號C12R1/865GK102071155SQ201010579969
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權日2010年12月9日
發(fā)明者劉繼棟, 周景文, 堵國成, 孫明雪, 陳堅 申請人:江南大學