專利名稱：一種抗寄生蟲(chóng)的化合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學(xué)，具體說(shuō)就是一種抗寄生蟲(chóng)的化合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
放線菌是自然界分布最廣泛的微生物類群之一，而鏈霉菌(Sti^ptomyces)是放線菌中最大的一個(gè)類群，也是抗生素的重要產(chǎn)生菌。目前，包括出現(xiàn)在專利中的種已經(jīng)超過(guò) 3000個(gè)，至1996年有效描述的種有464個(gè)和亞種45個(gè)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素占 抗生素的70%左右。占放線菌產(chǎn)生抗生素的90%以上。而目前我國(guó)發(fā)現(xiàn)的農(nóng)用抗生素，無(wú) 論是大面積應(yīng)用還是局部地區(qū)商品化產(chǎn)品，或是有較大應(yīng)用潛力的農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌均為 鏈霉菌° 尼莫克汀(Nemadectin)(圖一)由藍(lán)灰鏈霉菌 Streptomyces cyaneogriseussp. noncyanogenus發(fā)酵產(chǎn)生，是十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物，屬于米爾貝霉素族(Milbemycin)抗 生素。以尼莫克汀為基礎(chǔ)半化學(xué)合成的莫西克汀(Moxidectin)(圖二)在C-23位引入= N-OCH3基團(tuán)，親脂性更強(qiáng)。莫西克汀同伊維菌素(Ivermectin)的作用機(jī)制基本相似，但比 伊維菌素具有更高的活性。莫西克汀可用于抗多種體內(nèi)外寄生蟲(chóng)，其中內(nèi)寄生蟲(chóng)主要是線 蟲(chóng)，外寄生蟲(chóng)有螨、蜱和蚤類。它抗寄生蟲(chóng)的特點(diǎn)是作用強(qiáng)烈，用藥量少，并且對(duì)人安全、無(wú) 毒害、不污染環(huán)境，只殺害蟲(chóng)，不殺害蟲(chóng)天敵，也不易產(chǎn)生抗藥性，可以作為防治該類藥物產(chǎn) 生抗性的復(fù)配及輪換用藥，是目前最有前途的廣譜、高效、新型、抗蟲(chóng)、無(wú)交叉感染的生物殺 蟲(chóng)劑，被譽(yù)為當(dāng)今活性最高的殺蟲(chóng)劑之一，是目前最有前途的抗蟲(chóng)抗生素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高活性、藥效持久的抗寄生蟲(chóng)的化合物及其制備方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的所述的抗寄生蟲(chóng)的化合物，分子式為=C36H5tlO7 ；結(jié)構(gòu)式為 所述的抗寄生蟲(chóng)的化合物的制備方法，步驟如下步驟一培養(yǎng)基的制備平板及斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成(g/L)葡萄糖10，麥芽 糖 3，酵母抽提粉 3，K2HPO4 · 3Η20 0. 5，MgSO4 · 7Η200· 5，NaCl 0. 5，KNO3 1，微量元素溶液 5，pH 7. O 7. 2，使用去離子水配制，微量元素溶液(g/L) =MgSO4 · 7H20 80，CaCO3 10，F(xiàn)eCl3 6，ZnSO4 2, MnSO4 2，CuSO4 0· 5，CoCl2 0. 4，用去離子水定容，置于28°C的培養(yǎng)箱中，相對(duì)濕 度40 60%，培養(yǎng)9d;步驟二 種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖5，麥芽糊精20，可溶性淀粉 1，酵母膏10，牛肉膏1，酪蛋白胨1，pH 7. 0 7. 2，使用自來(lái)水配制；將成熟斜面上的孢子 用滅菌后的接種鏟挖塊接種于種子培養(yǎng)搖瓶中(挖塊大小約1X0. 5cm)，種子搖瓶裝液量 25ml/250ml，于28°C，250rpm旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)48h ；
步驟三搖瓶發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖10，乳糖25，棉籽餅粉25，CaCO3 3 ；pH 7. 0 7. 2，使用自來(lái)水配制；將種子液按8%的移種量接入發(fā)酵搖瓶中，發(fā)酵搖瓶裝 液量為25ml/250ml三角燒瓶，于28°C，250rpm旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)9d ；步驟四分離和提純化合物發(fā)酵液經(jīng)100 200目篩網(wǎng)過(guò)濾后，濾渣用甲醇提 取，提取液濃縮至一定體積后用EtOAc萃取，將萃取夜?jié)饪s后依次進(jìn)行硅膠柱層析，RP-18 柱層析所得到的化合物，得到無(wú)色的粉末狀化合物。步驟五硅膠層析其所用到的填料是200-300目的硅膠，流動(dòng)相為石油醚乙酸 乙酯=9 1-5 5 (V/V)兩種洗脫液混合進(jìn)行梯度洗脫。其中RP-18柱層析使用混合溶 齊U，甲醇與水=80 20-95 5(V/V)的溶液進(jìn)行梯度洗脫的。本發(fā)明抗寄生蟲(chóng)的化合物及其制備方法，所述的化合物為具有抗動(dòng)物體內(nèi)外寄生 蟲(chóng)及其蟲(chóng)卵活性的新化合物1，以200 μ g/kg的計(jì)量下能夠有效驅(qū)殺豬體內(nèi)線蟲(chóng)和體外血 虱。對(duì)抑制線蟲(chóng)感染長(zhǎng)達(dá)42d，對(duì)蟲(chóng)卵再出現(xiàn)抑制長(zhǎng)達(dá)85d。與莫西菌素相比，相同實(shí)驗(yàn)環(huán)境 和劑量下，即以200 μ g/kg,莫西菌素對(duì)抑制豬體內(nèi)線蟲(chóng)感染為35d，對(duì)蟲(chóng)卵再出現(xiàn)為80d。 因此得出結(jié)論，本發(fā)明所得到的新化合物有比目前市售的抗寄生蟲(chóng)類藥物莫西菌素有更強(qiáng) 的抗多種寄生蟲(chóng)的活性。


圖1為本發(fā)明的尼莫克汀(Nemadectin)結(jié)構(gòu)式；圖2為本發(fā)明的尼莫克汀(Moxidectin)結(jié)構(gòu)式；圖3為本發(fā)明的鏈霉菌neau3在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；圖4為本發(fā)明的鏈霉菌neau3在熒光倒置相差顯微鏡(400X)下的菌絲形態(tài)；圖5為本發(fā)明的鏈霉菌neau3在掃描電鏡(5000 X)下的菌絲形態(tài)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖舉例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1 菌株發(fā)酵本發(fā)明涉及的一種鏈霉菌屬菌株，為從湖北省來(lái)鳳縣的一個(gè) 土樣中分離得到的。2009年10月10日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心”，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。保藏登記號(hào)為CGMCC No. 3316，命名為鏈霉菌neau3(Str印tomyces sp. neau3)的菌株。該菌株不但能夠產(chǎn)生尼 莫克汀，還能產(chǎn)生新化合物1。該菌株的16S rDNA序列為GCCCCGGAGTTCCGTCGTTATAGTGCAGTCGACGATGAAGCCTTTCGGGGTGGATTAGT
GGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACTCTGTCCCGCATGGGACGGGGTTAAAAGCTCCGGC GGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAAAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATGCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATGGACGAAGTCGTAGCAGAGTGATCTACGGCC該序列在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院全國(guó)生物技術(shù)研究中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank 等記號(hào)為DQ924968. 1，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化工研究室提供。平板及斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成(g/L)葡萄糖10，麥芽糖3，酵母抽提粉3， K2HPO4 · 3H20 0. 5，MgSO4 · 7H20 0. 5，NaCl 0. 5，KNO3I,微量元素溶液 5，pH 7. 0 7. 2，使用 去離子水配制。微量元素溶液(g/L)=MgSO4 · 7H20 80，CaCO3 10，F(xiàn)eCl3 6，ZnS042, MnSO4 2，CuSO4 0.5，CoCl2 0.4，用去離子水定容。置于28°C的培養(yǎng)箱中，相對(duì)濕度40 60%，培養(yǎng)9d。種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖5，麥芽糊精20，可溶性淀粉1，酵母膏 10，牛肉膏1，酪蛋白胨1，PH 7.0 7. 2，使用自來(lái)水配制。將成熟斜面上的孢子用滅菌后的接種鏟挖塊接種于種子培養(yǎng)搖瓶中(挖塊大小 約1X0. 5cm)，種子搖瓶裝液量25ml/250ml，于28°C，250rpm旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)48h。搖瓶發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖10，乳糖25，棉籽餅粉25，CaCO3 3 ；pH 7.0 7. 2，使用自來(lái)水配制。將種子液按8%的移種量接入發(fā)酵搖瓶中，發(fā)酵搖瓶裝液量為25ml/250ml三角燒 瓶，于28°C，250rpm旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)9d。
實(shí)施例2 化合物的分離30L發(fā)酵液經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，并且用水清洗慮餅，發(fā)酵 液和清洗用的水全都棄掉，用10L甲醇浸提過(guò)濾后得到的濾渣，通過(guò)減壓蒸餾的方法最后 將甲醇溶液濃縮到大約2L，再將濃縮液用相同體積的EtOAc浸提3次，將得到的EtOAc相減 壓蒸餾會(huì)產(chǎn)生30g油狀物質(zhì)。將所得油狀物上硅膠柱(粒徑200 300目)進(jìn)行層析，分 別用石油醚乙酸乙酯=9 1-5 5(V/V)兩種洗脫液混合進(jìn)行梯度洗脫，得到了三個(gè)組 分，將組分三上RP-18硅膠柱進(jìn)行層析，用甲醇水=80 20-95 5 (V/V) 二種洗脫液混 合進(jìn)行梯度洗脫，會(huì)得到化合物l(30mg)。其中得到化合物1的結(jié)構(gòu)式為 化合物1的物理化學(xué)性質(zhì)如下性狀(Appearance)白色粉末；溶解性(Solubility)易溶于氯仿、丙酮、甲醇；比旋度(Specific rotation) [ a ]D25+45. 1 (c 0. 10，EtOH)；分子式(Molecular formula) :C36H5(l07 ；ESIMS m/z :593[M-Hr，High-resolution ESIMS :617. 3447[M+Na] + (calcd for C36H5007Na,617. 3449)；UV absorption spectrum 入 max (EtOH) nm (log e ) 270 (4. 16)，296 (4. 03)；IR absorption spectrum :Vmax cnT1 3447，2961，2927，1705，1613，1457，1383， 1282，1162,997 ；NMR(CDC13,400MHz) S 7. 82 (1H，s，H_3)，6. 97 (1H，s，H_6)，6. 51 (1H，d，J = 11. 2， H-9)，6. 24 (1H, dd, J = 11. 2，14. 9，H-10)，5. 90 (1H, dd, J = 7. 0，14. 9，H-ll)，2. 54 (1H, m, H-12)，1. 98 (1H, m H_13a)，2. 17 (1H, m, H_13b)，5. 13 (1H, m, H-15)，2. 28 (2H, m, H-16)， 3. 71 (1H, m, H-17)，1. 23 (1H, m, H_18a)，2. 05 (1H, m, H_18b)，4. 17 (1H, m, H_19)，1. 38 (1H, br t, J = 11. 8，H-20a)，2. 05 (1H，m，H_20b)，1. 73 (1H，m，H_22a)，1. 98 (1H，m，H_22b)，3. 80 (1H, m, H-23)，1. 63 (1H, m, H-24)，3. 69 (1H, d, J = 10. 9，H-25)，2. 24 (3H, s, H-26)，5. 80 (2H, br s, H-27)，1. 08 (3H, d，J = 6. 6，H_28)，1. 63 (3H, br s, H_29)，0. 79 (3H, d, H_30)，5. 13 (1H, d，J = 7. 9，H-32)，2. 54 (1H, m, H_33)，1. 58 (3H, d，J = 0. 8，H_34)，0. 93 (3H, d，J = 6. 6， H-35)，0. 98(3H，d，J = 6. 6，H-36) ； 13C 匪R(CDC13，100MHz) 8 165. 6(s,C-l), 114. 9(s,C-2),133. 3(d, C-3)，126.1 (s, C-4)，160. 3 (s, C_5)，107.5 (d, C_6)，138.3 (s, C_7)，124. 0 (s, C-8)，127. 7(d, C-9)，122. 1 (d, C_10)，146. 3(d, C_11)，34. 4 (d，C—12)，47. 8 (t，C_13)， 136. 1 (s, C-14)，121.7 (d，C-15)，34. 1 (t, C-16)，69. 1 (d, C_17)，40. 0 (t, C_18)，64.6 (d, C-19)，44.1 (t, C-20)，99.8 (s, C-21)，41.0 (t，C-22)，69. 5(d, C_23)，35. 9 (d, C_24)， 76. 7(d, C-25)，15.6 (q, C—26)，66. 6 (t, C—27)，19. 7 (q, C—28)，16.3 (q, C—29)，13.9 (q, C-30)，130. 7(s，C-31), 137. 4(d, C-32)，26. 8 (d，C-33)，11. 0 (q，C-34)，22. 8 (q，C-35)， 22. 8 (q, c-36).新化合物1在結(jié)構(gòu)上與尼莫克汀(圖1)最主要的不同是，化合物1對(duì)應(yīng)尼莫克汀 的酯鍵已斷裂，分子呈鏈狀。實(shí)施例3 結(jié)合圖4、圖5，出發(fā)菌株的形態(tài)鑒定(1)在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，菌落顏色為灰白色，菌落形態(tài)實(shí)心圓形，見(jiàn)圖3。(2)孢子絲直、柔曲，孢子橢圓形，圓球形或柱形，表面光滑，熒光倒置相差顯微鏡 和掃描電鏡照片分別見(jiàn)圖4、圖5。實(shí)施例4 抗蟲(chóng)活性測(cè)定對(duì)豬體內(nèi)外寄生蟲(chóng)及其蟲(chóng)卵的觸殺作用將100頭斷奶仔豬分為四組，分別進(jìn)行如下處理。第一組為高劑量組，皮下注射 劑量為400 u g/kg ；第二組為中劑量組，皮下注射劑量為300 u g/kg ；第三組為低劑量組 200 yg/kg;第四組為對(duì)照組，不做任何處理。依試驗(yàn)前后豬體內(nèi)外寄生蟲(chóng)(卵)罹患數(shù)量 進(jìn)行比較來(lái)確定新化合物對(duì)驅(qū)殺豬體內(nèi)線蟲(chóng)和體外血虱的效果。依據(jù)豬再感染寄生蟲(chóng)的時(shí) 間，確定藥物在豬體內(nèi)的殘效期。新化合物1，以200 y g/kg的計(jì)量下能夠有效驅(qū)殺豬體內(nèi)線蟲(chóng)和體外血虱。對(duì)抑制 線蟲(chóng)感染長(zhǎng)達(dá)42d，對(duì)蟲(chóng)卵再出現(xiàn)抑制長(zhǎng)達(dá)85d。
權(quán)利要求
一種抗寄生蟲(chóng)的化合物，其特征在于分子式為C36H50O7；結(jié)構(gòu)式為F2009100731241C00011.tif
2. 一種抗寄生蟲(chóng)的化合物的制備方法，其特征在于步驟如下 步驟一培養(yǎng)基的制備平板及斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成(g/L)葡萄糖10，麥芽糖3， 酵母抽提粉 3，K2HP04 3H20 0. 5，MgS04 7H200. 5，NaCl 0. 5，KN03 1，微量元素溶液 5，pH 7. 0 7. 2，使用去離子水配制，微量元素溶液(g/L) :MgS04 7H20 80，CaC03 10，F(xiàn)eCl3 6， ZnS04 2，MnS04 2，CuS04 0. 5，CoCl2 0. 4，用去離子水定容，置于28°C的培養(yǎng)箱中，相對(duì)濕度 40 60%，培養(yǎng)9d ；步驟二 種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖5，麥芽糊精20，可溶性淀粉1，酵 母膏10，牛肉膏1，酪蛋白胨1，pH 7. 0 7. 2，使用自來(lái)水配制；將成熟斜面上的孢子用 滅菌后的接種鏟挖塊接種于種子培養(yǎng)搖瓶中(挖塊大小約1X0. 5cm)，種子搖瓶裝液量 25ml/250ml，于28°C，250rpm旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)48h ；步驟三搖瓶發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖10，乳糖25，棉籽餅粉25，CaC03 3 ； pH 7.0 7. 2，使用自來(lái)水配制；將種子液按8%的移種量接入發(fā)酵搖瓶中，發(fā)酵搖瓶裝液 量為25ml/250ml三角燒瓶，于28°C，250rpm旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)9d ；步驟四分離和提純化合物發(fā)酵液經(jīng)100 200目篩網(wǎng)過(guò)濾后，濾渣用甲醇提取，提 取液濃縮至一定體積后用EtOAc萃取，將萃取夜?jié)饪s后依次進(jìn)行硅膠柱層析，RP-18柱層析 所得到的化合物，得到無(wú)色的粉末狀化合物。步驟五硅膠層析其所用到的填料是200-300目的硅膠，流動(dòng)相為石油醚乙酸乙酯 =9:1-5: 5 (V/V)兩種洗脫液混合進(jìn)行梯度洗脫。其中RP-18柱層析使用混合溶劑，甲 醇與水=80 20-95 5(V/V)的溶液進(jìn)行梯度洗脫的。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種高活性、藥效持久的抗寄生蟲(chóng)的化合物及其制備方法。所述的抗寄生蟲(chóng)的化合物，分子式為C36H50O7；所述的抗寄生蟲(chóng)的化合物的制備方法包括培養(yǎng)基的制備、平板及斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵、分離和提純化合物、硅膠層析。所述的化合物為具有抗動(dòng)物體內(nèi)外寄生蟲(chóng)及其蟲(chóng)卵活性的新化合物1，與莫西菌素相比，相同實(shí)驗(yàn)環(huán)境和劑量下，即以200μg/kg，莫西菌素對(duì)抑制豬體內(nèi)線蟲(chóng)感染為35天，對(duì)蟲(chóng)卵再出現(xiàn)為80天。本發(fā)明所得到的新化合物比目前市售的抗寄生蟲(chóng)類藥物莫西菌素有更強(qiáng)的抗多種寄生蟲(chóng)的活性。
文檔編號(hào)C12R1/465GK101875679SQ20091007312
公開(kāi)日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2009年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月2日
發(fā)明者向文勝, 姜玲, 王明, 王相晶, 高愛(ài)麗 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)