專利名稱：農(nóng)藥和抗寄生蟲組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明包括若干農(nóng)藥和抗寄生蟲類協(xié)同組合物，用于防治寄生的植物線蟲和動物線蟲、一些病害(真菌的和細(xì)菌的)和防治寄生的吸蟲(肝片吸蟲)。
現(xiàn)有技術(shù)
線蟲是引起世界范圍內(nèi)熱帶、亞熱帶和溫帶農(nóng)業(yè)地最嚴(yán)重?fù)p失的罪魁禍?zhǔn)?Nickle W.R.(編輯).1991.Manual of AgriculturalNematology，Marcel Dekker，Inc.，紐約，N.Y.出版，第1035頁)。僅大蕉世界產(chǎn)量就有大約20％線蟲相關(guān)的損失，相當(dāng)于每年178百萬美元(Sasser J.N.和Freckman D.W.1987.A Worldperspective on nematologythe role of the Society.Vistason nematologya commemoration of the twenty-fifthanniversary of the Society of Nematologists/由Joseph A.Veech和Donald W.Dickson編輯，第7-14頁)。大蕉和香蕉種植受相似穿孔線蟲的顯著影響。
根結(jié)屬是最重要的植物醫(yī)生線蟲，因?yàn)槠浠钚砸饹Q大多數(shù)熱帶地區(qū)的作物11-25％的損失(Sasser J.N.1979.Root-knotnematodes.F.Lamberti & C.E.Taylor編輯，Academic Press，倫敦，第359頁)。因此特別需要防治過去能對抗化學(xué)殺線蟲劑的那些寄生蟲。這種化合物是非常有效的；然而其中許多對環(huán)境造成嚴(yán)重威脅。有時控制管理機(jī)構(gòu)限制這種化合物的用量和/或使用次數(shù)，從而損害了其殺線蟲效力。
線蟲防治仍不足。每天使用化學(xué)殺線蟲劑越來越受到限制，因?yàn)槠溆懈叨拘郧易饔脧V泛的化合物。因此努力嘗試確定能消除線蟲引起的損傷的有效方式，并且該方式有利于減少化學(xué)農(nóng)藥的使用。其中一種方法是使用具有特定的作用模式和較安全的毒理學(xué)特性的生物農(nóng)藥代替化學(xué)殺線蟲劑?？晒┻x擇的殺線蟲劑中包括ABG-9008，疣孢漆斑菌真菌代謝物和阿維菌素(或相關(guān)化合物，如milbecines)與脂肪酸的組合物(Abercrombie K.D.1994，Synergistic pesticidalcompositions。專利US5346698.Mycogen Corporation.9月13日)。同樣，一種包括向需要處理的地點(diǎn)、土壤或種子同時使用a)疣孢漆斑菌真菌代謝物和b)化學(xué)農(nóng)藥以及在這種情況下有效的協(xié)同殺線蟲組合物以消除線蟲引起的植物損害的的方法要求專利保護(hù)(Warrior P.，Heiman D.F.和Rehberger Linda A.1996.Synergistic nematocidal compositions.Abbott laboratories.WO9634529，1996-11-07)。
另一種方法是將線蟲寄生細(xì)菌侵入巴斯德氏芽菌的孢子與有機(jī)磷化的殺線蟲劑(Nordmeyer D.1987.Synergistic nematocidalcompositions of Pasteuria penetrans spores and anorganophosphorus nematocide.1987.CIBA-GEIGY AG專利AU06057386A1.01/29/1987)結(jié)合。
然而，工業(yè)規(guī)模制備侵入巴斯德氏芽菌孢子面臨著該生物是一種專性寄生菌的問題；因此其必須在原位線蟲內(nèi)生長，從線蟲感染的根水解液中分離。
與線蟲共享生境的分解幾丁質(zhì)(chitinolytic)的真菌和細(xì)菌可能具有某種生物平衡，以某種方式限制線蟲繁殖。兩株分解幾丁質(zhì)細(xì)菌(Toda T.和Matsuda H.1993.Antibacterial，anti-nematodeand/or plant-cell activating composition，and chitinolyticmicroorganism for producing the same.Toda BiosystemLaboratory，日本。專利US5208159，05/04/1993)已要求作為抗細(xì)菌、抗線蟲和/或植物細(xì)胞活化組合物得到保護(hù)。
有一些對線蟲有分解幾丁質(zhì)作用的實(shí)例。其中最重要的是已公開的新細(xì)菌菌株(Suslow T.and Jones D.G.1994.NovelChitinase-producing bacteria and plants.DNA PlantTechnology Corporation，US04940840，07/10/1990)，所述菌株是通過引入編碼生產(chǎn)幾丁酶的DNA而形成的，幾丁酶是能降解真菌和線蟲內(nèi)的幾丁質(zhì)的酶。這些菌株可用于產(chǎn)生幾丁酶以抑制植物病原體。因引入編碼生產(chǎn)幾丁酶的DNA而對病原體有抗性的新植物也已有描述。
能減少在自然條件下侵襲植物的線蟲群體的微生物的其他實(shí)例已有描述。
Rodriguez-Kabana等(Rodriguez-Kabana R.，Jordan J.W.，Hollis J.P.1965.NematodesBiological control in ricefields-role of hydrogen sulfide.Science.148524-26)；Hollis和Rodriguez-Kabana(Hollis，J.P.，y R.Rodríguez-Kábana.1966.Rapid kill of nematodes in flooded soil.Phytopathology 56，第1015-19頁)觀察到在細(xì)菌脫硫脫硫弧菌、硫化氫的產(chǎn)生和植物寄生性線蟲間的對應(yīng)關(guān)系，后者種群在路易斯安那的稻栽培中減少。正如某些土壤細(xì)菌產(chǎn)生的其他代謝物，硫化物是需氧生物的電子傳遞呼吸過程的抑制劑(Rodríguez-Kábana，R.1991.Control biológico de nematodos parásitos de plantas.NEMATROPICA，21(1)，第111-22頁)。
PAECILTM，也稱為BIOACT或Nemachek，是一種生物殺線蟲劑，其含有Paecilomyces lilacinus專利菌株的干且穩(wěn)定的孢子懸浮液，用于土壤和種子處理。此真菌品種通常在世界范圍的土壤中都能發(fā)現(xiàn)。用作PAECILTM活性成分的專利菌株對植物寄生性線蟲特別有效。最初在菲律賓大學(xué)分離出來，并且已被澳大利亞的Macquarie大學(xué)開發(fā)。此外，已被廣泛地測試用于防治侵襲澳大利亞、菲律賓、南非和其他國家的主要作物的幾種線蟲。PAECILTM制劑是市場上可買到的農(nóng)藥，在菲律賓注冊名為BIOACTR；在南非名為PL PLUS；和在印度尼西亞名為PAECILTM。目前，Australian NationalRegistration Authority正在為該產(chǎn)品作為農(nóng)藥進(jìn)行評估(Holland，R.PAECILTM.1998.http//WWW.ticorp.com.au/articlel.htm)。
上述實(shí)例不能解決所有的寄生蠕蟲問題。因此，實(shí)施改良方法代替化學(xué)農(nóng)藥和抗寄生產(chǎn)品進(jìn)行寄生物防治的需要仍然存在。
吸蟲給畜牧業(yè)和人體健康的造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。隔離區(qū)域內(nèi)物種的多樣性、較溫和的致病性和特有分布似乎是導(dǎo)致缺乏吸蟲知識的要素。概括地說，腸內(nèi)吸蟲是人畜共患的(zoonotic)并且在各物種中有大量儲存寄主。
從經(jīng)濟(jì)上來說，最重要的吸蟲之一是肝片吸蟲，這是第一種已知的寄生吸蟲；棲居于膽汁導(dǎo)管影響人健康。其卵是腸蟲中最大的卵圓形有囊蓋的卵之一，導(dǎo)致胃disepsia的消化不良、結(jié)腸自動不良、肝臟和膽囊疼痛、發(fā)燒和肝絞痛。其他癥狀包括在肺、眼、腦、肝靜脈和其他組織形成囊狀(Saleha A.1991.Liver flukedisease(fasciolosis)epidemiology，economic impact andpublic health significance.Southeast Asian J.Trop.Med.Public health 22 supp 1dic.P361-4)。
動物蠕蟲已稱為對綿羊和牛來說對重要的害蟲。驅(qū)蠕蟲劑抗性是廣泛存在的，尤其是在小型反芻動物寄生線蟲種群中。
現(xiàn)已開發(fā)出新的輔助技術(shù)，其他的仍在研究。真菌Duddingtoniaflagrans是生物鏈中的捕食者，產(chǎn)生厚壁靜止孢子clamidospores能在牛、馬、羊和豬的腸道內(nèi)存活(Larsen M.1999.Biologicalcontrol of helminths.Int J Parasitol.Jan；29(1)139-46，和Larsen，M.2000.Prospects for controlling animalparasitic nematodes by predacious micro fungi.Parasitology，120，S120-S121)。
在丹麥、法國、澳大利亞、美國和墨西哥對D.flagrans的研究已證實(shí)此真菌具有用于生物防治的極大潛力。
象許多其他重要的綿羊生產(chǎn)國一樣，在驅(qū)蠕蟲劑抗性，尤其是在綿羊和山羊的腸胃線蟲的驅(qū)蠕蟲劑抗性方面，南非面臨著嚴(yán)重的危機(jī)。重要的寄生性蠕蟲都有這種現(xiàn)象；然而，這引發(fā)了關(guān)于皺胃吸血寄生蟲Haemonchus contortus的特殊問題。研究指出來自南非最重要的綿羊產(chǎn)區(qū)的此寄生蟲系的超過90％對南非市場上可買到的驅(qū)蠕蟲劑中的四分之三顯示不同程度的抗藥性。甚至在Northern Province的普通牧區(qū)，于1993年進(jìn)行研究的五個畜群中也發(fā)現(xiàn)這種情況(vanWyk J.A.，Bath G.F.和Malan F.S.2000.The need foralternative methods to control nematode parasites ofruminant livestock in South Africa. World Animal Review.http//www.fao.org/ag/AGA/AGAP/FRG/FEEDback/War/contents.htm)。
由于其他地區(qū)也經(jīng)歷同樣情況，抗藥性增加已日益嚴(yán)重。現(xiàn)已在四個拉丁美洲國家進(jìn)行了一系列驅(qū)蠕蟲劑研究阿根廷(Eddi，C.，Caracostantogolo，J.，Peya，M.，Schapiro，J.，Marangunich，L.，Waller，P.J. & Hansen，J.W.1996.The prevalence ofanthelmintic resistance in nematode parasites of sheep insouthern Latin AmericaArgentina.Vet.Parasitol.，62189-197)；比利時(Echevarria F.，Borba M.F.S.，Pinheiro A.C.，Waller P.J.& Hansen J.W.1996.The prevalence ofanthelmintic resistance in nematode parasites of sheep insouthern Latin AmericaBrazil.Vet.Parasitol.，62199-206)；巴拉圭(Maciel S.，Giminez A.M.，Gaona，C.，Waller，P.J.& Hansen，J.W.1996.The prevalence of anthelminticresistance in nematode parasites of sheep in southern LatinAmericaParaguay.Vet.Parasitol.，62207-212)；和烏拉圭(Nari A.，Salles J.，Gil A.，Waller，P.J.& Hansen，J.W.1996.The prevalence of anthelmintic resistance in nematodeparasites of sheep in southern Latin AmericaUruguay.Vet.Parasitol.，62213-222)。
給牛造成最嚴(yán)重?fù)p害的線蟲之一是Dictyocaulus viviparous，這種寄生蟲達(dá)到性成熟，并在成熟后寄生在牛的肺中，尤其是幼畜的肺中。所引起的病被稱為蠕蟲性支氣管炎或牛網(wǎng)尾線蟲病(Dictyocaulosis)，并且在攝取了存在于牧草中的3或感染幼蟲后產(chǎn)生感染。治療需要驅(qū)蠕蟲劑(Borgsteede F.H.M.，de Leeuw W.A.& Burg W.P.J.1988.A Comparison of the efficacy of fourdifferent long-acting boluses to prevent infections withDictyocaulus viviparus in calves.The Veterinary Quarterly，Vol 10，No.3)，但成功的代價是對藥物產(chǎn)生抗性的新品種，這使其他感染動物的治療更困難。這些產(chǎn)品的高價格是限制有大量資源的國家使用的因素，并且使用這些制劑會產(chǎn)生有害的生態(tài)影響。
雖然化學(xué)療法仍然是寄生蟲防治的基礎(chǔ)，但似乎在至少下一個10年即將出現(xiàn)任何新的不涉及化學(xué)方法的驅(qū)蠕蟲劑的希望很小，這一事實(shí)使驅(qū)蠕蟲劑抗性的世界難題更復(fù)雜(Soll，M.D.1997.Thefuture of anthelmintic therapy from an industry perspective.In J.A.van Wyk & P.C.van Schalkwyk，eds.Managinganthelmintic resistance in endoparasites，p.1-5.Proceedings of the 16th International Conference of theWorld Association for the Advancement of VeterinaryParasitology，Sun City，南非，1997年8月10-15日)。
就細(xì)菌和致病性真菌來說，有關(guān)于生物制劑的全面報(bào)道，其作用主要基于拮抗作用并且在市場上可買到大量產(chǎn)品。其中一些是Conquer(拮抗托拉氏假單胞菌的熒光假單胞菌)，Galltrol-A(放射性土壤桿菌，能防治根癌土壤桿菌)，Bio-Fungus(木霉屬，防治下列真菌疫霉屬、茄屬絲核菌、腐霉屬、鐮孢屬、輪枝孢屬)，Aspire(Candida oleophila 1-182，能防治葡萄孢屬和青霉屬)等。
最廣譜活性的生物殺真菌劑之一是木霉屬(Chet I，Inbar J.1994 Biological control of fungal pathogens.Appl BiochemBiotechnol；48(1)37-43)，該真菌的作用機(jī)制被廣泛地討論過，能降解宿主真菌細(xì)胞壁的幾丁酶參與其中。而且，有來自用作真菌病害生物調(diào)節(jié)劑的真菌和細(xì)菌的分解幾丁質(zhì)作用的實(shí)驗(yàn)證據(jù)(Herrera-Estrella A，Chet I.1999.Chitinase in biological control.EXS；87171-84)。然而，這并非細(xì)菌作用于植物致病性真菌的唯一模式；還有基于產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物如氰化氫的其他防治方式，氰化氫能抑制根病原菌(Blumer C.And Haas D.2000.Mechanism，regulation，and ecological role of bacterial cyanidebiosynthesis.Arch Microbiol Mar；173(3)170-7)，特別是熒光假單胞菌CHAO菌株。
細(xì)菌-細(xì)菌相互作用的分析顯示有三種主要類型抗生作用、底物競爭和寄生關(guān)系。就抗生作用來說，已知有一些細(xì)菌菌株能釋放抗生素以便抑制周圍細(xì)菌的活性，這可用于生物防治致病菌。同樣，由于生物調(diào)節(jié)生物能合成含鐵細(xì)胞微量元素quelant劑，這會導(dǎo)致基質(zhì)中微量元素主要是鐵缺乏，從而抑制相應(yīng)的病原生長，因此底物競爭是也可用于實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)纳锟刂频臋C(jī)制(Ongena M.1998.Conference on biological controLs.Training program in thearea of biotechnology applied to agriculture andbioindustry.Gembloux，Belgium)。
發(fā)明公開
本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物含來源于微生物或化合物的至少一種分解幾丁質(zhì)劑或分解幾丁質(zhì)活性誘導(dǎo)劑，和硫化物或硫化物產(chǎn)生劑，其中的來源于微生物或化合物的分解幾丁質(zhì)劑或分解幾丁質(zhì)活性誘導(dǎo)劑和硫化物或硫化物產(chǎn)生劑以遠(yuǎn)低于每種成分單獨(dú)使用獲得對蠕蟲和細(xì)菌和真菌病害的病原體的有效控制時的用量同時施用。
本發(fā)明還涉及不同來源如生物制品和化學(xué)制品的所述組合物的使用和/或所述化合物的同時給藥以有效控制廣譜植物寄生性線蟲(根結(jié)線蟲屬、粒線蟲屬、莖線蟲屬、短體線蟲屬、棘皮線蟲屬、真滑刃線蟲屬、穿孔線蟲屬、劍線蟲屬、盤旋線蟲屬)、動物寄生線蟲和吸蟲(Haemonchus屬、毛圓線蟲屬、網(wǎng)尾線蟲屬和肝片吸蟲)、細(xì)菌致病菌(菊歐文氏桿菌、莢殼伯克霍爾德氏菌)和真菌致病菌(掌狀盤多毛孢、Alternaria tabacina、Sarocladium orizae)。
分解幾丁質(zhì)劑或分解幾丁質(zhì)活性誘導(dǎo)劑和硫化物或硫化物產(chǎn)生劑對蠕蟲、細(xì)菌和真菌的作用早已被論證或報(bào)道過。然而，在本研究中，第一次證明了當(dāng)兩種成分同時施用時有協(xié)同作用。
當(dāng)分解幾丁質(zhì)劑或分解幾丁質(zhì)活性誘導(dǎo)劑和硫化物或硫化物產(chǎn)生劑分別施用時，效果總是低于將兩種試劑同時施用時。
當(dāng)作為本發(fā)明的組合物施用時，分解幾丁質(zhì)劑或分解幾丁質(zhì)活性誘導(dǎo)劑和硫化物或硫化物產(chǎn)生劑可以適當(dāng)?shù)鼗旌铣扇芤?、懸浮液、乳液、粉或顆?；旌衔铮⒆鳛榉柿?、預(yù)填充土壤、包覆種子裝置、粉劑、顆粒劑、噴霧劑(nebulizer)、懸浮液、液體或任何已知的膠囊形式施用到植物或土壤以防治寄生性蠕蟲和細(xì)菌及真菌病害。
具體對線蟲、吸蟲、細(xì)菌或真菌來說；和對于特殊情況來說，分解幾丁質(zhì)劑或分解幾丁質(zhì)活性誘導(dǎo)劑和硫化物或硫化物產(chǎn)生劑的最佳施用范圍是通過體外、溫室或田間條件下的實(shí)驗(yàn)確定。
根據(jù)本發(fā)明所述結(jié)果，使用下述混合物能實(shí)現(xiàn)對蠕蟲、細(xì)菌和真菌的顯著控制，所述混合物為1)每克組合物107菌落形成單位(CFU)-1012CFU的特定的產(chǎn)幾丁酶的微生物或占組合物1-50％的幾丁質(zhì)；和2)每克組合物107菌落形成單位(CFU)-1012CFU的特定的產(chǎn)硫化物微生物或任何產(chǎn)生硫化物的化學(xué)制劑，其中硫化物量在每克組合物1.0mg/分鐘變化。
每克組合物含107CFU-1012CFU的能同時產(chǎn)生分解幾丁質(zhì)劑和硫化物的微生物的任何組合物適于防治蠕蟲、細(xì)菌和真菌。上述組合物包含上述比例的下列試劑的組合
1.幾丁酶和Na2S。
2.幾丁酶和FeS。
3.幾丁酶和微生物脫硫脫硫弧菌。
4.幾丁酶和Na2S。
5.幾丁酶和FeS。
6.幾丁質(zhì)和微生物脫硫脫硫弧菌。
7.同時產(chǎn)生分解幾丁質(zhì)活性和H2S的微生物。
上述組合物對多種植物寄生線蟲有效，其中包括但不限于根結(jié)線蟲屬如南方根結(jié)線蟲；粒線蟲屬如小麥粒線蟲；莖線蟲屬如起絨草莖線蟲；短體線蟲屬如咖啡短體線蟲；棘皮線蟲屬如大豆胞囊線蟲；真滑刃線蟲屬如燕麥真滑刃線蟲；穿孔線蟲屬如香蕉穿孔線蟲；劍線蟲屬如標(biāo)準(zhǔn)劍線蟲；盤旋線蟲屬如R.reniformis；動物線蟲如血矛線蟲屬、毛圓線蟲屬、Ostertagia屬、細(xì)頸線蟲屬、古柏線蟲屬、蛔蟲屬、仰口線蟲屬、結(jié)節(jié)線蟲屬、Chabertia屬、鞭蟲屬、Strongylus屬、毛線線蟲屬、網(wǎng)尾線蟲屬、毛細(xì)線蟲屬、異剌線蟲屬、弓蛔蟲屬、雞蛔蟲屬、尖尾線蟲屬、鉤口線蟲屬、鉤蟲屬、弓蛔線蟲屬和副蛔蟲屬；吸蟲類如肝片吸蟲；植物致病性細(xì)菌如菊歐文氏桿菌、莢殼伯克霍爾德氏菌和植物致病性真菌如掌狀盤多毛孢、Alternaria tabacina和Sarocladium orizae。
實(shí)施例
實(shí)施例1體外評價化學(xué)來源的硫化氫和分解幾丁質(zhì)酶的殺線蟲效果
使用動物線蟲血矛線蟲屬和蛇形毛圓線蟲和Dictyocaulusviviparus的卵以及寄生植物線蟲南方根結(jié)線蟲幼蟲(2期幼體)。
血矛線蟲屬和蛇形毛圓線蟲分別采自綿羊和牛皺胃。在生理溶液中清洗成年雌性線蟲并用0.5％“Hibitane”(醋酸洗必太)處理1分鐘，整個過程在37℃進(jìn)行。將大約100個已消毒個體引入含50ml已在無菌蒸餾水中稀釋10倍的LB培養(yǎng)基溶液的錐形燒瓶中，令其產(chǎn)卵過夜(8-10小時)。
從預(yù)先貢獻(xiàn)出的牛的肺中采集D.Viviparous線蟲。對血矛線蟲屬和蛇形毛圓線蟲采用相同的方法；但雌蟲產(chǎn)卵2-3小時。
從此時開始，在無菌條件下在垂直層流中進(jìn)行操作，使用24孔組織培養(yǎng)平板。將含雌蟲和卵的整個培養(yǎng)基用60μm篩網(wǎng)過濾。線蟲的卵被30μm的第二篩網(wǎng)捕獲。將其引入0.5％醋酸洗必太溶液中處理3分鐘，接著用在無菌蒸餾水中稀釋10倍的LB培養(yǎng)基洗三次。
消毒后，將卵從篩網(wǎng)上取下并小心地重新懸浮于無菌蒸餾水稀釋10倍的LB培養(yǎng)基溶液。用倒置Olympus顯微鏡計(jì)數(shù)和記錄每個孔中的卵來檢查最終的分布結(jié)果，還要觀察此階段的發(fā)育狀態(tài)的一致性。
將血矛線蟲屬和T.colubriformis卵在28℃孵育24-48小時，而D.viviparus的卵孵育時間少于24小時。當(dāng)在上述時間內(nèi)每個品種的所有未處理對照中超過60％出現(xiàn)孵化，就制備出了良好的樣本。
從已感染并在溫室中培養(yǎng)的南瓜根(Cucurbita pepo)中采集南方根結(jié)線蟲卵塊。為進(jìn)行此操作，使用立體顯微鏡和不同針尖的針。將卵塊放在28℃培替氏培養(yǎng)皿中的無菌蒸餾水中，每個培養(yǎng)皿放50個卵塊。每天觀察以檢查卵的孵化情況。在大約72小時內(nèi)，有足夠的幼蟲可以開始采集和消毒。
全部將含卵塊和幼蟲的水用60μm的篩網(wǎng)過濾。從此時開始，在無菌條件下在垂直層流中進(jìn)行操作，使用24孔組織培養(yǎng)平板。從卵塊中分離的卵不能孵化并留在30μm篩網(wǎng)上；再用5μm篩網(wǎng)收集幼蟲。將其引入0.5％醋酸洗必太溶液中處理3分鐘，接著用在無菌蒸餾水中稀釋10倍的LB培養(yǎng)基洗三次。消毒后，將南方根結(jié)線蟲的幼蟲從篩網(wǎng)上取下并小心地重新懸浮于無菌蒸餾水稀釋10倍的LB培養(yǎng)基溶液。用反相Olympus顯微鏡計(jì)數(shù)和記錄活的幼蟲來檢查最終的收集和消毒結(jié)果。
將大約100個線蟲的卵和幼蟲放在大約2ml稀釋10倍的LB培養(yǎng)基中。通過安全閥的空氣體積應(yīng)能使空氣能穿過液體并因此使氣體與卵和幼蟲接觸。每個處理的閥門是相同的。
兩種硫化物鹽(Na2S和FeS)與鹽酸的反應(yīng)和細(xì)菌脫硫脫硫弧菌脫硫亞種ATCC 27774(從綿羊瘤胃種分離出)的厭氧發(fā)酵中可觀察到硫化氫。所用的分解幾丁質(zhì)酶是來源于細(xì)菌粘質(zhì)沙雷氏菌的幾丁酶SIGMA C 1650。
將所研究的線蟲的卵和幼蟲進(jìn)行下列處理24小時
1.對照處理不加幾丁酶，空氣通過閥門循環(huán)。
2.幾丁酶處理每個重復(fù)0.2單位幾丁酶。
3.硫化物處理產(chǎn)自Na2S的硫化氫，0.2通量0.3mg/分鐘。
4.硫化物處理產(chǎn)自FeS的硫化氫，0.2通量0.3mg/分鐘。
5.硫化物處理產(chǎn)自脫硫脫硫弧菌的硫化氫，0.2通量0.3mg/分鐘。
6.組合處理同時施用處理2和3。
7.組合處理同時施用處理2和4。
8.組合處理同時施用處理2和5。
所有上述處理有4個重復(fù)。
開始實(shí)驗(yàn)后24小時，計(jì)數(shù)所有處理中新出現(xiàn)的幼蟲(血矛線蟲屬和蛇形毛圓線蟲和D.viviparous)和活幼蟲(南方根結(jié)線蟲)的數(shù)目。效果(E)示于表1。此數(shù)值是每個處理的4次重復(fù)的平均值。對于每種線蟲觀察結(jié)果分別進(jìn)行方差分析(ANOVA)；進(jìn)行鄧肯最新多重差距檢定(Lerch G.1977.La Experimentación en las cienciasbiológicas y agrícolas.1ra edición，p.p.203-308，EditorialCientífico-Técnica，La Habana)，其結(jié)果也示于表1。同樣的字母表示處理間無顯著差異(p＜0.05)。
表1處理效果(E)*
就本實(shí)施例來說，*效果(E)是1減去孵化出的或活的幼蟲的有效比率的值。Fr是每個處理中新出現(xiàn)的或活的幼蟲數(shù)(Ntto)與處理1中新出現(xiàn)或活的幼蟲數(shù)(Nc)的比值
E＝1-Fr，其中Fr＝Ntto-Nc；因此E＝1-Ntto/Nc
為測定處理6、7和8中的協(xié)同作用，假定不排除其中存在的相互作用。
對于此類型分析來說，預(yù)期效果(EE)必定等于單個效果(EI)的總和減去交叉效果(ei)，EI是由幾丁酶作用產(chǎn)生的效果(Eq)和硫化氫作用產(chǎn)生的效果(Esn、Esf和Esd)而得到的(Sigarroa，A.1985.Biometría y dise
o experimental.1ra.Parte.Minist.Educatión Sup.Ed.Pueblo y Educación.Cap.3.pag 69-107)。
EE＝Eq+Es-ei，其中ei＝Eq×Es
如果在兩種殺線蟲劑組合(處理6、7、8)的處理中的實(shí)驗(yàn)效果(E)大于那些處理的預(yù)期效果(EE)，則可確信當(dāng)在同一處理中同時施用時，就分解幾丁質(zhì)劑(幾丁酶)和硫化氫的殺線蟲活性來說存在協(xié)同作用。獲得的結(jié)果概述于表2。
表2.實(shí)驗(yàn)效果(E)和預(yù)期效果(EE)
在同時結(jié)合幾丁酶和硫化氫的三種處理中，對所研究的四種線蟲的實(shí)驗(yàn)效果(E)大于預(yù)期效果(EE)，這令人滿意地證明了就其殺線蟲活性來說，在這兩種化合物間存在協(xié)同作用(當(dāng)其同時作用時)。至于硫化物的來源及其殺線蟲效果未觀察到顯著差異(表1)。
實(shí)施例2溫室評價分解幾丁質(zhì)活性誘導(dǎo)劑(幾丁質(zhì))和硫化氫產(chǎn)生劑(從土壤中分離出的脫硫脫硫弧菌脫硫亞種ATCC 29577)的殺線蟲效果
選擇中性pH的棕壤干燥并用0.5cm網(wǎng)過篩以除去不想要的顆粒。在立式加壓釜內(nèi)120℃和1個大氣壓下消毒1小時(SambrookJ.，F(xiàn)ritsch E.F.and Maniatis T.1989.Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd.Ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA)。在室溫下干燥3-4天以便稍后與河砂、蚯蚓腐殖土和幾丁質(zhì)處理上述混合物(ICN編號101334)。
用下列處理中設(shè)定的比例組成裝滿20個罐子(直徑15cm×深13cm，容積1升)
1.對照處理土壤70％、河砂25％和腐殖土5％
2.幾丁質(zhì)處理土壤70％、河砂25％、腐殖土4％和幾丁質(zhì)1％。
3.微生物處理土壤70％、河砂25％、腐殖土5％和脫硫脫硫弧菌，該微生物的濃度為1010CFU/罐。
4.組合處理土壤70％、河砂25％、腐殖土4％、幾丁質(zhì)1％和濃度為1010CFU/罐的脫硫脫硫弧菌。
每個處理重復(fù)5次(罐)。
在處理2和4中，按4∶1比例制備腐殖質(zhì)和幾丁質(zhì)的預(yù)混物，接著與土壤和沙子一起形成最終的混合物。在處理3和4中，將脫硫脫硫弧菌與每罐100ml去離子水一起施用。在第一次灌水過程中均勻地施用這些體積的水。
所有的處理中，將500個預(yù)先從自然感染的香蕉根中采集的香蕉穿孔線蟲樣本在罐中培植。使用離心-浮選技術(shù)(Jenkins，W.R.1964.A rapid centrifugal-flotation technique forseparation nematodes from soil.Plant Disease Reporter，48692)；樣本在5ml蒸餾水中稀釋并被均勻地施用到土表下深5cm處。
將罐子放置在溫室中并在施加處理和接種線蟲后仍保留3天。在此期間每天澆水以保持良好的濕度條件。在處理的第四天之前，將通過體外組織培養(yǎng)獲得的香蕉品種Cavendish移植到罐中。從此時開始，進(jìn)行嚴(yán)格的灌溉管理，令土壤濕度始終保持在其土壤容水量。
實(shí)驗(yàn)開始三個月后進(jìn)行最終評價，將植物的根從土壤中小心地取出。然后使用離心-浮選技術(shù)(Jenkins，W.R.1964.A rapidcentrifugal-flotation technique for separation nematodesfrom soil.Plant Disease Reporter，48692)和倒置顯微鏡計(jì)數(shù)，記錄從植物中收集到的樣本(幼蟲和成蟲)和活線蟲的數(shù)目。不同處理的效果示于表3。這是每種處理的5次重復(fù)的平均值。對于獲得的結(jié)果進(jìn)行方差分析(ANOVA)，接著進(jìn)行鄧肯最新多重差距檢定(Lerch G.1977.La Experimentación en las cienciasbiológicas y agrícolas.1ra edición，p.p.203-308，EditorialCientifico-Técnica，La Habana)，其結(jié)果示于表3。同樣的字母表示處理間無顯著差異(p＜0.05)。
表3.處理效果(E)*
*效果(E)是1減去活樣本的相對頻數(shù)值的結(jié)果。Fr是每個處理中活樣本數(shù)(Ntto)與處理1中活樣本數(shù)(Nc)的比值
E＝1-Fr，其中Fr＝Ntto-Nc，因此E＝1-Ntto/Nc。
為確定處理4中可能的協(xié)同作用，假定不排除存在的相互作用(殺線蟲作用)。
象實(shí)施例1一樣，預(yù)期效果(EE)必定等于單個效果(EI)的總和減去兩個處理間的交叉效果(ei)(Sigarroa，A.1985.Biometría ydise
o experimental.1ra.Parte.Minist.Educación Sup.Ed.Pueblo y Educación.Cap.3.pag 69-107)，EI是由作為土壤和腐殖土中存在的微生物的分解幾丁質(zhì)活性的誘導(dǎo)劑的幾丁質(zhì)作用產(chǎn)生的效果(Eq)和產(chǎn)自脫硫脫硫弧菌的硫化氫作用產(chǎn)生的效果(Esd)而得到的。
EE＝Eq+Es-ei，其中ei＝Eq×Es
如果在結(jié)合兩種殺線蟲劑的處理4中的實(shí)驗(yàn)效果(E)大于預(yù)期效果(EE)，則可確信當(dāng)在同一處理中同時施用時，分解幾丁質(zhì)活性誘導(dǎo)劑(幾丁質(zhì))和硫化氫(產(chǎn)自脫硫脫硫弧菌)間存在協(xié)同作用。獲得的結(jié)果概述于表4。
表4實(shí)驗(yàn)效果(E)和預(yù)期效果(EE)
在處理4中，結(jié)合了分解幾丁質(zhì)活性誘導(dǎo)劑(幾丁質(zhì))和生物來源的硫化氫(脫硫脫硫弧菌)。在這種情況下，實(shí)驗(yàn)效果(E)大于預(yù)期效果(EE)，因此證明當(dāng)將這兩種化合物同時施用到土壤時它們之間存在協(xié)同作用(就其殺線蟲活性而論)。
實(shí)施例3論證細(xì)菌微代謝棒狀桿菌C-924和微代謝冢村氏菌DSM 20162的分解幾丁質(zhì)活性和產(chǎn)生硫化物
硫化物產(chǎn)生測定
用100ml集氣試管，從菌株C-924和DSM 20162的5L生物反應(yīng)器的發(fā)酵氣流中采樣。整個培養(yǎng)時間是24小時。在第16小時時首次檢測到形成硫化氫。
樣本以類似于產(chǎn)生的H2S模式的方式處理。在Varian氣譜中進(jìn)行分析，條件如下
■帶對含硫化合物敏感的過濾器的火焰光度檢測器
■硫化氫模式43.2ng/ml，重復(fù)
■樣本每次取樣重復(fù)兩次。
■注入1ml或μl液上氣體。
■柱DB-5(15m×0.53mm)。
■溫度35℃
■載體氮?dú)猓?.5ml/分鐘。
■檢測器FPD-S
■吹掃氣氮?dú)?0ml/分鐘。
表5顯示兩個菌株在不同時間進(jìn)行的硫化物氣體分析的概況。
表5.硫化物氣體分析
兩種菌株都產(chǎn)生硫化物，但C-924產(chǎn)生的流量高于菌株DSM20162。
分解幾丁質(zhì)活性測定
使用微代謝棒狀桿菌C-924、微代謝冢村氏菌DSM 20162、粘質(zhì)沙雷氏菌ATCC 13880和大腸桿菌ATCC 25922菌株。
在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行上述菌株的細(xì)菌培養(yǎng)，條件為28℃和100rpm24小時，接著3500rpm離心；上清液過0.2μm網(wǎng)過濾。濾出物在預(yù)備了幾丁質(zhì)膠狀懸浮液(0.5％)的平板上進(jìn)行分析，并且添加至多0.8％的瓊脂糖以達(dá)到培養(yǎng)基凝膠化和保證多空性以利于蛋白質(zhì)擴(kuò)散。凝膠化后，打開直徑5mm的孔，向其中添加100μl從各種細(xì)菌菌株得到的濾出的上清液。每個平板進(jìn)行三次重復(fù)，并且在暗處28℃下培養(yǎng)。
從第48小時開始，在培養(yǎng)基中觀察到似暈圈的混濁，這證明幾丁質(zhì)的水解。在下表(表6)中，顯示了用不同的研究菌株的培養(yǎng)中產(chǎn)生的上清液培養(yǎng)，在不同的培養(yǎng)時間出現(xiàn)水解暈圈而得到的定性結(jié)果。
表6.水解暈圈的出現(xiàn)
+++指觀察到最大的水解暈圈，
++指中等水解暈圈，和
+指觀察到最小的水解暈圈。
兩種菌株(微代謝棒狀桿菌和微代謝冢村氏菌)均顯示幾丁質(zhì)水解暈圈，就象所用的陽性對照(粘質(zhì)沙雷氏菌)一樣，而大腸桿菌(陰性對照)不產(chǎn)生水解暈圈。
實(shí)施例4體外評價由微代謝棒狀桿菌C-924和微代謝冢村氏菌DSM 20162產(chǎn)生的硫化物和幾丁酶對寄生的肝片吸蟲(吸蟲)的作用
使用寄生肝片吸蟲的卵。卵直接采自預(yù)先貢獻(xiàn)出的被感染的牛的肝膽汁。將膽汁內(nèi)容物再懸浮于三倍體積的蒸餾水中并在28℃再保持2-3小時，以達(dá)到卵的沉淀。然后取出盡可能最大體積的上清液。沉淀物過71μm篩網(wǎng)過濾，從而將卵捕獲在篩網(wǎng)上。
從此時開始，在無菌條件下在垂直層流中進(jìn)行所有的操作，使用24孔組織培養(yǎng)平板。將帶肝片吸蟲卵的篩網(wǎng)置入0.5％醋酸洗必太溶液中處理3分鐘，接著用在無菌蒸餾水中稀釋10倍的LB培養(yǎng)基洗三次。消毒后，將卵從篩網(wǎng)上取下并小心地重新懸浮于無菌蒸餾水稀釋10倍的LB培養(yǎng)基溶液。用倒置Olympus顯微鏡計(jì)數(shù)和記錄活幼蟲以檢查最終的收集和消毒結(jié)果。還要觀察此階段的發(fā)育狀態(tài)的一致性。
在28℃預(yù)先體外設(shè)定條件下孵化此寄生吸蟲的卵大約15天；當(dāng)孵育期結(jié)束時有超過60％的卵孵化，就可認(rèn)為制備出了良好的樣本。
為展開實(shí)驗(yàn)，將大約100個已消毒的卵放入1ml稀釋10倍的LB培養(yǎng)基中。通過20個安全閥均勻引入的空氣體積應(yīng)能使空氣能穿過液體；因此使氣體與卵接觸。在所有五種處理中每個閥門是相同的(每個處理4個)。
在孵育的最后4天對肝片吸蟲卵進(jìn)行下列處理
1.對照處理向每個閥門添加1ml無幾丁酶的稀釋10倍的LB培養(yǎng)基，并使空氣通過閥門循環(huán)。
2.向每個閥門添加1ml無細(xì)菌細(xì)胞的分解幾丁質(zhì)上清液，該上清液產(chǎn)自微代謝棒狀桿菌C-924每毫升1010菌落形成單位(CFU/ml)的培養(yǎng)物。
3.向每個閥門添加1ml無細(xì)菌細(xì)胞的分解幾丁質(zhì)上清液，該上清液產(chǎn)自微代謝冢村氏菌DSM 20162 1010CFU/ml的培養(yǎng)物。
4.令由1010CFU/ml微代謝棒狀桿菌C-924連續(xù)培養(yǎng)產(chǎn)生的氣體流過閥門。
5.令由1010CFU/ml微代謝冢村氏菌DSM 20162連續(xù)培養(yǎng)產(chǎn)生的氣體流過閥門。
6.組合處理同時施用處理2和4。
7.同時處理同時施用處理3和5。
在實(shí)驗(yàn)開始后的第4天計(jì)數(shù)孵化的卵。就肝片吸蟲來說，由于其游動性，不可能計(jì)數(shù)幼蟲(纖毛幼蟲)；因此，通過顯微鏡進(jìn)行的觀察集中在卵上。不同處理的效果示于表7。這是每種處理的四次重復(fù)的平均值。相同的字母表示處理間缺乏顯著差異(p＜0.05)。
表7.處理效果(E)*
*效果是1減去孵化的相對頻數(shù)值的結(jié)果。Fr是每個處理中孵化的卵數(shù)(Ntto)與處理1中孵化的卵數(shù)(Nc)的比值
E＝1-Fr，其中Fr＝Ntto-Nc因此E＝1-Ntto/Nc
為測定處理6和7中的可能存在的協(xié)同作用，假定不排除上述處理中存在的作用(抗寄生物作用)。
對于此類型分析來說，預(yù)期效果(EE)等于由幾丁酶作用產(chǎn)生的效果(Eq)和硫化氫作用產(chǎn)生的效果(Esn、Esf和Esd)減去交叉效果(ei)(Sigarroa，A.1985.Biometría y dise
o experimental.1ra.Parte.Minist.Educación Sup.Ed.Pueblo y Educación.Cap.3.pag 69-107)。
EE＝Eq+Es-ei，其中ei＝Eq×Es
如果在結(jié)合兩種抗寄生物劑的處理中(處理6和7)的實(shí)驗(yàn)效果(E)大于那些處理的預(yù)期效果(EE)，則可確信當(dāng)在同一處理中同時施用時，就分解幾丁質(zhì)劑(幾丁酶)和硫化氫的抗寄生物活性來說存在協(xié)同作用。獲得的結(jié)果概述于表8。
表8.實(shí)驗(yàn)效果(E)和預(yù)期效果(EE)
在結(jié)合幾丁酶和硫化氫的處理中，實(shí)驗(yàn)效果(E)大于預(yù)期效果(EE)，這證明了就其殺線蟲活性來說，當(dāng)其同時作用時在這兩種化合物間存在協(xié)同作用。
實(shí)施例5產(chǎn)硫化氫并對一些細(xì)菌和真菌有分解幾丁質(zhì)活性的細(xì)菌菌株(微代謝棒狀桿菌C-924)的體外效果評價
使用下列真菌品種掌狀盤多毛孢、Alternaria tabacina、Sarocladium orizae、Pitium debaryanum；還使用下列細(xì)菌品種菊歐文氏桿菌、莢殼伯克霍爾德氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌ATCC 13880、枯草芽孢桿菌F1695和大腸桿菌ATCC 25922。
A)真菌測定。
測定微代謝棒狀桿菌C-924對這些真菌的相互作用掌狀盤多毛孢、Alternaria tabacina、Sarocladium orizae和Pitiumdebayianum。使用粘質(zhì)沙雷氏菌ATCC 13880作為殺真菌活性的陽性對照，大腸桿菌ATCC 25922作為殺真菌活性的陰性對照。采用常規(guī)的振搖和溫度條件對所有品種進(jìn)行24小時細(xì)菌培養(yǎng)。進(jìn)行必要的稀釋，讀取λ530nm吸光率以確保細(xì)胞濃度為109cfu/ml。將其放入含PDA培養(yǎng)基(瓊脂-馬鈴薯-葡萄糖)的培替氏培養(yǎng)皿中，用微生物接種環(huán)沿中線接種。培養(yǎng)皿在28℃孵育48小時，然后接種(平板含PDA培養(yǎng)基)取自不同的預(yù)先長滿的真菌菌株的直徑8mm盤狀物并放在平板表面上已接種細(xì)菌的中線的兩極。每種所研究真菌進(jìn)行三次重復(fù)并在28℃孵育10天。在實(shí)驗(yàn)開始的第五天開始讀取結(jié)果。
b)細(xì)菌測定。
研究微代謝棒狀桿菌C-924、大腸桿菌ATCC 25922和枯草芽孢桿菌F1695對這些細(xì)菌的相互作用菊歐文氏桿菌、莢殼伯克霍爾德氏菌。使用枯草芽孢桿菌F1695作為與其他細(xì)菌有拮抗作用的陽性對照，大腸桿菌ATCC 25922用作陰性對照。采用常規(guī)的振搖和溫度條件對所有品種進(jìn)行24小時細(xì)菌培養(yǎng)。進(jìn)行必要的稀釋，預(yù)先讀取λ530nm吸光率以確保細(xì)胞濃度為109cfu/ml。分別將5μl C-924滴加到LB培養(yǎng)基平板的三個不同位點(diǎn)，陽性對照為兩個不同位點(diǎn)，陰性對照為另外兩個不同位點(diǎn)。培養(yǎng)皿在28℃孵育48小時。然后用氯仿蒸氣處理3分鐘(使其失活并避免在之后的步驟中分散)，然后將平板半開地留在層流中，以除去多于的氣體。進(jìn)行菊歐文氏桿菌和莢殼伯克霍爾德氏菌的接種，先進(jìn)行各微生物的純培養(yǎng)，使在添加至多3毫升半固體LB培養(yǎng)基(0.1％工業(yè)級瓊脂No.3)后，能達(dá)到109cfu/ml細(xì)胞濃度的必要量。將混合物分散到含所研究菌株的平板上，然后在28℃孵育48小時，評價結(jié)果。
表9顯示在上述相互作用檢測中獲得的結(jié)果。
表9.相互作用測定獲得的結(jié)果。
+++觀察到強(qiáng)拮抗作用，生長停止并因C-924的作用形成暈圈。在真菌的情況下，典型的放射狀生長被抑制。
++C-924對微生物的中等拮抗作用。
+C-924對微生物的輕微拮抗作用。
-未觀察到C-924對微生物的拮抗作用。
如表9所示，微代謝棒狀桿菌C-924對真菌掌狀盤多毛孢、Alternaria tabacina和Sarocladium orizae有顯著的拮抗作用，上述真菌的特征在于其結(jié)構(gòu)中有高幾丁質(zhì)含量。觀察到硫化氫的活性只引起輕微的拮抗作用。就與所研究細(xì)菌的相互作用來說，在兩種致病菌(菊歐文氏桿菌和莢殼伯克霍爾德氏菌)中均觀察到拮抗作用，而在枯草芽孢桿菌的情況下未觀察到拮抗作用，因?yàn)槠涫菑霓卓蛊渌⑸锏耐寥乐蟹蛛x出的；因此對不利的環(huán)境因素會產(chǎn)生更強(qiáng)的抗性。
權(quán)利要求
1.一種農(nóng)用和獸用組合物，含至少一種分解幾丁質(zhì)劑或分解幾丁質(zhì)活性誘導(dǎo)劑，和硫化物或硫化物產(chǎn)生劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述分解幾丁質(zhì)劑是幾丁酶。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述分解幾丁質(zhì)是幾丁酶產(chǎn)生劑。
4.權(quán)利要求3的組合物，每克組合物含介于107菌落形成單位(CFU)和1012CFU之間的所述微生物。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述分解幾丁質(zhì)活性誘導(dǎo)劑是幾丁質(zhì)。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中的幾丁質(zhì)含量為1-50％。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述硫化物產(chǎn)生劑是微生物。
8.權(quán)利要求7的組合物，每克組合物含介于107菌落形成單位(CFU)和1012CFU之間的所述微生物。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述硫化物產(chǎn)生劑是化學(xué)試劑。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中每克組合物中硫化物的產(chǎn)量介于0.1mg/min和1.0mg/min之間。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中的分解幾丁質(zhì)劑和硫化物產(chǎn)生劑是微生物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11所述的組合物，用于防治寄生性動物線蟲。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中的寄生性動物線蟲是血矛線蟲屬、毛圓線蟲屬和網(wǎng)尾線蟲屬。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-11所述的組合物，用于防治植物寄生性線蟲。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中的植物寄生線蟲是根結(jié)線蟲屬和相似穿孔線蟲。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-11所述的組合物，用于防治植物和動物致病細(xì)菌。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中的致病細(xì)菌是歐文氏桿菌屬和伯克霍爾德氏菌屬。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-11所述的組合物，用于防治植物和動物致病真菌。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，其中的致病真菌是掌狀盤多毛孢、Alternaria tabacina、Sarocladium orizae。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-11所述的組合物，用于防治寄生吸蟲。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中的寄生吸蟲是肝片吸蟲。
22.根據(jù)上述權(quán)利要求所述的農(nóng)用和獸用組合物，與所述適宜載體如肥料、預(yù)填充土壤、包覆種子裝置、粉劑、顆粒劑、噴霧劑、懸浮液、液體或任何已知形式制成膠囊制劑用于防治寄生性蠕蟲和細(xì)菌及致病真菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及農(nóng)藥和抗寄生蟲藥組合物，用于防治侵襲植物和動物的害蟲、病害和寄生蟲。所述組合物包括來源于微生物或化合物的至少一種分解幾丁質(zhì)劑或分解幾丁質(zhì)活性誘導(dǎo)劑，和硫化物或硫化物產(chǎn)生劑，其中的來源于微生物或化合物的分解幾丁質(zhì)劑或分解幾丁質(zhì)活性誘導(dǎo)劑和硫化物或硫化物產(chǎn)生劑以遠(yuǎn)低于上述化合物單獨(dú)使用獲得有效控制時的用量同時施用。
文檔編號A01N25/02GK1484494SQ0182172
公開日2004年3月24日 申請日期2001年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月3日
發(fā)明者J·梅納, 坎波斯, E·皮門特爾, 巴斯克斯, A·T·埃爾南德斯, 加西亞, L·韋洛茲, 岡薩雷斯, M·馬林, 布魯佐斯, O·孔特, 阿爾貝托, M·多明戈, 普恩特, L·萊昂, 巴雷拉斯, M·普若爾, 費(fèi)雷羅, J·D·門瓊, 龐塞, C·博羅托, 諾德洛, 坎波斯 J 梅納, 加西亞 埃爾南德斯, 尥 諾德洛, 盤囟 巴斯克斯, 舳 費(fèi)雷羅, 遄 岡薩雷斯, 龐塞 門瓊, 鞲 普恩特 申請人:遺傳工程與生物技術(shù)中心