專(zhuān)利名稱(chēng):抗原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)疫苗的制作方法
本發(fā)明與抗原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)感染的疫苗有關(guān)，這種疫苗以免疫原(該免疫原缺少致病寄生蟲(chóng)固有表面抗原的重復(fù)的抗原決定部位)為顯著特征。更準(zhǔn)確地說(shuō)，本發(fā)明涉及的有免疫原(缺少各種寄生蟲(chóng)表面抗原的重復(fù)的抗原決定位置)，生產(chǎn)免疫原的方法，使用免疫原的方法，以及含有免疫原的組合物引起哺乳動(dòng)物對(duì)原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)感染的免疫與治療。
典型的原生動(dòng)物是單細(xì)胞生物，它無(wú)細(xì)胞壁，以吞噬獲得食物。按照其游動(dòng)機(jī)制，可以把原生動(dòng)物分類(lèi)。以變形運(yùn)動(dòng)的原生動(dòng)物叫肉足蟲(chóng)類(lèi)，以鞭毛運(yùn)動(dòng)為特征的叫鞭毛蟲(chóng)類(lèi)，以纖毛運(yùn)動(dòng)的稱(chēng)纖毛蟲(chóng)類(lèi)，第四類(lèi)屬孢子蟲(chóng)類(lèi)它無(wú)運(yùn)動(dòng)器，而是以它們的復(fù)分裂，即一個(gè)單細(xì)胞分裂成許多小細(xì)胞-孢子為特征。
孢子蟲(chóng)綱是原生動(dòng)物的一大類(lèi)，所有的孢子蟲(chóng)都是專(zhuān)性寄生的。它們產(chǎn)生一種結(jié)構(gòu)稱(chēng)作子孢子，子孢子類(lèi)似于細(xì)菌或真菌的休眠芽孢。子孢子參與寄生蟲(chóng)的轉(zhuǎn)移而到新寄主體內(nèi)。巴倍蟲(chóng)(Babesia)是孢子蟲(chóng)綱動(dòng)物，它是在高等動(dòng)物紅血球中被發(fā)現(xiàn)的，傳播媒介是蜱。到目前為止，孢子蟲(chóng)綱最重要的組成成員是虐原蟲(chóng)(虐疾寄生蟲(chóng))。
虐疾是世界上很多地區(qū)發(fā)病率和死亡率的主要原因[第三屬熱帶病研究及訓(xùn)練專(zhuān)題年報(bào)告3rd Annual Report on the special program for Research and Training in Tripical Diseases，WHO.Geneva(1979)]。世界上差不多有三分之一的人口受到虐疾感染的危脅。有人估計(jì)，每年約有1億5千萬(wàn)人感染虐疾。在非洲，僅死亡約有1百萬(wàn)(主要是兒童)[J.A.Deans and S.Cohen，“虐疾免疫學(xué)”“Immunology of malaria”Ann，Rev，Microbiol.，37，pp.
25-49(1963);A.Noguer et.al.，WHO Chron.，32，pp.9-17(1978)]。因此，瘧疾構(gòu)成世界熱帶和亞熱帶地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主要限制因素。
在大范圍內(nèi)，引起脊椎動(dòng)物瘧疾的瘧原蟲(chóng)，已經(jīng)記載的有100種以上。這些瘧原蟲(chóng)顯示了很狹窄的寄主特異性。例如，感染人的僅有四種惡性瘧原蟲(chóng)(P.falciparum)，間日瘧原蟲(chóng)(P.vivax)，三日瘧原蟲(chóng)(P.malariae)和卵形瘧原蟲(chóng)(P,ovale)，在每一種瘧原蟲(chóng)內(nèi)還有很高的抗原異源性[E.g.，R.L.Coppel et al.，特殊分離的惡性瘧原蟲(chóng)的S-抗原含有11個(gè)氨基酸的重復(fù)序列“Isolate-Specific S-antigen of Plasmodium Falciparum Contains A repeated Sequence of Eleven Amino Acids，”Nature，306，pp751-55(1983);R.F.Anders et al.，”若干分離的惡性瘧原蟲(chóng)合成的S-抗原的鑒定，“Characterization of an S-antigen synthesized by several Isolates of Plasmodium Falciparum”P(pán)roc.Natl acad.sci.USA.80pp.6652-56(1983)]普遍的消滅瘧疾受到許多實(shí)際困難的困擾。由于蚊蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)藥劑抗性的增加和出現(xiàn)許多品系的瘧原蟲(chóng)，對(duì)普遍使用的化學(xué)治療劑，包括4-氨基喹啉，如氯喹產(chǎn)生抗性，使這些實(shí)際問(wèn)題混雜在一起。
此外，制備瘧疾疫苗也受若干困難所困擾。如從生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中的瘧原蟲(chóng)中制備抗原化合物是十分困難的，特別是在需要大規(guī)模的有用疫苗時(shí)。而且，由于特異的免疫過(guò)程作用，瘧原蟲(chóng)生活史中存在很多潛在的靶子。例如，保護(hù)性免疫可以抵抗兩種不同發(fā)育階段的瘧原蟲(chóng)-子孢子和無(wú)性繁殖的血液階段瘧原蟲(chóng)[G.V.Brown.et al.，“提純的人免疫球蛋白靶抗原在體外實(shí)驗(yàn)中抑制惡性瘧原蟲(chóng)的生長(zhǎng)”“Target Antigen of purified Human Immunolobulins which inhibit Groth of Plasmodium falciparum in vitro”Nature，297，pp.591-93(1982)]
此外，瘧原蟲(chóng)可以借助于位于自己免疫反應(yīng)表面抗原免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)的免疫德夸蛋白的效力，能夠躲避檢查和躲避受害寄主免疫系統(tǒng)的攻擊。(見(jiàn)下面的討論)[G.N.Gordon et al.，Nature，305，pp 29-33(1983)]由于瘧蚊的叮咬，瘧原蟲(chóng)的子孢子被帶入人體。無(wú)性繁殖的血液階段瘧原蟲(chóng)主要擔(dān)負(fù)瘧疾的臨床癥狀。通過(guò)許多發(fā)育階段如環(huán)狀體，滋養(yǎng)體，裂殖體等達(dá)到成熟。最后，在無(wú)性世代末;成熟的裂殖體破壞紅血球，裂殖子被釋放到血液循環(huán)中。然后，釋放出來(lái)的裂殖子進(jìn)攻其它紅血球膜上的特異受體而開(kāi)始侵入紅血球。它們又分化出雌配子母細(xì)胞和雄配子母細(xì)胞，雌雄配子母細(xì)胞可被蚊子攝取，并通過(guò)有性繁殖，為以后的感染產(chǎn)生出子孢子。
已經(jīng)表明，無(wú)性繁殖血液階段的抗原，特別是裂殖體和裂殖子的抗原在保護(hù)性免疫，免患瘧疾方面起主要作用。例如，來(lái)自免疫供體的免疫球蛋白識(shí)別裂殖體-裂殖子特異的抗原。[L.H.Perrin and R.Dayal，Immunol，Rev.61，pp 245-69(1982);G.V.Brown，et al.，Nature，297，pp 591-93(1982);J.H.L，Playfair，Bull.WHo，57，pp.245-46(1979)]。對(duì)裂殖體-裂殖子的免疫血清和單克隆抗體在體外實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)顯示出對(duì)瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)的抑制性活性。[Brown.et al.見(jiàn)上文;Playfair，見(jiàn)上文;L.H.Perr in et al.，Nature，289，pp 301-02(981);L.Schofield et al.，Infect.Immun.，38，pp.893-97(1982)]。然而，Perrin等的單克隆抗體與來(lái)自世界各地的瘧原蟲(chóng)分離物起反應(yīng)，并且抑制了瘧原蟲(chóng)的生長(zhǎng)[L.H.Perrin et al.，Clin.exp.Immunol.(1984);B.Berkli et.al.，第六屬?lài)?guó)際寄生蟲(chóng)學(xué)會(huì)文摘“Abstract sixth Int.Cong.of Parasitology，Calgary(1984)”]。
由努力了解更多瘧原蟲(chóng)并試圖生產(chǎn)出有效的抗瘧原蟲(chóng)疫苗，已經(jīng)利用DNA重組技術(shù)，克隆化了各種瘧疾抗原并生產(chǎn)出瘧疾抗原。例如，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)，分子量145，000的抗原已在大腸桿菌E，coli中克隆化[K.G.Odink et al.，給高分子抗原編碼的瘧原蟲(chóng)基因克隆化惡性瘧原蟲(chóng)基因的分離片段給145，000分子量的蛋白質(zhì)編碼，”“Cloning of malarial Genes Coding for High Molecular Weight AntigensIsolation of fragments of Plasmodium Falciparum genes codingfor proteins of 145，000 Molecular weight”Mol，Biochem.Parasite，10，pp.55-56(1984)]。另外，已有基因編碼間日瘧原蟲(chóng)(P.vivax)圍子孢子蛋白的報(bào)導(dǎo)[D.E.Arnot et al.，“間日瘧原蟲(chóng)的圍子孢子蛋白基因克隆化和免疫顯性抗原決定部位的鑒定”(Circumsporozoite protein of Plasmodium vivaxGene Cloning and Characterization of lmmunodominant Epitope)，Science，230，pp.815-18(1985)]。由于這一研究的結(jié)果，已經(jīng)證明，瘧疾表面抗原有重復(fù)氨基酸的區(qū)域。例如，間日瘧原蟲(chóng)圍子孢子(CS)蛋白的演繹序列由373個(gè)氨基酸組成，并具有一個(gè)由9個(gè)氨基酸19個(gè)串聯(lián)重復(fù)的中心區(qū)域。
一組尚未鑒定的“血液階段”的抗原也已被克隆，并在大腸桿菌E，coli中表達(dá)[E.J.Kemp.et al.，“間日瘧原蟲(chóng)血液階段抗原在大腸桿菌中的表達(dá)“利用免疫人的抗體檢驗(yàn)“Expression of P.Falciparum Blood-stage Antigens in E.ColiDetection with Antibodies from immune Humans”P(pán)roc.Natl.Acad.Sci.USA，80，pp 3787-91(1983)]這些抗原好像也有重復(fù)區(qū)。例如Kemp等人已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了一種抗原是特異性分離物，含有11個(gè)氨基酸的重復(fù)序列。[R.L.Coppel et al.，惡性瘧原蟲(chóng)的特異性分離物S-抗原含有一個(gè)11個(gè)氨基酸的重復(fù)序列。Narture，306，pp，751-56(1983)]。
據(jù)說(shuō)，重復(fù)氨基酸序列還存在于瘧原蟲(chóng)的其它血液階段抗原中[R.L.Coppel et al.，Nature，302，751(1983);R.L.Coppel et al.，Nature，310 789(1984);A.F.Cowman et al.，Cell 40，775(1985)]。例如，子孢子的圍子孢子(CSO)蛋白有一個(gè)免疫顯性的抗原決定部位，該抗原決定部位在每個(gè)分子內(nèi)至少被重復(fù)兩次。據(jù)報(bào)導(dǎo)，來(lái)自瘧原蟲(chóng)P.Knowlesi子孢子表面抗原是以重復(fù)氨基酸的序列為顯著特征的[J，Ellis et al.，瘧原蟲(chóng)P.Knowlesi子孢子表面抗原基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)”Nature，302，pp 536-38(1983)]。又進(jìn)一步報(bào)導(dǎo)，瘧原蟲(chóng)圍子孢子蛋白的免疫反應(yīng)區(qū)域被包容在12倍串聯(lián)的重復(fù)抗原決定部位中，該抗原決定部位含有一個(gè)重復(fù)的12個(gè)氨基酸單位，它被稱(chēng)為“重復(fù)抗原決定部位”(repitope)。[G.N.Godson et al.，“瘧原蟲(chóng)圍子孢子蛋白串聯(lián)重復(fù)免疫區(qū)域抗原區(qū)域的鑒定和化學(xué)合成”。Natue，305，pp.29-33(1983)]，其它原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)如巴倍蟲(chóng)(Babesia)的抗原，也是以這樣重復(fù)的抗原決定部位為特征的。[A.F.Cowman et al.，Cell.37，pp 653-660(1984)]。
據(jù)觀察，瘧原蟲(chóng)抗原絕大部分免疫原是重復(fù)序列部分或抗原決定部位。如在惡性瘧原蟲(chóng)(P.falciparum)中，從三肽鍵重復(fù)衍生來(lái)的30氨基酸肽鍵比僅從位于重復(fù)區(qū)上游的單拷貝部位衍生來(lái)的肽鍵含有更多的免疫原。利用其它的原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)物種進(jìn)一步證實(shí)了在瘧原蟲(chóng)抗原中重復(fù)抗原決定部位有很高的免疫原特征。[Enea et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，81，pp.7520-24(1984)]。鑒于它們的高抗原活性，至今人們還十分關(guān)心利用這些抗原的重復(fù)抗原決定部位作為潛在的抗瘧疫苗來(lái)源，然而，到目前為止，其結(jié)果令人失望。
有人已經(jīng)建議，雖然重復(fù)抗原決定部位是免疫顯性，但它們是作為德夸(decoy)避免誘導(dǎo)保護(hù)性抗體來(lái)防止寄生蟲(chóng)感染的。[G.N.Godson et al.，Philos.Trans，R.Soc.B307，pp.129-32(1984)]。例如，當(dāng)惡性瘧原蟲(chóng)(P.falciparum)的重復(fù)抗原決定部位在分離中改變時(shí)，重復(fù)區(qū)上游的單拷貝序列仍保持不變，它暗示關(guān)于部分寄生蟲(chóng)避免檢出的機(jī)制[A.F.Cowman et al.，Cell.40，pp.775-82(1985)]。
由于本發(fā)明提供了抗原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)(該寄生蟲(chóng)以表面抗原決定部位為特征，或由一系列重復(fù)的氨基酸序列組成的抗原決定部位為特征)感染的疫苗，因而該發(fā)明解決了上述的有關(guān)問(wèn)題。更準(zhǔn)確地說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明，我們所提供的疫苗實(shí)際上缺乏原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)表面抗原所特有的全部重復(fù)抗原決定部位。這些疫苗能使受害寄主或靶寄主產(chǎn)生抗體，而抗體能夠識(shí)別并聯(lián)結(jié)到缺乏重復(fù)任一端上的單拷貝序列上，起到免疫和殺死靶寄生蟲(chóng)的目的。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是第一次對(duì)被寄生蟲(chóng)感染的受害寄主進(jìn)行免疫預(yù)防或治療成為可能。盡管這些寄生蟲(chóng)依靠它們自己的免疫反應(yīng)表面抗原的免疫顯性部位“免疫德夸蛋白”，以前可能逃避了寄主免疫系統(tǒng)的進(jìn)攻。
實(shí)施本發(fā)明的目的之一包括DNA序列(在本發(fā)明的疫苗中DNA序列是有用的，它編碼寄生蟲(chóng)似抗原肽或多肽)的定位和鑒定，帶有這些DNA序列的各種各樣寄主的轉(zhuǎn)化作用以及寄生蟲(chóng)似抗原肽或多肽(實(shí)際上缺乏以天然產(chǎn)生的抗原決定部位為特征的全部重復(fù)氨基酸序列)在這些已轉(zhuǎn)化寄主內(nèi)的生產(chǎn)。在根據(jù)本發(fā)明所生產(chǎn)的寄主蟲(chóng)的似抗原肽，多肽和免疫原中，原生動(dòng)物的抗原已被修飾，如修飾瘧原蟲(chóng)抗原，或修飾巴倍蟲(chóng)抗原。
在合適的寄主內(nèi)，這種DNA序列的表達(dá)，允許大量地生產(chǎn)本發(fā)明疫苗中有用的肽和多肽。這樣可以很快地測(cè)定這些肽和多肽的分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，并且也可以很快地測(cè)定它們?cè)诮Y(jié)合和抑制靶寄生蟲(chóng)活性方面的效率?；蛟诩闹黧w內(nèi)或者是適當(dāng)衍生或修飾之后產(chǎn)生時(shí)，了解肽和多肽的成份和方法是有用的，可以監(jiān)測(cè)和改進(jìn)這些產(chǎn)物的生產(chǎn)，以便把疫苗用于靶寄主，包括人。
還可以利用合成肽的方法(已知的技術(shù))制備本發(fā)明中缺失重復(fù)的寄生蟲(chóng)表面抗原肽和多肽。此外，其它已知的制造免疫原的方法，包括抗特異基因型抗體的形成，也可以采用。
附圖的扼要說(shuō)明圖1.描寫(xiě)瘧性插入片P31-1的核苷酸序列和衍生的氨基酸序列。
圖2 是重組DNA分子31-1較長(zhǎng)缺失結(jié)構(gòu)的圖解式描述。
圖3 是重組DNA分子31-1重復(fù)缺失結(jié)構(gòu)的圖解式描述。
圖4 描寫(xiě)31-1重復(fù)缺失的核苷酸序列及其衍生的氨基酸序列。
圖5 描述表達(dá)載體31a，31b，31c和34C的核苷酸序列。
為了更充分地理解本文所描述的發(fā)明，詳細(xì)描述如下。
在下面的描述中，采用一個(gè)概念重復(fù)序列-在本申請(qǐng)中所述使用的“重復(fù)序列”或“重復(fù)抗原決定部位”(repitope)指的是寄生蟲(chóng)表面抗原串聯(lián)的重復(fù)抗原決定部位。在多肽中，這包括一系列兩個(gè)或多個(gè)氨基酸，即每個(gè)分子中至少有兩倍的串聯(lián)重復(fù)。例如，在間日瘧原蟲(chóng)(P.vivax)的圍子孢子蛋白中有9個(gè)氨基酸的19次串聯(lián)重復(fù)，在瘧原蟲(chóng)(P.Knowlesi)中有12個(gè)氨基酸重復(fù)12次，這就舉例說(shuō)明了本說(shuō)明書(shū)中所指的“重復(fù)序列”或“重復(fù)抗原決定部位”含意。
本發(fā)明與抗原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)(據(jù)認(rèn)為這些原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)存在有重復(fù)氨基酸的抗原決定部位而避開(kāi)寄主系統(tǒng)的檢驗(yàn))的疫苗有關(guān)。
按照本發(fā)明，從靶寄生蟲(chóng)表面抗原(已被切除全部的或部分的重復(fù)抗原決定部位)衍生的肽或多肽，被用于免疫或治療由原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)引起的感染，如瘧疾和巴倍蟲(chóng)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，編碼原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)抗原的DNA序列已被鑒定，并且編碼抗原重復(fù)氨基酸的DNA序列或大體上，或完全被刪去。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例就是采用這些DNA序列，按照在各種原核和真核寄主內(nèi)被轉(zhuǎn)化的表達(dá)方式，生產(chǎn)“缺重復(fù)”的寄生蟲(chóng)抗原，用作本發(fā)明的疫苗。為了在重復(fù)抗原決定部位的一端或兩端產(chǎn)生肽或多肽，也可以修飾這些DNA序列。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員還知道，有可替代的方法制備這些肽或多肽。例如，它們包括位于重復(fù)抗原決定部位的一端或兩端的肽或多肽的合成性肽生產(chǎn)。此外，制備疫苗的各種免疫學(xué)方法也可被用于生產(chǎn)本發(fā)明中的肽或多肽。
服用這些組合物，或其可藥用的以及免疫學(xué)上有效的衍生物，可以通過(guò)常規(guī)地任何一種可采用的服藥方式，而顯示出抗原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)的免疫原性。這些服用方式包括口服或非腸胃給藥。
這些疫苗所使用的組合物也可以有多種形態(tài)，例如，包括固體的，半固體的和液體劑型，如粉劑，液體溶劑或懸劑、栓劑，注射劑和浸劑，究竟哪種劑型好取決于給藥方式和治療應(yīng)用。
疫苗的組合物最好包括常規(guī)的可藥用載體，還可以有其它的藥劑，載體，佐劑，賦形劑等，例如人血清白蛋白或血漿制劑。本發(fā)明的優(yōu)選組合物是以單位劑量的形式出現(xiàn)。作為免疫作用或治療作用的活性物質(zhì)，每次給藥量，或每段時(shí)間的服藥量決定于治療對(duì)象、給藥方式和治療大夫的判斷。然而，有效劑量范圍約為本發(fā)明組合物的lng-lmg，最好約為100μg-500μg。據(jù)認(rèn)為，較低或較高劑量也都可以使用。
因此，本發(fā)明提供了一種抗原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)感染哺乳動(dòng)物包括人體的疫苗接種方法，也提供了一種治療原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)感染哺乳動(dòng)物包括人的方法，包括疫苗或藥劑(以本發(fā)明中的肽或多肽為特征的)在免疫學(xué)上有效劑量的服藥方法。
為了更充分地理解本文所描述的發(fā)明，舉例如下。應(yīng)當(dāng)明白，下面的例子僅僅是為了闡明的目的，而不應(yīng)該理解成以某種形式把本發(fā)明限制在這里引用的特殊的具體實(shí)施例上。
實(shí)施例在這一例子中，我們闡明制造一種多肽的方法，該多肽有惡性瘧原蟲(chóng)(P.falciparum)表面抗原的單拷貝序列，但缺失免疫顯性重復(fù)序列(該序列可允許寄生蟲(chóng)逃避和德夸免疫系統(tǒng))。
我們首先利用DNA插入片P31-1生產(chǎn)惡性瘧原蟲(chóng)(P.falciparum)特異階段后期裂殖體-裂殖子抗原31-1(如同PCT申請(qǐng)W085/03725中描述的一樣)。然后修飾DNA序列。正如上面指出的那樣，可有選擇地刪去部分重復(fù)抗原決定部位，或者可制備在重復(fù)抗原決定部位的任一端上的多肽，并產(chǎn)生用作有效免疫原的組合物。
DNA插入片P31-1的核苷酸序列及其產(chǎn)生的氨基酸序列描寫(xiě)在圖1。正如圖1描述的一樣，從DNA插入片P31-1產(chǎn)生的氨基酸序列可以分成3部分43個(gè)氨基酸的單拷貝序列，30個(gè)氨基酸的三肽重復(fù)(ser-gly-gly or ser-val-ala)和20個(gè)氨基酸下游的單拷貝序列。含有瘧性插入片P31-1的重組DNA分子，已貯存在Doutsche Sammlung Von Microorganismen，Gottingen West Germany，并在那里鑒定為PF-13E.Coli 537(pPL31A-Pst(Pst)/X11-011)[DSM2890]和PF-14E.Coli，K12λ(pPL，31A-Pst(Pst)/1)[D SM-2891]。
以前，我們觀察到P31-1的重復(fù)“Ser-Gly-Gly”(見(jiàn)PCT申請(qǐng)WO85/03725)比單拷貝區(qū)域有更多的免疫原。然而我們又觀察到，在鄰近序列保持不變時(shí)，相同的重復(fù)序列不是都存在于每一個(gè)P31-1的分離物中。正如上面討論的那樣，已經(jīng)假設(shè)，當(dāng)寄生蟲(chóng)逃避寄主免疫系統(tǒng)進(jìn)攻時(shí)，所使用的含有多肽(包括可變的重復(fù)序列)的疫苗能夠引起抗寄生物的免疫應(yīng)答。因此，我們決定制備含有多肽(缺少那些重復(fù))的疫苗。
為此，我們首先制備了一系列結(jié)構(gòu)，它們十分準(zhǔn)確地缺少我們?cè)小?1-1”序列中的重復(fù)序列(圖1)。對(duì)于這些結(jié)構(gòu)，我們先用P31-1作為雜交探針篩選基因組瘧性庫(kù)，以克隆載體pUC9和E.Coli JM103制備，篩選出下列有關(guān)的DNA序列(a)質(zhì)粒31-1/2B中的cDNA，與31-1和31-1/3相比，已被反向合成，結(jié)果基因定向在反義方向上。這一質(zhì)粒在第一個(gè)PstⅠ位點(diǎn)之后有一個(gè)18G尾巴，在第二個(gè)PstⅠ位點(diǎn)之前有一個(gè)17C尾巴(圖2)。
(b)質(zhì)粒31-1/3，在第一個(gè)PstⅠ位點(diǎn)下游有一個(gè)23G尾巴，在第二個(gè)PstⅠ位點(diǎn)上游有一個(gè)17C尾巴(圖2)然后如圖2所示，我們使P31-1/3受到BglⅡ和PvuⅡ消化，分離出較長(zhǎng)的片段(3400bp)。我們使31-1/2B受到PvuⅡ和BamHⅠ消化，分離出較短的片段(670bp)。
現(xiàn)在參照?qǐng)D2，我們可以把31-1/2B質(zhì)粒的較短的PvuⅡ-BamHⅠ片段(670bp)連接到31-1/3質(zhì)粒的較長(zhǎng)的BglⅡ-PvuⅡ片段(3400bp)上，從而構(gòu)建質(zhì)?！?1-1較長(zhǎng)D”。在連接之前使取自31-1/2B的片段逆轉(zhuǎn)。生成的結(jié)構(gòu)包括全部的31-1基因;然而，帶有這種結(jié)構(gòu)根本不可能表達(dá)，因?yàn)樵谳d體的MS2序列和31-1基因的起始密碼子之間出現(xiàn)了終止密碼子(95bp，在HindⅢ位點(diǎn)之前)。從圖2可以看出，連接之后，刪去了BamHⅠ位點(diǎn)和BglⅡ位點(diǎn)如圖2所示，我們用Sau 3A消化這個(gè)“31-1較長(zhǎng)D”質(zhì)粒，分離出較短的片段(800bp)。通過(guò)這一消化，我們切除了所有含有終止密碼子的“31-1較長(zhǎng)D”的左部分，直到第一Sau3 A位點(diǎn)，也切除了在第三Sau 3A位點(diǎn)開(kāi)始的右部分。在利用BamHⅠ消化之后，我們用34C質(zhì)粒作為載體表達(dá)載體34C是pPLC24的衍生物[E.Remauf et al.，gene，15，pp.81-93(1981)]，并與表達(dá)載體P31a有關(guān)(在WO85/03725中被描述為pPL31A-Pst)。像pPL31A-Pst一樣，質(zhì)粒34C是從pPLC24衍生出來(lái)的(AD35連鎖子被引入到pPLC24上)。然而在給載體MS2部分編碼序列下游，34C沒(méi)有一個(gè)PstⅠ限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。由于在MS2編碼區(qū)的末端刪去四個(gè)堿基對(duì)，在AD35連鎖子的末端又刪去了27個(gè)堿基對(duì)，因此表達(dá)載體34C不同于pPL31A-Pst，(見(jiàn)圖5)。
然后，我們把克隆31-1較長(zhǎng)D的這一較短片段(-800bp)連接到質(zhì)粒34C(BamHⅠ消化后分離物)的較長(zhǎng)片段(-3400bp)上，可以構(gòu)建“質(zhì)粒31-1較長(zhǎng)缺失”。從圖2可以看出，這一插入片引起兩個(gè)BamHⅠ位點(diǎn)的消失。
然后如圖3所示，我們把下列三種片段(1)31.1整合重復(fù)缺失的150bp EcoRⅠ-HinfⅠ片段;(2)31.1較長(zhǎng)缺失的488bp HinfⅠ-BglⅡ片段和(3)31.1缺失G+C的3000bp BglⅡ-EcoRⅠ片段連接在一起，可以構(gòu)建質(zhì)?！?1-1重復(fù)缺失”。這一結(jié)構(gòu)(31-1重復(fù)缺失)類(lèi)似于質(zhì)粒31.1較長(zhǎng)缺失，但它缺失重復(fù)序列。
為了構(gòu)建31-1重復(fù)缺失，我們先把質(zhì)粒31-1較長(zhǎng)缺失用Hinf Ⅰ和BglⅡ消化，切除較小的片段(488bp)。
然后，我們從質(zhì)粒P31.1刪去80堿基，構(gòu)建“31.1整合重復(fù)缺失”，由此刪去了重復(fù)部分的序列Ser-Gly-Gly。我們把P31-1讓EcoRⅠ和BgeⅡ消化，并分離出較短的EcoRⅠ-BglⅡ片段刪去了80個(gè)堿基。我們用RsaⅠ消化那個(gè)片段，切去改變長(zhǎng)度的三個(gè)片段。第一和第三片段被退火，建造一種缺少重復(fù)抗原決定部位的片段EcoRⅠ-BglⅡ。通過(guò)刪去這個(gè)中心核苷酸片段(它含有為抗原的10個(gè)重復(fù)氨基酸序列的編碼序列)，我們建造了一個(gè)DNA序列來(lái)編碼無(wú)重復(fù)的較短蛋白(見(jiàn)圖4)。
我們把EcoRⅠ-BglⅡ片段插入到P31a，如上所述，表達(dá)載體P31a與P34C有關(guān)，它們都是pPLC24的衍生物。P31a的特征是在給載體的MS2部分編碼序列的下游，有一PstⅠ限制性位點(diǎn)，為了在載體啟動(dòng)子PL的控制下表達(dá)，在載體上又插入一個(gè)cDNA序列(圖5)。為了刪去終端核苷酸，我們用EcoRⅠ和HinfⅠ消化質(zhì)粒。
通過(guò)首先刪去圖1(P31-1)描述的DNA序列中G和C尾巴，從31-1克隆的31.1缺失G+C的衍生物中建造31-1重復(fù)缺失，然后得到我們需要的最后片段。利用特異位點(diǎn)的致突變，我們?cè)诤塑账?2-15，即在重復(fù)之前建造一個(gè)EcoRⅠ位點(diǎn)，并在重復(fù)之后，在282-287核苷酸處，建造一個(gè)BglⅡ位點(diǎn)。使用的寡核苷酸連鎖子是MAL BglⅡ GATTCAGATCTTAAATCTTMAL EcoRⅠ GGGGGGAATTCAAGAACTT最后，我們退火了這三種片段(31.1較長(zhǎng)缺失，31.1整合重復(fù)缺失，31.1缺失G+C)，構(gòu)建質(zhì)粒31-1重復(fù)缺失?！爸貜?fù)缺失”EcoRⅠ-Hinfl片段(150bp)與31.1較長(zhǎng)缺失片段(488bp)的HinfⅠ末端連接。然后，把這些片段插入到31.1缺失G+C的3000bp中。
我們將表達(dá)質(zhì)粒31-1重復(fù)缺失引入到E.coli K12中，測(cè)定修飾的瘧性抗原多肽的產(chǎn)量。我們利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)蛋白產(chǎn)量分析了每種發(fā)酵混合物總細(xì)胞等分試樣。并對(duì)染色凝膠(代表收集后所取等分試樣的瘧性蛋白產(chǎn)量，)部分進(jìn)行光密度掃描。掃描結(jié)果表明總蛋白量的10-15%是抗原。
在許多可藥用的組合物中都可采用本發(fā)明的免疫原來(lái)預(yù)防和治療原生動(dòng)物的寄生性感染。這些組合物可以包括各種可藥用的載體或佐劑，還包括一些增加免疫應(yīng)答的化合物。例如各種淋巴激活素和干擾素。這些混合物在預(yù)防和治療瘧原蟲(chóng)及其它原生動(dòng)物寄生感染方面是最有效的。
這些組合物可以被用在許多種可藥用的劑型中，也可以應(yīng)用在免疫技術(shù)方面著名的治療方法中。
按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，已舉例說(shuō)明了微生物和DNA序列在多肽生產(chǎn)中的應(yīng)用，所用的培養(yǎng)物已于1985年12月27日貯存在西德Gottingen的Deufsche Sammlung Von Microorganismen并在那里被鑒定為大腸桿菌K12(SG936 CI)(P31-1重復(fù)缺失)。已經(jīng)被指定登記號(hào)碼為D SM3618。
在此以前，我們?cè)e出許多本發(fā)明的實(shí)施例，很顯然，為了提供其它的采用本發(fā)明方法和組合物的實(shí)施例，我們的基本結(jié)構(gòu)是可以改變的。因此，應(yīng)該懂得本發(fā)明的范圍將受到權(quán)利要求
書(shū)的限定，而不受我們?cè)诖艘郧巴ㄟ^(guò)舉例的方式提供的具體實(shí)施例所限制。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)由具有足夠的免疫原性引起對(duì)靶原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)的免疫應(yīng)答的氨基酸序列組成的肽或多肽的方法，所述的寄生蟲(chóng)是以具有重復(fù)抗原決定部位的表面抗原為特征，所述的氨基酸序列是從由上述寄生蟲(chóng)表面抗原序列組成的序列中篩選出來(lái)的，它靠近那種抗原的重復(fù)抗原決定部位的一端，上述寄生蟲(chóng)的表面抗原序列靠近于那種抗原的重復(fù)抗原決定部位的另一端，抗原決定部位是這些序列中的任一片段并聯(lián)合某一鄰近的序列與片斷，所述的方法包括培養(yǎng)用重組DNA分子轉(zhuǎn)化的微生物寄主，重組DNA分子中含有編碼原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)的類(lèi)抗原肽或多肽的DNA序列，上述的DNA序列是以大部或全部缺少編碼重復(fù)抗原決定部位序列為特征。重復(fù)決定部位表示靶寄生蟲(chóng)抗原的特征。
2.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中的序列包含有靠近重復(fù)抗原決定部位兩端的序列，重復(fù)抗原決定部位表示靶原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)表面抗原的特征。
3.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中寄生蟲(chóng)表面抗原是瘧疾抗原。
4.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中的寄主是從一組寄主中挑選出來(lái)的，這組寄主包括E.coli.K12，E.coli SG936;E.coli SG935，E.coli.SG928，E.coli SG927和其它的大腸桿菌菌株。這些其它的菌株是lon的突變種，并以生產(chǎn)低水平的lon蛋白酶為特征。
專(zhuān)利摘要
一種可以用作疫苗和藥劑來(lái)預(yù)防和治療原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)感染的組合物。此種感染是以寄生蟲(chóng)的表面抗原中含有一系列重復(fù)氨基酸，叫作重復(fù)抗原決定部位為顯著特征的。該組合物的成份包含有在免疫學(xué)上有效劑量的肽或多肽，此種肽或多肽的顯著特征是大部或全部缺少重復(fù)抗原決定部位。這些組合物在免疫預(yù)防和治療原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)感染的方法中是有用的。
文檔編號(hào)A61K39/00GK87104399SQ87104399
公開(kāi)日1988年8月31日 申請(qǐng)日期1987年6月25日
發(fā)明者阿蘭·肖, 耶夫斯·漢伯特 申請(qǐng)人:柏林魏克股份公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan