專利名稱：：一種鏈霉菌屬菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物科學(xué)，具體說就是一種鏈霉菌屬菌株。(二)
背景技術(shù)：
：放線菌是自然界分布最廣泛的微生物類群之一，而鏈霉菌(Str印tanyces)是放線菌中最大的一個(gè)類群，也是抗生素的重要產(chǎn)生菌。目前，包括出現(xiàn)在專利中的種已經(jīng)超過3000個(gè)，至1996年有效描述的種有464個(gè)和亞種45個(gè)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素占抗生素的70%左右，占放線菌產(chǎn)生抗生素的90%以上。目前，國內(nèi)外應(yīng)用廣泛的大環(huán)內(nèi)酯類農(nóng)用抗生素多拉菌素屬雙糖類化合物，是以環(huán)己氨羧酸(cyclohexanecarboxylic)為前體，通過基因重組的阿維鏈霉菌(str印tomycesavermitilis)新菌株發(fā)酵而成的一種阿維菌素類抗生素，最早發(fā)現(xiàn)多拉菌素驅(qū)殺寄生蟲的能力是在驅(qū)鼠繼代的蛇形毛圓線蟲和殺兔癢螨的動(dòng)物模型中(參見Goudie，AC.等人，VeterinaryParasitology.49(1993)5-15)。多拉菌素為內(nèi)外兼殺劑，對線蟲、節(jié)肢動(dòng)物均有良好的驅(qū)殺效果，與市售的伊維菌素類產(chǎn)品比較，其抗寄生蟲范圍更廣泛、血藥濃度高峰維持時(shí)間更長、半衰期也相對較長。而且多拉菌素在動(dòng)物體內(nèi)持效時(shí)間更長，是目前最具有開發(fā)潛力的獸用抗寄生蟲藥物之一。(三)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種既能產(chǎn)生多拉菌素，又能產(chǎn)生兩種新大環(huán)內(nèi)酯類化合物的鏈霉菌屬菌株。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的所述的鏈霉菌屬菌株的16SrDNA序列為ACGAAGTCGTAACAAG。本發(fā)明的鏈霉菌屬菌株除能產(chǎn)生多拉菌素，還能產(chǎn)生兩種新大環(huán)內(nèi)酯類化合物。且新大環(huán)內(nèi)酯類化合物具有強(qiáng)的抗寄生蟲及其蟲卵的活性，可用以控制動(dòng)物體內(nèi)外寄生蟲及其蟲卵生存，對我國獸用抗寄生蟲藥物開發(fā)研究具有重要的意義。(四)圖1為本發(fā)明油鏡下觀察的菌絲形態(tài)；圖2為本發(fā)明菌株的孢子；圖3為本發(fā)明DNA提取結(jié)果；圖4為本發(fā)明16SrDNA的PCR電泳結(jié)果。(五)具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1:本發(fā)明一種鏈霉菌屬菌株，所述的鏈霉菌屬菌株，是于2009年03月11日保藏于"中國生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心"，保藏登記號(hào)為CGMCCNO.2943，命名為NEAU1069(Str印tomycesavermitilis)的菌株。所述的鏈霉菌屬菌株的16SrDNA序列為ACGAAGTCGTAACAAG。該鏈霉菌16srDNA序列是這樣得到的(1).鏈霉菌基因組DNA的獲取在無菌條件下從培養(yǎng)好的菌落中挑取少量菌株菌落，加入lmL洗滌液(50mmol*L—1Tris，pH7.7;25mmo1L—1EDTA)，12000rpm離心5min，沉淀加入200iiL丙酮溶液，混勻，冰浴5min，12000rpm離心2min，棄上清，沉淀加入500iiLTE溶液(lOmmolL—1Tris-HCl，pH8.0;10,1*L—1EDTA)，混勻，12000rpm離心5min。將沉淀重新懸于400iiL裂解液(2%SDS;20mmo1L—、aAC;40mmo1L—4ris;10mmo1L—'EDTA)，反復(fù)吹打混勻，冰浴5min，然后75。C溫浴10min。加入100iiL5mol*L—1的NaCl，14000rpm離心10min，上清液加入300iiL的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，顛倒混勻，12000rpm離心5min，上清液加入2倍體積的無水乙醇，14000rpm離心5min，DNA沉淀溶于500iiL70%的乙醇，12000rpm離心2min，將沉淀在無菌超凈臺(tái)干燥30min，再溶于50iiLTE中，_20°〇保存?zhèn)溆谩?2).16srDNA的PCR擴(kuò)增采用鏈霉菌通用引物上游5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';下游5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。擴(kuò)增體系(20iiL):上游引物1iiL(25pmo1)下游引物:lyL(25pmo1)鏈霉菌基因組DNAliiLd證1iiL(25mM)1iiL0.3iiL1iiL14.71iiL(25pmo1)3min;10承ExT叫BufferExT叫DMSO水反應(yīng)條件94°C:30cycle,72°C，lOmin;10°C，forever94°C，30s;-550C,45s;72°C，2min;—(3730)測序，獲得16srDNA序列。實(shí)施例2:本發(fā)明的鏈霉菌屬菌株用于多拉菌素及兩種新大環(huán)內(nèi)酯類化合物的制備。所述的兩種新大環(huán)內(nèi)酯類化合物的結(jié)構(gòu)式分別為(3).測序送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，利用ABI司DNA測序儀5當(dāng)X-Y...R為CH=C...H時(shí)為新化合物1的結(jié)構(gòu)；新化合物2的結(jié)構(gòu)特征是X-Y.R為CH2-CH..0H。本發(fā)明還涉及結(jié)構(gòu)表征如下化合物化合物1H化合物1的物理化學(xué)性質(zhì)如下性狀(A卯earance):白色粉末溶解性(Solubility):易溶于氯仿、丙酮、甲醇比旋度(Specificrotation):[a]D25+123.86(c0.088，Et0H);分子式(Molecularformula):C35H4606本發(fā)明還涉及結(jié)構(gòu)表征如下化合物化合物234HO、化合物2的物理化學(xué)性質(zhì)如下性狀(A卯earance):白色粉末溶解性(Solubility):易溶于氯仿、丙酮、甲醇比旋度(Specificrotation):[a]D25+66.35(c0.104，EtOH);分子式(Molecularformula):C35H4807本發(fā)明不僅篩選到一株新鏈霉菌，并從該菌株中得到多拉菌素及兩種新米爾貝霉素化合物，這對我國獸用抗寄生蟲藥物開發(fā)研究具有重要的意義。本發(fā)明的菌株屬于一株產(chǎn)多拉菌素及兩種新化合物的菌株，對其進(jìn)行了形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征、細(xì)胞壁化學(xué)成分及16SrDNA序列(DQ768097.1)等鑒定，并與其它菌株進(jìn)行比較，鑒定為一新種鏈霉菌(Str印tomyces)，命名為NEAU1069(Str印tomycesavermitilis)，此菌除能產(chǎn)生多拉菌素，還能產(chǎn)生兩種新化合物。且新化合物對損害植物的螨類、動(dòng)物體內(nèi)外的寄生蟲及豬體內(nèi)線蟲和體外血虱有很高的抑制活性。菌落在高氏培養(yǎng)基表面生長緊密，菌落顏色隨著時(shí)間的推移逐漸變深，即由白色最終變?yōu)榛疑?。在油鏡下觀察菌絲基絲分枝，無橫隔，不斷裂；氣絲分枝較多。透射電鏡觀察孢子孢子絲分支，末端鉤狀，孢子柱形至橢圓形，表面帶剌，如圖2。從這些形態(tài)特征看，該菌種可歸為阿維鏈霉菌。菌株的鑒定配制高氏合成一號(hào)、脫脂奶粉、營養(yǎng)瓊脂、葡萄糖天門冬素瓊脂、營養(yǎng)酪氨酸、淀粉胺瓊脂、燕麥粉瓊脂、馬鈴薯等八種培養(yǎng)基各100ml，滅菌后鋪平板，凝固后，用劃線法涂上待觀察的菌種孢子懸浮液。28t:下培養(yǎng)7、15和30d，記錄培養(yǎng)特征。菌種NEAU1069(Str印tomycesavermitilis)在八種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征如表1示。表1鏈霉菌在8種不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征比較7:三--一H培養(yǎng)基氣生菌絲體基內(nèi)菌絲體可溶性色素高氏合成一號(hào)灰白色灰褐色褐色脫脂奶粉深褐色無深褐營養(yǎng)黃褐色淺灰色淺褐色葡萄糖天門冬素黃褐色灰褐色淺黃褐色營養(yǎng)酪氨酸深褐色或黑色淺灰色深褐色淀粉銨土灰色灰褐色淺土灰色燕麥粉深褐色灰白色褐色馬鈴薯浸汁黃褐色褐色深褐色新化合物1、2的殺蟲活性新化合物具有強(qiáng)的殺螨活性，能殺滅，例如寄生在果樹、蔬菜和花上的四爪螨屬、全爪螨屬和銹螨屬的成螨和卵。它們對于寄生于動(dòng)物身上的硬蜱科、皮剌螨科和疥螨科也有活性。它們還能殺滅動(dòng)物體內(nèi)外寄生物，如對牛體內(nèi)的奧氏奧斯特線蟲、琴形奧斯特線蟲、柏氏血矛線蟲捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、似血矛線蟲、艾氏毛圓線蟲、蛇形毛圓線蟲、腫空古柏線蟲、點(diǎn)狀古柏線蟲櫛狀古柏線蟲、匙形古柏線蟲、菇拉巴德古柏線蟲、牛仰口線蟲、乳突類圓線蟲和輻射食道口線蟲等的成蟲及幼蟲均顯示驅(qū)蟲活性；對豬蛔蟲、齒食道口線蟲、長溝球首線蟲、豬毛首線蟲、蘭氏類圓線蟲、豬肺線蟲、豬腎蟲、鮑杰氏線蟲等具有很好的驅(qū)除效果。對綿羊消化道線蟲包括毛圓線蟲、夏伯特線蟲、奧斯特線蟲、馬歇爾線蟲、鈍剌細(xì)頸線蟲、毛首線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲驅(qū)凈率為95%。實(shí)施例3:1、化合物制備發(fā)酵(1)種子培養(yǎng)培養(yǎng)基(葡萄糖20g，大豆粉15g，酵母粉5.Og，蒸餾水1000mL，pH值7.0)，用250mL的三角瓶每瓶分裝25mL，然后用10mL無菌水將斜面的冰城鏈霉菌孢子洗下并制成孢子懸浮液，使其濃度為1X1071X108個(gè)/mL。每瓶加2mL孢子懸浮液，置于搖床上，轉(zhuǎn)速250r/min，28t:培養(yǎng)24h;(2)發(fā)酵采用液體搖瓶發(fā)酵，培養(yǎng)基(玉米粉10%，大豆粉1%，棉花籽粉1%，a_淀粉酶0.02%，NaCl0.1%，K2HP040.2%，MgS047H200.1%，CaC030.7%，環(huán)己烷羧酸鹽O.l%，pH7.O，加蒸餾水1000mL。于121。C下滅菌20min，分裝于lOOOmL三角瓶，每瓶100mL。接種量8%(V/V)，搖床轉(zhuǎn)速250r/min，28t:振蕩培養(yǎng)12-13d。2、化合物的分離30L發(fā)酵液經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，并且用水清洗慮餅，發(fā)酵液和清洗用的水全都棄掉，用10L甲醇浸提過濾后得到的濾渣，通過減壓蒸餾的方法最后將甲醇溶液濃縮到大約2L，再將濃縮液用相同體積的EtOAc浸提3次，將得到的EtOAc相減壓蒸餾會(huì)產(chǎn)生20g油狀物質(zhì)。將所得油狀物上硅膠柱(粒徑200300目)進(jìn)行層析，分別用石油醚乙酸乙酯=9:1-5:5兩種洗脫液混合進(jìn)行梯度洗脫，得到了五個(gè)組分，將組分二上RP-18硅膠柱進(jìn)行層析，用甲醇水=80:20-95:5二種洗脫液混合進(jìn)行梯度洗脫，會(huì)得到化合物8其中化合物2的結(jié)構(gòu)式為OH3、抗蟲活性測定對豬體內(nèi)外寄生蟲及其蟲卵的觸殺作用將100頭斷奶仔豬分為五組，分別進(jìn)行如下處理。第一組為高劑量組，皮下注射劑量為400i！g/kg;第二組為中劑量組，皮下注射劑量為300i！g/kg;第三組為低劑量組200iig/kg;第四組為對照組，不做任何處理。依試驗(yàn)前后豬體內(nèi)外寄蟲(卵)罹患數(shù)量進(jìn)行比較來確定新化合物對驅(qū)殺豬體內(nèi)線蟲和體外血虱的效果。依據(jù)豬再感染寄生蟲的時(shí)間，確定藥物在豬體內(nèi)的殘效期。新化合物l，和2在以300iig/kg的計(jì)量下能夠有效驅(qū)殺豬體內(nèi)線蟲和體外血虱。對抑制線蟲感染長達(dá)25d，對血虱抑制長達(dá)98d。序列表…llIn0…1l,o9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求一種鏈霉菌屬菌株，其特征在于鏈霉菌屬菌株的16SrDNA序列為TCTGGCTCAGGACTAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAATACTCTCGCAGGCATCTGTGAGGGTTAAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGATACAATGAGCTGCGATACCGCAAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGTCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTTGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAG。全文摘要本發(fā)明一種鏈霉菌屬菌株，所述的鏈霉菌屬菌株，是于2009年03月11日保藏于“中國生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏登記號(hào)為CGMCCNO.2943，命名為NEAU1069(Streptomycesavermitilis)的菌株。本發(fā)明的鏈霉菌屬菌株除能產(chǎn)生多拉菌素，還能產(chǎn)生兩種新大環(huán)內(nèi)酯類化合物。且新大環(huán)內(nèi)酯類化合物具有強(qiáng)的抗寄生蟲及其蟲卵的活性，可用以控制動(dòng)物體內(nèi)外寄生蟲及其蟲卵生存。對我國獸用抗寄生蟲藥物開發(fā)研究具有重要的意義。文檔編號(hào)C12N1/20GK101705194SQ20091007273公開日2010年5月12日申請日期2009年8月24日優(yōu)先權(quán)日2009年8月24日發(fā)明者向文勝,姜玲,王相晶申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)