專利名稱:抗寄生蟲藥劑的制備方法
本發(fā)明涉及一些抗寄生蟲藥劑，更詳細(xì)地說與avermectins和milbemycins有關(guān)但在25位上有一新取代基的化合物，以及它們的制備方法。
化合物avermectins是一組廣譜抗寄生蟲藥劑，以前稱做C-076化合物。它們是在含有無機鹽和可吸收的碳和氮的來源的含水營養(yǎng)介質(zhì)中，在有氧氣的條件下，使微生物Streptomyces aver-mitilis ATCC 31267，31271或31272的菌株發(fā)酵制得的。在英國第1573955號書中詳細(xì)敘述了菌種ATCC 31267，31271和31272的形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)方面的性質(zhì)，該專利還敘述了組成C-076復(fù)合物的八個個別組分的分離方法和化學(xué)結(jié)構(gòu)?；衔飉ilbemycins在結(jié)構(gòu)上與大環(huán)內(nèi)酯抗生素有關(guān)，但在13位上缺少糖基。它們可以通過發(fā)酵法制得。例如象英國專利第1390336號說明書和歐洲專利申請公開號0170006中所敘述的方法。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，若將某些特定的羧酸或其衍生物加入到能生成aver-mectin的一種生物體的發(fā)酵液中，可得到新的化合物，它與avermectins有關(guān)，但在25位上有一奇異的取代基，代替通常存在的異丙基或仲-丁基。這種新型化合物是有很高活性的抗寄生蟲藥劑，作為驅(qū)腸蟲藥(anthelmintics)，殺外寄生物劑，殺蟲劑和殺螨劑特別有用。
于是，根據(jù)本發(fā)明的一個方面的內(nèi)容，提出了生產(chǎn)在25位有奇異取代基的新型的avermectin衍生物的方法。包括將一種羧酸，或者它的鹽，酯或酰胺或者其氧化的前身，加入到一種能產(chǎn)生avermectin的生物體的發(fā)酵液中，以及分離出這種新型avermectin的衍生物。
通過通常的化學(xué)轉(zhuǎn)換反應(yīng)，可以從這些化合物制得進一步的衍生物。于是，本發(fā)明進一步的目標(biāo)就是提供具有式(Ⅰ)的化合物
其中第22-23位間的虛線表示一個選擇性的雙鍵，并且其中R1是H或OH而雙鍵不存在，或者，雙鍵存在而R1不存在;
R2是一個α分支的C3-C8烷基，鏈烯基，炔基，烷氧烷基或烷硫烷基;C5-C8環(huán)烷基烷基，其中的烷基是一個α分支的C2-C5烷基;C3-C8環(huán)烷基或C5-C8環(huán)烯基，二者都可任意被亞甲基或者一個或多個C1-C4烷基或鹵原子取代;或含氧或硫的3到6員雜環(huán)，它可以是飽和的，也可是全部或部分不飽和的，并且它可被一個或多個C1-C4烷基或鹵原子任意地取代;
R3是氫或甲基;
R4是H或具有下式的4′-(α-L-齊墩果糖基)-α-L-齊墩果糖氧基
但要滿足以下的條件，當(dāng)R2是烷基時，它不是異丙基或仲-丁基;當(dāng)R4是H，R1是H，且雙鍵不存在時，R2不是甲基或乙基;當(dāng)R4是H，R1是OH，且雙鍵不存在時，R2不是2-丁烯-2-基，2-戊烯-2-基或4-甲基-2-戊烯-2-基。
在上述規(guī)定中，含有3個或更多個碳原子的烷基可以是直鏈的或帶支鏈的。鹵表示氟，氯，溴或碘。α-分支表示連在25環(huán)位上的碳原子是連接著另外兩個碳原子的二級碳原子。當(dāng)R2是5個或更多個碳原子的烷基時，烷基鏈的其余部分可以是直鏈或帶支鏈的。
優(yōu)選的式(Ⅰ)的化合物是那些R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-α-L-齊墩果糖氧基的化合物。還有一些式(Ⅰ)的化合物也是優(yōu)選的，即其中R2是C5或C6環(huán)烷基或環(huán)烯基(環(huán)戊基是特別優(yōu)選的)，這些基團可以任意地被一個或多個C1-C4烷基取代。在另一組優(yōu)選的化合物中，R2是環(huán)丁基。還有一組優(yōu)選的化合物中，R2是一個五或六員的含氧或硫的雜環(huán)，特別是3-噻吩基，或3-呋喃基，這些環(huán)可以被一個或多個C1-C4烷基或鹵原子任意取代。還有一組優(yōu)選的化合物，其中R2是一個C3-C8的烷硫烷基，尤其是1-甲硫乙基。
按照本發(fā)明的方法，具有式(Ⅰ)的化合物(其中R1是OH而雙鍵不存在，或其中雙鍵存在而R1不存在，而且R4是4′-(α-L齊墩果糖基)-α-L-齊墩果糖氧基)可通過使一種能生成avermectin的生物體發(fā)酵制得，例如在具有R2COOH(其中R2前面已有規(guī)定)結(jié)構(gòu)的羧酸或者它的鹽，酯或酰胺，或其氧化的前體存在時，使生物體Strepto myces avermitilis ATCC 31267，31271或31272的菌株發(fā)酵可制得式(Ⅰ)化合物。酸可在接種時加入，也可在發(fā)酵期間隨時加入。用有機溶劑從發(fā)酵物中萃取樣品，再用色譜法例如高壓液相色譜鑒測具有式(Ⅰ)的化合物，控制式(Ⅰ)化合物的生產(chǎn)。培養(yǎng)過程延續(xù)到式(Ⅰ)化合物的產(chǎn)率達到最大，一般需要4到6天。
每次加入羧酸或其衍生物的量最好是在0.05-1.0克/升。在發(fā)酵物中逐步地加入(例如在幾天內(nèi)每天加入)酸或其衍生物，得到的式(Ⅰ)化合物的產(chǎn)率最好。最好加入酸的鹽，例如鈉鹽或銨鹽，但也可以加入酯，例如甲酯或乙酯，或者加入酰胺。在發(fā)酵中可以使用的其他基質(zhì)是一些羧酸的氧化前體衍生物;因此，合適的基質(zhì)例如是具有式R2CH(NH2)CO2H氨基酸，具有式R2COCO2H的乙醛酸，具有式R2CH2NH2的甲胺衍生物，具有式R2(CH2)nCO2H(其中n是2，4或6)的被取代的低級鏈烷酸，具有式R2CH2OH的甲醇衍生物，或具有式R2CHO的醛類，其中R2的意義前面已定義。發(fā)酵使用的介質(zhì)可以是通常的含有可吸收的碳，氮和其他痕量元素來源的復(fù)合介質(zhì)。但已發(fā)現(xiàn)，為了取得較好的結(jié)果，可以使用從Strep-tomyces avermitilis ATCC 31271衍生的生物體菌種，它在半確定的介質(zhì)中培養(yǎng)時，可以改進式(Ⅰ)化合物的產(chǎn)率，這還有一個優(yōu)點是在粗的溶劑萃取物中，所不期望有的物質(zhì)的含量明顯減少，這就大大簡化了以后的分離和純化步驟。這一菌株已于1985年7月19日存放在國家工業(yè)細(xì)菌收集(中心)(NCIB)，登記號是NCIB 12121。另一方面，這一菌株的形態(tài)學(xué)的和培養(yǎng)的特征與英國書1573955號對菌株ATCC 31267的敘述大體相同。
在24-33℃溫度下經(jīng)過幾天的發(fā)酵之后，將發(fā)酵物中的液體培養(yǎng)基離心分離或濾除，菌絲體的餅狀物用丙酮或甲醇萃取。將溶劑萃取液濃縮，再將所期望的產(chǎn)品萃取到一種與水不混溶的有機溶劑中，如二氯甲烷，乙酸乙酯，氯仿，丁醇或甲基異丁基酮。將溶劑萃取液濃縮，含有式(Ⅰ)化合物的粗產(chǎn)品需要時用色譜法進一步純化，例如用制備反相高壓液相色譜。
一般情況下，得到的產(chǎn)品是具有式(Ⅰ)的一些化合物的混合物，其中R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-α-L-齊墩果糖基，R1是OH而雙鍵不存在或R1不存在而雙鍵存在，R3是H或CH3;但是它們之間的比率可隨著所用個別羧酸及使用的條件而改變。
我們已發(fā)現(xiàn)，由R2CO2H限定的范圍廣的羧酸都可以加到發(fā)酵物中，以便產(chǎn)生在25位上具有新型取代基的avermectins。可以使用的羧酸可舉例如下2-甲基戊酸2-甲基戊-4-烯酸2-甲硫基丙酸2-環(huán)丙基丙酸環(huán)丁烷羧酸環(huán)戊烷羧酸環(huán)己烷羧酸環(huán)庚烷羧酸
2-甲基環(huán)丙烷羧酸2-環(huán)己烯-1-羧酸和噻吩-3-羧酸。
根據(jù)本發(fā)明的一個特別的和優(yōu)選的方面，在環(huán)戊烷羧酸鈉鹽存在下進行發(fā)酵，得到占優(yōu)勢的具有式(Ⅰ)的化合物，其中R1是OH，雙鍵不存在，R2是環(huán)戊基，R3是CH3，R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-α-4-齊墩果糖氧基。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的另一方面，在噻吩-3-羧酸鈉鹽存在下進行發(fā)酵，占優(yōu)勢的具有式(Ⅰ)的化合物中R1是OH，不存在雙鍵，R2是噻吩-3-基，R3是CH3，R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-α-4-齊墩果糖氧基。
根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的一面在2-甲硫基丙酸鈉鹽存在下進行發(fā)酵，占優(yōu)勢的具有式(Ⅰ)的化合物中R1是OH，不存在雙鍵，R2是1-甲硫乙基，R3是CH3，R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-α-4-齊墩果糖氧基。
具有雙鍵而R1不存在的具有式(Ⅰ)的化合物也可以通過脫水反應(yīng)由相應(yīng)的沒有雙鍵，其中R1是OH的式(Ⅰ)的化合物制得。進行這一反應(yīng)時，首先要選擇性地保護5位和4″位上的羥基，例如作為叔-丁基二甲基甲硅烷氧基乙?；苌?，然后再和被取代的鹵硫化硫(如(4-甲基苯氧基)氯硫化碳)反應(yīng)，接著在高沸點溶劑如三氯苯中加熱，促進脫水作用。產(chǎn)品最終經(jīng)過去保護反應(yīng)得到不飽和化合物。美國專利4328335號敘述了這一反應(yīng)的步驟和所用的試劑以及反應(yīng)條件。
具有式(Ⅰ)的化合物(其中R3是H)也可以由相應(yīng)的化合物(其中R3是CH3)通過去甲基化作用制得。完成這一反應(yīng)要用乙酸汞處理5-甲氧基化合物或其被適當(dāng)保護的衍生物，并將生成的3-乙酰氧基烯醇醚用烯酸水解，得到5-酮基化合物。該化合物然后再用例如硼氫化鈉還原，得到5-羥基衍生物。在這些步驟中使用的反應(yīng)試劑和反應(yīng)條件在美國專利號4423209中都有敘述。
式(Ⅰ)化合物(其中R1是H而無雙鍵)可以由相應(yīng)化合物(有雙鍵而無R1)用適當(dāng)?shù)拇呋瘎┙?jīng)過選擇性的催化氫化制得。例如，這一還原反應(yīng)可以根據(jù)歐洲專利申請公開號0001689的敘述，用三(三苯膦)氯化銠(Ⅰ)來完成。
具有式(Ⅰ)的化合物(其中R4是H)由相應(yīng)的化合物(R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-α-L-齊墩果糖氧基)制備，即在含水有機溶劑中，用一種酸，通過溫和的水解反應(yīng)消除4′-(α-L-齊墩果糖基)α-L-齊墩果糖基，生成在13位上具有羥基的糖苷配基;然后將其鹵化，例如和苯磺酰氯反應(yīng)，生成13-脫氧-13-鹵衍生物，該衍生物最后被選擇性地還原，例如用三丁基氫化錫還原。為了避免不期望的副反應(yīng)發(fā)生，希望將所有其他羥基保護起來，例如用叔-丁基二甲基甲硅烷基。這一保護基在鹵化或還原步驟完成以后可以很容易地用含有痕量酸的甲醇處理而除去。在歐洲專利申請公開號0002615中敘述了所有這些步驟以及所用試劑和各步反應(yīng)條件。
在產(chǎn)生milbemycin生物體的發(fā)酵過程中加入羧酸或其鹽，酯或酰胺，或其氧化前體，再將在25位上具有奇異取代基的預(yù)期的milbemycin衍生物分離出來，也可以制得式(Ⅰ)化合物(其中R4是H，R1是H或OH，無雙鍵)。能產(chǎn)生milbemycin的生物體的例子包括，英國專利1390336號說明書敘述的吸水鏈霉菌株NRRL 5739，歐洲專利申請公開號0170006敘述的蘭灰鏈霉菌(Streptomy ces cyaneogriseus subsp noncy-anogenus NRRL 15773)以及英國專利2166436A中敘述的Streptomyces thermoarchaenis NCIB 12015。
本發(fā)明的化合物是具有高活性的抗寄生蟲劑，作為驅(qū)腸蟲藥，抗外寄生物藥，殺蟲劑和殺螨劑特別有用。
因此，這些化合物治療由內(nèi)寄生物引起的各種疾病是有效的，特別是蠕蟲病，它最經(jīng)常是由稱為線蟲的一組寄生蟲引起的，它能對豬、羊、馬和牛引起嚴(yán)重經(jīng)濟損失，還影響家畜和家禽。該化合物在對付影響各種動物的其它線蟲方面也是有效的，例如，狗中的惡絲蟲屬和能夠傳染于人類的各種寄生蟲，包括胃腸寄生蟲，如鉤口線蟲屬，板口線蟲屬，蛔蟲屬，圓線蟲，毛細(xì)蟲類，毛細(xì)線蟲屬，鞭蟲屬，蟯蟲屬，以及在血液或其他組織和器官中發(fā)現(xiàn)的寄生蟲，如絲蟲類寄生蟲和腸外階段的圓線蟲和毛細(xì)蟲類。
該化合物在治療外寄生物傳染病也是有意義的，特別包括動物和鳥類的節(jié)肢動物型外寄生物，如蜱，螨類，虱子(Lice)，跳蚤類，麗蠅，叮咬害蟲和遷涉雙翅目幼蟲，它們都能影響到牛和馬。
該化合物也是一種殺蟲劑，用以對付室內(nèi)害蟲，如蟑螂，衣物蛀蟲，毛毯甲蟲，家蠅等，并且也用以對付貯存糧食中的害蟲和農(nóng)作物中的害蟲，如蜘蛛螨，蚜蟲，毛蟲，還用于對付遷涉的直翅類的昆蟲如蝗蟲。
按照設(shè)想的特殊用途以及被處理的宿主動物和涉及的害蟲或寄生蟲的特殊種類，式(Ⅰ)化合物可以配成制劑引入機體，作為驅(qū)腸蟲藥使用時，該化合物可以制成膠囊、丸劑、片劑或最好以液體灌服藥形式口服，也可通過注射或作為植入物引入體內(nèi)。這些制劑都是用通常的方式按照標(biāo)準(zhǔn)的獸醫(yī)慣例制備的。因此將活性組分和適當(dāng)?shù)募?xì)碎的稀釋劑或載體相混合，此外還含有分散劑和/或粘合劑，如淀粉，乳糖，滑石，硬脂酸鎂等，就可以制得膠囊、丸劑或片劑。將活性組分分散在水溶液，還有分散劑或潤濕劑等，便制得灌服藥制劑。注射用的制劑可以用無菌溶液，溶液中可以含有其他物質(zhì)，如足夠的鹽或葡萄糖，以使溶液和血液是等滲的。根據(jù)治療宿主動物的種類，感染的嚴(yán)重程度和類型以及宿主的體重，這些制劑中活性組分的重量可以改變。一般口服時，作為單次劑量或1-5天期間內(nèi)的分次劑量，大約0.001-10毫克/千克動物體重的用量是滿意的，但是，當(dāng)然有些例子中指出更高或更低的劑量范圍，這在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
還可將此化合物與動物飼料一起引入體內(nèi)，為此目的，可以制備一種濃縮的食物添加劑或預(yù)混合料，以便與通常的動物飼料混合。
當(dāng)用作殺蟲劑或用以消滅農(nóng)業(yè)害蟲時，該化合物可以按照標(biāo)準(zhǔn)的農(nóng)業(yè)操作制成噴霧劑，粉劑，乳劑和類似物。
下面通過例子對本發(fā)明進行說明，其中，例1-19說明式(Ⅰ)化合物的制備，例20說明灌服藥制劑，例21和22說明化合物的抗寄生蟲和殺害蟲的活性。
例125-環(huán)戊基-avermectin A2將鏈霉菌S.avermitilis NCIB 12121的漿狀培養(yǎng)基的懸浮液接種到600毫升的含有乳糖(12.0克)，酒糟(8.0克)和酵母抽提物(3.0克)的介質(zhì)中，盛于3升燒瓶中，在28℃培養(yǎng)3天。這種接種物用以接種16升的含有可溶淀粉(640克)，硫酸銨(32克)，磷酸氫二鉀(16克)，氯化鈉(16克)，七水硫酸鎂(16克)，碳酸鈣(32克)，可溶性酵母抽提物(6.4克)，七水硫酸亞鐵(0.016克)，七水硫酸鋅(0.016克)和四水氯化錳(0.016克)的介質(zhì)，盛于20升的發(fā)酵器中。發(fā)酵物在28℃下培養(yǎng)，用250轉(zhuǎn)/分的速度攪拌，并且以15升/分速率充氣。分別在培養(yǎng)過程進行到24、48和72小時后加入環(huán)戊烷羧酸的鈉鹽(1.6克)，發(fā)酵持續(xù)120小時，此后通過過濾分出菌絲體，并進行萃取，萃取溶劑為丙酮1當(dāng)量濃度稀鹽酸(100∶1;3×7升)。萃取液減壓濃縮到大約2升，再用二氯甲烷萃取(2×5升)。二氯甲烷萃取液濃縮至干得到粗產(chǎn)品，是一種流動性油，將該油溶于乙醚后加入到硅膠柱中(1千克硅膠)。用乙醚洗脫，收集100毫升的級分。將級分20-40合并，蒸去溶劑，得到部分純化的物質(zhì)。將產(chǎn)品溶于甲醇和水(4∶1)的混合液中，在Waters Prep 500型高壓液相色譜儀的C18 Micro-Bondapack柱(50毫米×50厘米)上用相同的溶劑進行分離，流速為100毫升/分。將含有預(yù)期產(chǎn)品的35-50級分合并在C18 Zorbax ODS(商標(biāo)，杜邦)柱上(21毫米×25厘米)用甲醇和水(4∶1)的混合液洗脫，流速為9毫升/分。將有關(guān)級分合并，蒸去溶劑，得到具有式(Ⅰ)的化合物，其中R1是OH，不存在雙鍵，R2是環(huán)戊基，R3是CH3，R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-α-L-齊墩果糖氧基，是一種白色粉末。熔點150.5-151℃。產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)由質(zhì)譜和C13核磁共振譜得到證實
在VG 7070E型質(zhì)譜計上進行快速原子轟擊質(zhì)譜測定，樣品基體為三甘醇和固體氯化鈉。在質(zhì)荷比939處觀察到(M+Na)+離子(理論值939)。
在VG 7070F型質(zhì)譜計上進行電子轟擊質(zhì)譜測定，主要碎片的質(zhì)荷比值為335，317，275，257，251，233，205，181，179，145，127，113，111，95和87。
在Brucker WM-250型核磁共振儀上測定了C13核磁共振譜數(shù)據(jù)，樣品濃度為20毫克/毫升，溶劑為氘代氯仿。相對于四甲基硅烷，用ppm表示的化學(xué)位移值是14.1，15.3，17.8，18.5，19.9，20.3，24.6，25.9，26.2，29.3，34.4(2C)，34.7，36.7，37.8，39.8，40.5，41.0，41.3，45.8，56.4，56.6，57.8，67.4;67.6，68.0，68.3，68.7，69.9，70.5，76.0，77.6(2C)，78.3，79.5，80.7(2C)，81.8，94.9，98.7，99.8，117.7，118.5，119.8，125.0，135.8，136.3，137.8，140.1和173.8。
例2將S.avermitilis ATCC 31271的漿狀培養(yǎng)基的懸浮液接種到含有乳糖(1.0克)，酒糟(0.75克)和酵母抽提物(0.25克)的50毫升的介質(zhì)中，盛于350毫升的燒瓶中，在28℃培養(yǎng)3天。這一接種物用以接種另一種介質(zhì)，這種介質(zhì)分盛于50個350毫升的燒瓶中，分別含有50毫升介質(zhì)，介質(zhì)中含有玉米淀粉(2.0克)，大豆面粉(0.35克)和酵母抽提物(0.25克)，每瓶接種4毫升，燒瓶在28℃培養(yǎng)。
24小時后，各瓶都加入環(huán)戊烷羧酸鈉鹽5毫克，再連續(xù)培養(yǎng)5天。此后，瓶中物料變成大塊，通過離心分出菌絲體。用丙酮∶1當(dāng)量鹽酸(100∶1)的混合液萃取菌絲體，丙酮萃取液濃縮至干。高壓液相色譜分析表明，萃取物中含有與例1產(chǎn)品相同的產(chǎn)品。
例3用按照例1敘述的方法制得的接種物接種到例1所用的介質(zhì)中，盛于350毫升燒瓶中，培養(yǎng)24小時后，加入2-氨基環(huán)戊基乙酸(環(huán)戊基甘氨酸)(5毫克)，再持續(xù)發(fā)酵5天。通過用丙酮和二氯甲烷萃取菌絲體來回收產(chǎn)品。萃取物經(jīng)高壓液相色譜分析表明，產(chǎn)品中含一種與例1產(chǎn)品相同的化合物。
例4除了用環(huán)戊基甲醇作基質(zhì)以外，遵照例3的條件，得到相似的結(jié)果。
例5除了用溶于甲醇的環(huán)戊烷羧酸甲基酯作基質(zhì)以外，遵照例3的條件，得到相似的結(jié)果。
例6除了用溶于甲醇的環(huán)戊烷甲酸作基質(zhì)外，遵照例3的條件，得到相似的結(jié)果。
例725-(噻吩-3-基)avermectin將S.avermitilis NCIB 12121的漿狀培養(yǎng)基的懸浮液接種到600毫升的含有乳糖(12.0克)，酒糟(8.0克)和酵母抽提物(3.0克)的介質(zhì)中，盛于3升的燒瓶中，在28℃培養(yǎng)3天。該接種物用以接種16升的含有可溶淀粉(640克)，硫酸銨(32克)，磷酸氫二鉀(16克)，氯化鈉(16克)，七水硫酸鎂(16克)，碳酸鈣(32克)，可溶酵母抽提物(6.4克)，七水硫酸亞鐵(0.016克)，七水硫酸鋅(0.016克)和四水氯化錳(0.016克)的介質(zhì)，盛于20升的發(fā)酵器中，發(fā)酵物在28℃培養(yǎng)，以250轉(zhuǎn)/分速度攪拌，并以15升/分速度充氣，在培養(yǎng)過程進行到24、48和72小時后，分別加入噻吩-3-羧酸鈉鹽(1.6克)，發(fā)酵持續(xù)120小時。此后，將菌絲體過濾出來，并用丙酮∶1當(dāng)量鹽酸(100∶1;3×7升)萃取，將萃取液減壓濃縮到大約2升并用二氯甲烷萃取(2×5升)。二氯甲烷萃取液濃縮至干，得到粗產(chǎn)品，是一種流動性的油，該油溶于乙醚，加到硅膠(1千克)柱中。用乙醚洗脫，收集200毫升級分。級分32-45合并，蒸去溶劑，得到部分純化的物質(zhì)。產(chǎn)品溶于甲醇和水(3∶1)的混合液中，在Watersprep 500型高壓液相色譜儀的C18 Micro-Bonda-pack柱上(50毫米×50厘米)進行色譜分離，使用同樣的溶劑洗脫，流速為100毫升/分。將含有預(yù)期產(chǎn)品的級分27-36合并，在C18 Zorbax ODS(商標(biāo)，杜邦)柱(21毫米×25厘米)上，用甲醇和水混合液(3∶1)，以9毫升/分速度洗脫，進行色譜分離。有關(guān)級分合并，溶劑蒸發(fā)至得到式(Ⅰ)化合物，其中R1是OH，雙鍵不存在，R2是噻吩-3-基，R3是CH3以及R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-α-L-齊墩果糖氧基，是一種白色粉末。熔點167℃。產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)由下面的質(zhì)譜數(shù)據(jù)證實在VG 7070E型質(zhì)譜計上用三甘醇和固體氯化鈉為樣品基體進行快原子轟擊質(zhì)譜測定。在質(zhì)荷比953處觀察到(M+Na)+峰(理論值953)。
在VG 7070F型質(zhì)譜計上還進行了電子轟擊質(zhì)譜測定，主要碎片的質(zhì)荷比值是349，331，275，265，257，247，237，219，195，145，127，113，95和87。
例8將保持在-60℃的10%(體積/體積)甘油水溶液(2毫升)中的S.avermitilis NCIB 12121的生長細(xì)胞懸浮液接種到50毫升介質(zhì)中，介質(zhì)中含有乳糖(1.0克)，酒糟(0.75克)和酵母抽提物(0.25克)，盛于300毫升錐形燒瓶中，在28℃培養(yǎng)24小時，不斷搖動。再將這一接種物加到600毫升的上述介質(zhì)中，盛于3升的燒瓶中，該混合物在不斷搖動中于28℃培養(yǎng)24小時。得到的產(chǎn)物用以接種到10升的上述介質(zhì)中，盛于16升的發(fā)酵器中，以350轉(zhuǎn)/分的速度攪拌，10升/分的速度充入空氣，在28℃培養(yǎng)24小時。再將此發(fā)酵物(600毫升)接種到16升的含有部分水解的淀粉(640克)，硫酸銨(32克)，磷酸氫二鉀(16克)，氯化鈉(16克)，七水硫酸鎂(16克)，碳酸鈣(32克)，可溶性酵母抽提物(6.4克)，七水硫酸亞鐵(0.016克)，七水硫酸鋅(0.016克)和四水氯化錳(0.016克)的介質(zhì)中，盛于20升的發(fā)酵器中。發(fā)酵物在28℃培養(yǎng)，以350轉(zhuǎn)/分速度攪拌并以15升/分的速度充氣。在培養(yǎng)進行到24、48和72小時后的三個時刻，分別加入1.6克的環(huán)丁烷羧酸鈉鹽，發(fā)酵持續(xù)120小時。然后將菌絲體過濾出來，用丙酮(3×7升)萃取。萃取液減壓濃縮到大約2升，再用二氯甲烷(2×5升)萃取。將二氯甲烷濃縮至干得到粗產(chǎn)品是一種流動性的油。該油溶于150毫升異辛烷中，該溶液再用甲醇(95毫升)和水(5毫升)的混合液萃取。甲醇萃取物經(jīng)蒸發(fā)后得到部分純化的物質(zhì)，經(jīng)高壓液相色譜將該物質(zhì)的各個組分分開如下殘余物溶于少量甲醇，在Waters Prep 500型高壓液相色譜儀的C18 Micro-Bondapack柱(50毫米×50厘米)上進行分離，用甲醇/水(4∶1)混合物洗脫，流速為100毫升/分。級分1-4合并一起用于例9，級分5-9合并一起用于例10，級分10-19合并一起用于例11，級分20-35合并一起用于例12。
例925-環(huán)丁基avermectin B2(R1＝OH，R3＝H)例8中合并的級分1-4蒸發(fā)至干，殘余物再在C18 Zorbax ODS(商標(biāo)，杜邦)柱(21毫米×25厘米)上，用甲醇和水(3∶1)的混合液以9毫升/分的速度洗脫，進行色譜分離。將有關(guān)級分合并，蒸去溶劑，產(chǎn)品進行最后純化，純化方法是用Silica Spherisorb 5 micron(商標(biāo)，HPLC技術(shù))柱(10.5毫米×25厘米)，以二氯甲烷和甲醇(98∶2)的混合物為洗脫劑，流速為4毫升/分，進行色譜分離。將有關(guān)級分合并，蒸除溶劑至得到式(Ⅰ)化合物，其中R1是OH，雙鍵不存在，R2是環(huán)丁基，R3是H和R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-α-L-齊墩果糖氧基，是一種白色粉末，熔點110-112℃。產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)由如下質(zhì)譜數(shù)據(jù)證實。
在VG 7070E型質(zhì)譜計上用三甘醇和固體氯化鈉作樣品基體進行快速原子轟擊質(zhì)譜測定，在質(zhì)荷比911處觀察到(M+Na)+離子峰(理論值911)。
在VG 7070F型質(zhì)譜計上進行電子轟擊質(zhì)譜測定。主要碎片的質(zhì)荷比值如下321，303，261，257，237，219，209，191，179，167，145，127，113，111，95和87。
例1025-環(huán)丁基-avermectin A2(R1＝OH，R3＝CH3)例8中合并的級分5-9蒸發(fā)至干，殘余物在C18 Zorbax ODS(商標(biāo)，杜邦)柱上(21毫米×25厘米)，用甲醇和水(77∶23)混合液以9毫升/分的速度洗脫，重復(fù)兩次色譜分離。將適當(dāng)?shù)募壏趾喜?，蒸發(fā)至得到式(Ⅰ)化合物，其中R1是OH，雙鍵不存在，R2是環(huán)丁基，R3是CH3，R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-L-齊墩果糖氧基，是一種白色粉末，熔點135-140℃。
產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)由如下質(zhì)譜數(shù)據(jù)證實在VG 7070E型質(zhì)譜計上用三甘醇和固體氯化鈉為樣品基體進行快速原子轟擊質(zhì)譜測定，在質(zhì)荷比925處觀察到(M+Na)+離子峰(理論值925)。
在VG 7070F型質(zhì)譜計上進行了電子轟擊質(zhì)譜測定，主要碎片離子的質(zhì)荷比值是596，454，321，303，275，237，219，209，191，179，167，145，127，113，111，95和87。
例1125-環(huán)丁基-avermectin B1(22，23-雙鍵存在，R3＝H)例8中合并的級分10-19蒸發(fā)至干，殘余物溶于甲醇，在C18 Zorbax ODS(商標(biāo)，杜邦)柱上進行色譜分離，柱尺寸為21毫米×25厘米，甲醇和水(4∶1)的混合液為洗脫劑，流速為9毫升/分。有關(guān)級分合并，蒸除溶劑，得到的產(chǎn)品在SiLica Zorbax SIL(商標(biāo)，杜邦)柱(21毫米×25厘米)上再一次色譜分離，用二氯甲烷和甲醇(98.5∶1.5)的混合液洗脫，流速為9毫升/分。將有關(guān)組分合并，蒸去溶劑得到式(Ⅰ)化合物，其中R1不存在，有雙鍵，R2是環(huán)丁基，R3是H，R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-L-齊墩果糖氧基，是一種白色粉末，熔點135-138℃。產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)由如下質(zhì)譜數(shù)據(jù)證實在VG 7070E型質(zhì)譜計上用三甘醇和固體氯化鈉為樣品基體進行快速原子轟擊質(zhì)譜測定，在質(zhì)荷比893處觀察到(M+Na)+離子峰(理論值893)。
在VG 7070F型質(zhì)譜計上進行電子轟擊質(zhì)譜測定，主要碎片離子的質(zhì)荷比值是303，261，257，219，191，167，145，127，113，111，95和87。
例1225-環(huán)丁基-avermectin A1(22，23-雙鍵存在，R3＝CH3)將例8中合并的級分20-35蒸發(fā)至干，殘余物在C18 Zor-bax ODS(商標(biāo)，杜邦)柱(21毫米×25厘米)上，以9毫升/分流速洗提，進行色譜分離。將有關(guān)級分合并，蒸除溶劑，產(chǎn)品在-Silica Sperisorb 5 micron(商標(biāo)，HPLC技術(shù))柱上，用二氯甲烷和甲醇混合液(98.5∶1.5)，以4毫升/分速度洗脫，進行色譜分離。有關(guān)級分合并并蒸發(fā)后得到式(Ⅰ)化合物，其中R1不存在，有雙鍵，R2是環(huán)丁基，R3是CH3，R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-L-齊墩果糖氧基，是一白色粉末，熔點120-124℃。產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)由以下質(zhì)譜數(shù)據(jù)給予證實在VG 7070E質(zhì)譜計上用三甘醇和固體氯化鈉作樣品基體進行快速原子轟擊質(zhì)譜測定，在質(zhì)荷比907處觀察到(M+Na)+離子峰(理論值907)。
在VG 7070F型質(zhì)譜計上進行電子轟擊質(zhì)譜測定，主要碎片離子的質(zhì)荷比值是578，303，275，257，219，191，167，145，127，113，111，95和87。
例1325-(環(huán)己-3-烯基)avermectin A2除了用3-環(huán)己烯酸鈉鹽作為基質(zhì)以外，遵照例1的介質(zhì)和條件，得到式(Ⅰ)化合物，其中R1是OH，雙鍵不存在，R2是環(huán)己-3-烯基，R3是CH3和R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-α-L-齊墩果糖氧基，是一種白色粉末，熔點131-5℃。該產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)由以下質(zhì)譜數(shù)據(jù)進一步證實在VG 7070E型質(zhì)譜計上用三甘醇和固體氯化鈉作為樣品基體，進行了快速原子轟擊質(zhì)譜測定，在質(zhì)荷比951處觀察到(M+Na)+離子峰(理論值951)。
在VG 7070F型質(zhì)譜計上進行電子轟擊質(zhì)譜測定，主要碎片離子的質(zhì)荷比值是624，480，347，329，275，263，245，235，217，205，193，179，145，127，113，111，95和87。
例1425-環(huán)己基avermectin A2除了改用環(huán)己烷羧酸鈉鹽作為基質(zhì)以外，根據(jù)例1的介質(zhì)和條件，得到式(Ⅰ)化合物，其中R1是OH，R2是環(huán)己基，R3是CH3，R4是4′-(α-齊墩果糖基)-α-L-齊墩果糖氧基，是一種白色粉末，熔點112-117℃。
產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)由質(zhì)譜數(shù)據(jù)得到進一步證實在VG 7070E型質(zhì)譜計上用三甘醇和固體氯化鈉作為樣品基體，進行快速原子轟擊質(zhì)譜測定，在質(zhì)荷比953處看到(M+Na)+離子峰(理論值953)。
在VG 7070F型質(zhì)譜計上進行了電子轟擊質(zhì)譜測定，主要碎片離子的質(zhì)荷比是624，482，349，331，275，265，247，237，219，207，195，179，145，127，113，111，95和87。
例1525-(1-甲硫乙基)avermectin A2
除了改用2-甲硫基丙酸鈉鹽作為基質(zhì)以外，按照例1的介質(zhì)和條件得到式(Ⅰ)化合物，其中R1是OH，R2是1-甲硫基乙基，R3是CH3，R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-齊墩果糖氧基氧代，是一種白色粉末，熔點134-138℃。
產(chǎn)品結(jié)構(gòu)由下列質(zhì)譜數(shù)據(jù)進一步證實在VG 7070E型質(zhì)譜計上用三甘醇和固體氯化鈉為樣品基體，進行快速原子轟擊質(zhì)譜測定，在質(zhì)荷比945處看到(M+Na)+離子峰(理論得945)。
在VG 7070F型質(zhì)譜計上進行了電子轟擊質(zhì)譜測定，主要碎片離子的質(zhì)荷比值是341，323，275，263，257，239，211，187，179，145，127，113，111，95和87。
例1625-(2-甲基環(huán)丙基)avermectin A2除了改用2-甲基環(huán)丙烷羧酸鈉鹽作為基質(zhì)以外，按照例1的介質(zhì)和條件得到式(Ⅰ)化合物，其中R1是OH，R2是2-甲基環(huán)丙基，R3是CH3，R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-齊墩果糖氧基，是一種白色粉末，熔點147-150℃。
產(chǎn)品結(jié)構(gòu)由下面的質(zhì)譜數(shù)據(jù)得到進一步證實在VG 7070E型質(zhì)譜計上用三甘醇和固體氯化鈉作樣品基體進行了快速原子轟擊質(zhì)譜測定，在質(zhì)荷比925處看到了(M+Na)+離子峰(理論值925)。
在VG 7070F型質(zhì)譜計上進行了電子轟擊質(zhì)譜測定，主要碎片離子的質(zhì)荷比值是596，454，303，275，237，219，209，191，179，167，145，127，113，111，95和87。
例17按照例1的步驟，但要下列酸的鈉鹽作基質(zhì)以代替環(huán)戊烷羧酸，得到相應(yīng)的具有結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的25位上被取代的avermectins，其中R1是OH而雙鍵不存在或雙鍵存在而R1不存在，R3是H或OH而R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-α-L-齊墩果糖氧基2-甲基戊酸2，3-二甲基丁酸2-甲基己酸2-甲基戊-4-烯酸2-甲基戊酸2-環(huán)丙基丙酸環(huán)庚烷羧酸4，4-二氟環(huán)己烷羧酸4-亞甲基環(huán)己烷羧酸3-甲基環(huán)己烷羧酸環(huán)戊烯-1-羧酸1-環(huán)己烯羧酸四氫吡喃-4-羧酸噻吩-2-羧酸3-糠酸及2-氯-噻吩-4-羧酸例1825-環(huán)丁基-22，23-二氫-avermectin B1按照歐洲專利(EP-A-)0001689號申請說明書敘述的方法，在三(三苯基膦)氯化銠(Ⅰ)存在下，將例11的產(chǎn)品在苯中氫化，得到相應(yīng)的式(Ⅰ)化合物，其中R1是H，雙鍵不存在。
例1913-脫氧-25-環(huán)戊基-avermectin A2-糖苷配基將例1產(chǎn)品在室溫下用稀硫酸處理，分離出得到的糖苷配基產(chǎn)物，并在二甲基甲酰胺中與叔-丁基二甲基氯化硅反應(yīng)，得到23-0-叔-丁基二甲基硅基糖苷配基衍生物。該產(chǎn)物溶于含有4-二甲基氨基吡啶和二異丙基乙基胺的二氯甲烷中，用冰冷卻并逐滴加入4-硝基苯磺酰氯進行反應(yīng)，得到13-氯-13-脫氧產(chǎn)物。最后按照歐洲專利申請說明書0002615號敘述的步驟，將上述產(chǎn)物與三丁基氫化錫反應(yīng)脫鹵，并與含有痕量對甲苯磺酸的甲醇作用去保護基，得到式(Ⅰ)化合物，其中R1和R4均為H，R3是OH，雙鍵不存在，R2是環(huán)戊基。
例20灌服藥制劑將前面任一實例的產(chǎn)物溶于聚乙二醇(平均分子量300)得到含量為400微克/毫升的溶液，用作灌服藥。
例21抗腸蟲活性按照K.G.Simpkin和G.L.Coles在Parisitology中(1979，第79卷，19頁)敘述的方法，通過對Caenor-habditis ele ans進行體外用藥篩選試驗評價了它們的抗腸蟲活性。例1，7和9-16的產(chǎn)品都100%地殺死了蠕蟲，而它們的濃度僅為0.1微克/毫升。
例22殺蟲活性使用標(biāo)準(zhǔn)的試驗程序，即將家蠅用二氧化碳麻醉，將含有試驗化合物的丙酮(0.1微升)置于雌蠅的胸部，試驗證明了對成年家蠅(Musca domestica)的活性。例1，7和9-16的產(chǎn)品將受處理的家蠅100%地殺死，所用劑量是每只家蠅0.01微克。
勘誤表
勘誤表
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)一種在25位上具有奇異取代基的新型avermectin衍生物的方法，包括在產(chǎn)生avermectin的生物體的發(fā)酵過程中加入一種羧酸或其鹽、酯或酰胺，或者其氧化的前體，以及分離該新型avermectin衍生物。
2.生產(chǎn)具有下式的化合物的方法
其中22-23位之間的虛線代表一個選擇性的雙鍵，R1是H或OH而雙鍵不存在，或者，雙鍵存在而R1不存在;R2是一個α-分支的C3-C8烷基，鏈烯基，炔基，烷氧烷基或烷基硫烷基;一個C5-C8環(huán)烷基烷基，其中烷基是一個α分支的C2-C5烷基;一個C3-C8環(huán)烷基或C5-C8環(huán)烯基，其中任何一個都可以被亞甲基或者一個或多個C1-C4烷基或者鹵原子任意性地取代;或一個含氧或含硫的3到6員雜環(huán)，它可以是飽和的，或完全或部分地不飽和的，它可以被一個或多個C1-C4烷基或鹵原子任意地取代;R3是氫或甲基;R4是H或一個具有下式的4′-(α-L-齊墩果糖基)-α-L-齊墩果糖氧基
其前提條件是R2是烷基時，它不是異丙基或仲-丁基;R4是H，R1是H，且雙鍵不存在時，R2不是甲基或乙基;當(dāng)R4是H，R1是OH，且沒有雙鍵時，R2不是2-丁烯-2-基，2-戊烯-2-基或者4-甲基-2-戊烯-2-基;這個方法包括在具有式R2CO2H的羧酸(其中R2的意義前已限定)或其鹽，酯或酰胺，或其氧化的前體存在時，使可以生成avermectin的生物體菌株Streptomyces avermitilis發(fā)酵，以及分離出具有式(Ⅰ)的化合物，其中R1是OH而雙鍵不存在或者雙鍵存在而R1不存在以及R4是4′-(α-L-齊墩果糖基)-α-L-齊墩果糖氧基;還有，如果需要，可將化合物(其中雙鍵存在而R1不存在)還原得到式(Ⅰ)化合物(其中R1是H而雙鍵不存在);或者，如果需要，經(jīng)水解消除4′(α-L-齊墩果糖基)-αL-齊墩果糖氧基，再鹵化和還原得到式(Ⅰ)化合物(其中R4是H)。
3.按照權(quán)利要求
2的方法，其中生物體是Streptomyces avermitilis NCIB 12121。
4.按照權(quán)利要求
2的方法，其中酸以鹽的形式加入。
5.按照權(quán)利要求
2的方法，其中R4是41-(α-L-齊墩果糖基)-α-L-齊墩果糖氧基，而不進行選擇性的消除步驟。
6.按照權(quán)利要求
5的方法，其中R2是一個C5或C6環(huán)烷基或環(huán)烯基，它們可以被一個或多個C1-C4烷基任意地取代。
7.按照權(quán)利要求
6的方法，其中R2是環(huán)戊基。
8.按照權(quán)利要求
5的方法，其中R2是環(huán)丁基。
9.按照權(quán)利要求
5的方法，其中R2是3-噻吩基。
10.按照權(quán)利要求
5的方法，其中R2是1-甲硫乙基。
專利摘要
本發(fā)明提供了具有下式的新型化合物，其中22-23位之間的虛線表示一個選擇性的雙鍵，而其中R
文檔編號C12P17/18GK86105218SQ86105218
公開日1987年3月4日 申請日期1986年7月25日
發(fā)明者保羅·斯蒂芬·吉布森, 凱爾文·斯科特·霍爾多姆, 亞利山大·克羅?！す诺喜┦? 約翰·德斯蒙德·布洛克教授 申請人:輝瑞公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan